超聲波輔助酶提取結合高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法測定富硒蔬菜中硒形態(tài)

李倩,劉興勇,陳興連,羅蘭,尹本林,李新宇,杜麗娟*,王云美*

1(云南省農業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所,云南 昆明,650205) 2(云南省產品質量監(jiān)督檢驗研究院,云南 昆明,650223)

硒在碘甲狀腺原氨酸脫碘酶、谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還原蛋白酶等多種酶中發(fā)揮重要的生理作用,包括代謝重金屬、抗癌、抗氧化、增強免疫力等,是人體健康的關鍵元素和營養(yǎng)素[1-3]。人體對硒的需求量范圍不寬,攝入過多會硒中毒,攝入不足可引起腫瘤、心血管疾病、大骨節(jié)病、胰腺纖維化、關節(jié)炎、白內障等疾病[4-5]。硒的生物利用度和毒性不僅與硒的總量有關,還取決于硒的化學形態(tài)以及濃度[6-7],人體所需要的硒元素主要以有機硒存在,無機硒不易被人體吸收[8]。硒在我國分布不均衡,缺硒地區(qū)的人群面臨硒攝入不足的風險,此外,硒主要以無機硒的形態(tài)存在于土壤以及水中。面對以上難題,近年來富硒食品應運而生,其中富硒蔬菜產業(yè)快速發(fā)展,市場上出現(xiàn)了大量的富硒蔬菜,但富硒蔬菜質量參差不齊,存在以無機硒冒充有機硒的亂象,對富硒蔬菜中硒含量及形態(tài)鑒定迫在眉睫。

硒形態(tài)分析通常采用色譜法分離,原子光譜法檢測,而高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法[9-10](high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)具有檢出限低、分離能力好、分析精度高,線性范圍寬等特性現(xiàn)已成為測定硒形態(tài)的主要方法。目前,硒形態(tài)測定研究主要集中于谷物[11]、土壤[12]、水[13]、大米[14]等,多采用恒溫水浴酶提取,提取時間較長,且多采用原子熒光光譜法檢測,檢出限較高。超聲波輔助酶提取法能夠更好地破壞植物的細胞壁,有效分散被提取物,促進被提取物與蛋白質、纖維素等大分子分離,現(xiàn)在利用超聲波輔助酶提取法結合HPLC-ICP-MS檢測富硒蔬菜的研究報道仍較少。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

Ultimate3000-iCAPRQ型超高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯(lián)用儀,美國Thermo Fisher公司;BINDER FD 115電熱鼓風干燥箱,美國BINDER公司;KQ-500E超聲波清洗器,昆山市超聲儀器公司;SHA-BA型水浴恒溫振蕩器,江蘇科析儀器有限公司;GL-88B型旋渦混合器,江蘇海門市英林貝爾儀器制造有限公司;SWT 2240電子天平(感量為0.1 mg),北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試樣處理

將樣品用蒸餾水清洗,冷凍干燥后使用粉碎機將樣品粉碎,過100目篩,收集備用。

1.3.2 樣品的提取

稱取約0.2 g外源硒處理蔬菜樣品于10 mL塑料離心管中,加入4 mg蛋白酶XIV,加入5 mL水(氨水調節(jié)pH值為7.5),在37 ℃超聲波提取80 min,高速離心10 min,取下層清液,過0.25 μm水相濾膜,上機測定。

1.3.3 標準溶液的配制

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

Hamilton PRP-X100色譜柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);淋洗液:25 mmol/L檸檬酸溶液(pH 6.5);洗脫方式:等度洗脫;流速:1 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:50 μL;洗脫時間:10 min。

1.4.2 ICP-MS 工作條件

射頻功率1 548 W;霧化室溫度2 ℃;載氣流量0.5 L/min;輔助氣流量0.1 L/min;載氣:高純氬氣;采樣深度:8.0 mm。

2 結果與分析

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取方式的影響

朱羽莊等[16]在測定海產品中硒形態(tài)時在50 ℃、180 r/min的條件下酶解12 h,王欣等[17]在測定富硒食品也是在恒溫搖床上酶解提取7 h,提取時間較長,而MOREDA-PIEIRO等[18]發(fā)現(xiàn)采用超聲波酶解提取方法可以縮短提取時間。硒形態(tài)提取的關鍵在于酶,但酶提取時間較長,超聲波產生的空化作用可以增強酶與細胞基質之間的碰撞,從而改善酶與底物的相互作用,可以縮短提取時間。本文對2種提取方式進行了實驗對比,結果如圖1所示,從結果看出2種提取方式對富硒蔬菜的提取結果相差不大,但恒溫振蕩酶解提取耗時較長,超聲波輔助酶提取縮短了提取時間,所以對于蔬菜樣品采用超聲波輔助酶提取效果最佳。

圖1 不同提取方式對比圖Fig.1 The contrast of different extract methods

2.1.2 提取酶種類的影響

硒在生物體中主要以有機硒存在,與蛋白質、多肽等大分子結合在一起,張澤洲等[19]報道采用酶解的方法提取效率更高。酶作為一種催化劑,具有活性位點,但不同的酶活性位點不同,基質不同的樣品,結合點也不同,所以提取能力存在差異。本文分別考察了蛋白酶XIV、木瓜蛋白酶對提取結果的影響,從圖2中可以看出不同蛋白酶對SeMet的提取影響較大,當使用蛋白酶XIV時大大增加了SeMet的提取效率,所以選擇蛋白酶XIV作為提取酶。朱羽莊等[16]發(fā)現(xiàn)使用木瓜蛋白酶和蛋白酶XIV在提取海產品中硒形態(tài)效率相差不大,此處提取差異較大的原因可能是所用木瓜蛋白酶的酶活力較低。由于蛋白酶XIV的最適溫度在37 ℃,所以樣品提取溫度為37 ℃。

圖2 不同提取酶對比圖Fig.2 The contrast of different extraction protease

2.1.3 蛋白酶XIV用量的影響

圖3 蛋白酶XIV用量對提取結果的影響Fig.3 Effect of the amount of protease XIV on extraction results

2.1.4 提取時間的影響

2.1.5 提取液pH的影響

提取液的pH值對提取效率也會有影響,因為pH影響蛋白酶的活性,而蛋白酶的活性影響著與底物的相互作用,從而對提取結果產生影響。試驗考察了提取液pH對提取結果的影響,分別用氨水調節(jié)pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的提取液,其結果如圖5所示,隨著pH從6.0升至7.5,提取含量逐漸升高,而pH從7.5到9.0,提取含量又逐漸降低,所以最佳pH值為7.5,而7.5剛好與蛋白酶XIV的最佳pH值接近。

圖4 提取時間對提取結果的影響Fig.4 Effect of the extraction time on extraction results

圖5 提取液pH對提取結果的影響Fig.5 Effect of pH of extraction solution on extraction results

2.2 淋洗液條件的優(yōu)化

2.2.1 淋洗液濃度的影響

圖6 不同淋洗液濃度下標準樣品色譜圖Fig.6 Chromatograms of standard samples in different concentration of eluent

2.2.2 淋洗液pH的影響

圖7 不同pH淋洗液下標準樣品色譜圖Fig.7 Chromatograms of standard samples in different pH of eluent

2.2.3 淋洗液中甲醇添加劑的影響

圖8 淋洗液中添加甲醇的標準樣品色譜圖Fig.8 Chromatograms of standard samples in different additions of methanol

2.3 標準曲線與檢出限

表1 五種硒形態(tài)的線性測試結果Table 1 Linear test results of 5 kinds of selenium species

2.4 回收率和精密度

稱取0.2 g硒處理菠菜葉,定量加入不同水平標準品,每個梯度6個平行樣品,采用優(yōu)化后方法處理后測定其加標回收率。結果表明,平均回收率在96.3%～104.2%,相對標準偏差在7.6%以下,符合定量分析的要求,結果見表2。與倪張林等[21]測定富硒蔬菜的方法相比,其回收率為80.1～99.2%,相較而言,本研究回收率更高。

2.5 實際樣品的測定

表3 富硒蔬菜和普通蔬菜硒形態(tài)測定結果 單位:mg/kg

3 結論