灰葡萄孢霉菌產(chǎn)脫落酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

張俊,左建英,景飛江,陳鋼

1(南昌大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌,330047) 2(四川龍蟒福生科技有限責(zé)任公司,四川 眉山,620020)

脫落酸(S-abscisic acid,S-ABA),一種重要的植物生長調(diào)節(jié)劑,其與生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯共同組成五大植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑[1-2],其主要功能為提高植物抗病性、抗寒性、抗旱性,加速營養(yǎng)物質(zhì)積累,提高作物逆境下的抵御和修復(fù)能力,顯著改善植物品質(zhì)、提高苗木成活率、增加水稻分蘗和提高水稻抗性、?；ū９鸞1]、還具有促進(jìn)種子和果實貯存蛋白與糖分的積累,提高農(nóng)作物與水果的品質(zhì)以及控制花芽分化,調(diào)節(jié)花期的應(yīng)用[3],現(xiàn)主要生產(chǎn)方式為發(fā)酵生產(chǎn),產(chǎn)生菌為Botrytiscinerea[4]。

液態(tài)發(fā)酵過程中,Botrytiscinerea菌體形態(tài)會因多種外部工藝條件以及營養(yǎng)條件變化,出現(xiàn)絮狀聚集體、菌絲團(tuán)塊、菌絲球等表現(xiàn)(圖1),而這些表現(xiàn)直接影響了發(fā)酵液物質(zhì)、氧傳質(zhì)以及黏度、流動情況等特性[5-6]。目前關(guān)于S-ABA發(fā)酵生產(chǎn)相關(guān)的文獻(xiàn)主要針對于高產(chǎn)菌株篩選[7-8]、培養(yǎng)基優(yōu)化[9]、發(fā)酵條件優(yōu)化[10-11]方面,而關(guān)于菌體形態(tài)與S-ABA產(chǎn)量研究較少。以往的針對其他絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵研究中,通過考察基因表達(dá)[12-13]、調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速[14]、調(diào)整碳氮比[15]、增加微顆粒[16]來進(jìn)行菌體形態(tài)控制,對次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有重要意義[17-18]。本研究結(jié)合真菌形態(tài)工程理論,采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化發(fā)酵工藝及相關(guān)參數(shù),控制發(fā)酵過程中的菌體形態(tài),從而達(dá)到提高S-ABA產(chǎn)量,為Botrytiscinerea菌體工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)S-ABA提供依據(jù)。

a-絮狀聚集體;b-菌絲團(tuán)塊;c-菌絲球圖1 Botrytis cinerea液態(tài)發(fā)酵菌體的形態(tài)Fig.1 Morphology of Botrytis cinerea liquid fermentation cell

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本文實驗中所使用的Botrytiscinerea菌株由龍蟒福生科技有限公司保存,由中科院成都生物研究所譚紅教授誘變篩選的高產(chǎn)Botrytiscinerea菌株。

1.1.2 試劑

大豆蛋白粉、SD-300分散型,臨沂山松生物制品有限公司;葡萄糖、玉米蛋白粉、玉米淀粉、食品級玉米油,山東西王糖業(yè)有限公司;甘油(食品級),中孚油脂(廣州)集團(tuán)有限公司;瓊脂粉(分析純),天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司、泡敵、GPE-2000,江蘇海安石油化工廠;ZnSO4、MnSO4、FeSO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4,均分析純試劑,西隴科學(xué)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基取馬鈴薯200 g,去皮切成小塊,用蒸餾水煮沸20 min,8層紗布過濾,加入20 g葡萄糖,定容至1 L。滅菌參數(shù)為121 ℃,20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉15、玉米油1、甘油5.5、玉米蛋白粉2、K2HPO40.6、MnSO40.01、FeSO40.01、ZnSO40.01 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204分析天平,瑞士梅特勒托利多;SW-CJ-2F超凈工作臺,中國蘇州凈化;G80F23CN3P-BM1(G0)微波爐,中國格蘭仕電器;TG16-WS離心機(jī),中國湘儀;DGG-9240AD鼓風(fēng)干燥箱,中國上海齊欣;BSD-YX3600恒溫?fù)u床,中國上海博迅;LX-B50L高壓蒸汽滅菌鍋,中國合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;CX23顯微鏡,日本奧林巴斯;LC20高效液相色譜系統(tǒng),日本島津;15L-50L×2小試發(fā)酵系統(tǒng),中國上海國強(qiáng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子活化:取保存于-64 ℃的菌種接種于PDA平板,28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。將保存的菌種接種到茄瓶培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)24～48 h,觀察菌落形態(tài)。用接種環(huán)挑取一環(huán)茄瓶中的菌種,接種到50 mL/250 mL種子培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵培養(yǎng)(搖瓶):使用滅菌后的移液器吸取2 mL接種發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶(帶擋板),培養(yǎng)基100 mL/500 mL,28 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)20 d。

發(fā)酵培養(yǎng)(發(fā)酵罐):以0.1%的接種量(10 mL搖瓶種子液)接種到發(fā)酵罐種子培養(yǎng)液,發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為 50 L發(fā)酵罐裝入 16 L 培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)速200～600 r/min,通氣量 1～3 vvm,27 ℃下培養(yǎng) 18 d。

1.3.2 分析方法

菌體生長量測定方法:干重法測定菌體生長量,量取10 mL發(fā)酵液入15 mL離心管,稱取10 mL發(fā)酵液重量,離心條件,使用水平轉(zhuǎn)子,10 000 r/min,離心10 min。離心完成后傾倒上清液,蒸餾水沖洗菌體,再進(jìn)行離心,沖洗程序重復(fù)2次。將離心管放入60 ℃鼓風(fēng)干燥箱,烘干48 h,稱重得到菌體干重。

菌體形態(tài)測定法:菌體形態(tài)采用拍照結(jié)合顯微鏡標(biāo)尺測量菌體形態(tài),唐文俊等[19]在建立黑曲霉發(fā)酵過程中菌體形態(tài)的分析方法時,使用顯微測微尺預(yù)先確定拍攝照片的像素點與實際長度比例,再使用軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。鑒于公司現(xiàn)有條件,調(diào)整形態(tài)分析方法如下:對發(fā)酵液進(jìn)行攪拌混合,吸取3 mL滴入盛有20 mL生理鹽水的培養(yǎng)皿,分散菌體,吸取分散的菌體滴加在顯微鏡標(biāo)尺合適的量程內(nèi),進(jìn)行顯微觀察,拍照并記錄菌絲形態(tài)、尺寸數(shù)據(jù)。每一批發(fā)酵液重復(fù)10個處理,對數(shù)據(jù)進(jìn)行平均得到發(fā)酵液體平均尺寸。

S-ABA含量檢測制樣方法:取適量發(fā)酵液,5 000 r/min離心5 min,吸取上清液,超純水稀釋10倍,通過0.22 μm水系膜直接進(jìn)樣檢測。

S-ABA含量檢測液相條件:S-ABA為胞內(nèi)產(chǎn)生釋放至發(fā)酵液,參考姚晨濤等[20]對高效液相色譜法測定S-ABA及對其設(shè)計濃度驗證實驗中的方法,采用HPLC系統(tǒng),包含脫氣機(jī)(DGU-20A3R),二元泵(LC-20AT),自動進(jìn)樣器(SIL-20A),柱溫箱(CTO-10AS vp),UV/VIS檢測器(SPD-20A),使用Eclipse XDB-C18 色譜柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm),進(jìn)樣量:10 μL,以V(甲醇)∶V(水)=1∶1(用磷酸調(diào)pH值至3)為流動相,在254 nm處對試樣中的S-ABA進(jìn)行高效液相色譜分離和測定。柱溫30 ℃,流動相流速1.5 mL/min。

Plackett-Burman試驗設(shè)計:在單因素實驗基礎(chǔ)上,以S-ABA產(chǎn)量為主要響應(yīng)值,菌絲球直徑為次要響應(yīng)值,對攪拌強(qiáng)度、初始pH、CaCO3添加量、接種量、通氣量以及碳氮比6個影響因素進(jìn)行評價,設(shè)計Plackett-Burman試驗,篩選出主效應(yīng)因素,每個因素取最低(-1)和最高(1)兩個水平,共12組實驗,試驗因素和水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素水平表Table 1 Factor level table for Plackett-Burman experimental design

實驗中將6個因素進(jìn)行全面考察,實驗次數(shù)n=12的實驗設(shè)計,A、B、C、D、E、F分別代表碳氮比、初始pH、CaCO3添加量、接種量、通氣量以及攪拌強(qiáng)度6個影響因素,每個因素取最低最高兩個水平。

響應(yīng)面分析:以Plackett-Burman試驗結(jié)果為基礎(chǔ),進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計,對實驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析、誤差分析并求得最優(yōu)值,響應(yīng)面分析結(jié)果,繪制響應(yīng)面分析圖,根據(jù)結(jié)果確定最佳發(fā)酵條件。用響應(yīng)面分析所得的最佳發(fā)酵工藝條件進(jìn)行3個批次平行實驗,結(jié)果取平均值,驗證所得的數(shù)學(xué)模型可靠性,得到最優(yōu)發(fā)酵工藝結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2021、Design Expert 11處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析,GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮比對Botrytis cinerea菌體形態(tài)和產(chǎn)酸的影響

由表2可知,S-ABA產(chǎn)量隨著碳氮比變化而變化,最高產(chǎn)量出現(xiàn)在碳氮比為25,達(dá)到1 218 mg/L,較CK(均值964.33 mg/L)提高26.3%,后隨著碳氮比增高而降低,說明在適合的碳氮比條件下,可以有效提高BotrytiscinereaS-ABA產(chǎn)量,但過高的碳氮比會抑制S-ABA的合成,主要原因可能為底物抑制導(dǎo)致。同時,菌絲在液態(tài)發(fā)酵條件下菌體交聯(lián)成團(tuán),緊密纏繞形成核區(qū),更高的碳氮比會使核區(qū)增大,較大的核區(qū)會影響營養(yǎng)物質(zhì)及溶解氧對核區(qū)內(nèi)部菌絲體的供應(yīng),影響菌絲代謝,最終造成S-ABA產(chǎn)量差異,因此綜合以上各參數(shù),選擇碳氮比25為最佳的Botrytiscinerea發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比條件。

表2 不同碳氮比對Botrytis cinerea形態(tài)和發(fā)酵結(jié)果的影響Table 2 Effects of different C/N ratios on morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.2 不同pH對Botrytis cinerea菌體形態(tài)和產(chǎn)酸的影響

由表3可知,隨著pH的逐漸升高,S-ABA產(chǎn)量、發(fā)酵最終pH、雜質(zhì)含量及發(fā)酵液干重均有不同的表現(xiàn),發(fā)酵液中最終pH隨初始pH增大而增大,說明初始pH會影響整體發(fā)酵過程的酸堿平衡,因為碳源代謝會產(chǎn)生有機(jī)酸,使整體發(fā)酵體系偏酸性。發(fā)酵液干重方面,pH 4平均值5.33 g/10 mL,pH 7為5.36 g/10 mL,說明初始pH的變化對發(fā)酵液干重?zé)o明顯影響,即發(fā)酵液初始pH對生長量影響較小;S-ABA產(chǎn)量方面,最高產(chǎn)量出現(xiàn)在pH 5.5,達(dá)到1 060.33 mg/L,較CK(均值989.67 mg/L)提高7.14%,后隨著pH增高而先升高后降低,最低值為pH 7,均值為789.33 mg/L,說明在適合的pH條件下,可以有效提高Botrytiscinerea合成S-ABA產(chǎn)量,但過高或者過低的pH會產(chǎn)生抑制,主要原因可能為S-ABA的相關(guān)合成酶在pH值為5.5左右時有較好活性。菌絲體隨pH的增長,尺寸先增大后減小,菌絲均較為緊密且表面光滑。說明在合適的pH條件下能形成適當(dāng)松散的結(jié)構(gòu),有助于發(fā)酵液與菌絲球內(nèi)部菌絲的物質(zhì)、空氣交換,利于產(chǎn)量的提高。因此綜合以上各參數(shù),選擇pH值為5.5最佳的Botrytiscinerea發(fā)酵培養(yǎng)基pH條件。

表3 不同pH對Botrytis cinerea形態(tài)和發(fā)酵結(jié)果的影響Table 3 Effects of different pH on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.3 不同CaCO3濃度對Botrytis cinerea菌體形態(tài)和產(chǎn)酸的影響

如表4所示,發(fā)酵液pH隨著CaCO3濃度的增加而增加(CaCO3添加量為50、60、70、80、90、100 g/L,分別以CaCO31～CaCO35代表),原因是CaCO3對發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸有中和作用,影響發(fā)酵液pH變化;發(fā)酵液干重方面, CaCO31平均值5.31 g/10 mL,CaCO35為5.98 g/10 mL,干重隨CaCO3增加而增加,原因是CaCO3不參與Botrytiscinerea發(fā)酵過程的生理活動;S-ABA產(chǎn)量方面,最高產(chǎn)量出現(xiàn)在CK組,達(dá)到978.33 mg/L,后隨著CaCO3增加逐漸降低,最低值為CaCO35,均值為185.33 mg/L,說明在添加CaCO3條件下,對Botrytiscinerea產(chǎn)S-ABA有不利的影響,結(jié)合最佳pH搖瓶結(jié)果,最佳pH條件為5.5,而添加CaCO3條件下會影響發(fā)酵液pH變化,不利于S-ABA的合成。同時,隨著CaCO3含量的增加,菌絲球趨向于形成更小更不規(guī)則的梭形,菌絲球緊實,邊緣粗糙,部分黏著CaCO3顆粒。分析認(rèn)為,微顆粒雖然不參與菌體生長,但會增加菌體在發(fā)酵培養(yǎng)基中碰撞的概率,菌絲以CaCO3顆粒為核心形成菌絲球,密度大結(jié)構(gòu)緊實,邊緣菌絲易與其他菌絲球互相纏繞、包裹形成多個核心,宏觀表現(xiàn)為不規(guī)則或梭形,不利于S-ABA合成。因此綜合以上各參數(shù),選擇不在培養(yǎng)基中增加CaCO3。

表4 CaCO3濃度對Botrytis cinerea形態(tài)和發(fā)酵結(jié)果的影響Table 4 Effects of CaCO3 concentration on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.4 接種量對Botrytis cinerea菌體形態(tài)和產(chǎn)酸的影響

在搖瓶實驗基礎(chǔ)上,總結(jié)適用于S-ABA發(fā)酵的碳氮比、固態(tài)載體添加量及最適pH,在50 L小試罐水平對接種量、通氣比、攪拌轉(zhuǎn)速條件。

根據(jù)統(tǒng)計,發(fā)酵12 d之前S-ABA積累量與接種量大小正相關(guān),如圖2所示,原因為接種量多,菌體數(shù)量大,S-ABA積累量相對更高;12 d之后,接種量10%罐與12.5%接種量罐S-ABA積累量相當(dāng),至發(fā)酵結(jié)束均保持較高的日增量,發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值6 938 mg/L。菌體形態(tài)方面,除10%接種量外,其他的接種量條件菌絲球尺寸波動較大, 10%接種量菌絲球保持1～1.2 mm,變化較小。因此綜合以上表現(xiàn),選擇發(fā)酵最佳接種量為10%。

a-接種量對菌絲球尺寸的影響;b-接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響圖2 接種量對Botrytis cinerea形態(tài)和發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.2 Effects of inoculation amount on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.5 通氣量對Botrytis cinerea菌體形態(tài)和產(chǎn)酸的影響

根據(jù)通氣量實驗,S-ABA的積累伴隨著通氣量的增長而增長,如圖3所示。最低為0.5 vvm:4 479 mg/L,最高為3 vvm:7 013 mg/L。核算發(fā)酵液蒸騰損失,最高S-ABA產(chǎn)量為1 vvm:6 719.68 mg/L;伴隨著通氣比增加,菌體趨向于形成顆粒更小的菌絲球,結(jié)構(gòu)致密,表面光滑,最小為通氣量3 vvm,直徑0.4 mm;而1 vvm發(fā)酵液菌絲球尺寸維持0.9～1.2 mm,結(jié)構(gòu)相對疏松,有助于物質(zhì)與氧氣對菌絲球內(nèi)部的擴(kuò)散。

在此實驗基礎(chǔ)上,可以確定最佳通氣比為1 vvm。

a-通氣量對菌絲球尺寸的影響;b-通氣量對發(fā)酵結(jié)果的影響圖3 通氣量對Botrytis cinerea形態(tài)和發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.3 Effects of ventilation capacity on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.6 攪拌對Botrytis cinerea菌體形態(tài)和產(chǎn)酸的影響

在轉(zhuǎn)速實驗中,S-ABA的產(chǎn)量隨著轉(zhuǎn)速增高而先升高后降低,如圖4所示,最高出現(xiàn)在500 r/min,達(dá)到6 853 mg/L,較最低轉(zhuǎn)速200 r/min提高56.96%。最低值為200 r/min,均值為4 366 mg/L, 700 r/min條件下產(chǎn)量低于500 r/min,說明合適的攪拌條件對S-ABA合成是有利,但過高或者過低的攪拌會抑制S-ABA的合成;在菌絲球尺寸方面,350 r/min轉(zhuǎn)速條件下菌絲球尺寸最大,為2.0 mm左右,最低為700、0.5、500 r/min轉(zhuǎn)速條件下菌絲球尺寸維持在0.8～1 mm,尺寸適中、體積穩(wěn)定,菌絲形成與破壞達(dá)到一定的平衡,合成S-ABA在營養(yǎng)條件、通氣條件以及結(jié)構(gòu)、菌絲球表面條件均處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)。綜合以上表現(xiàn),500 r/min為最適合的攪拌轉(zhuǎn)速條件。

a-轉(zhuǎn)速對菌絲球尺寸的影響;b-轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)量的影響圖4 攪拌強(qiáng)度對Botrytis cinerea形態(tài)和發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.4 Effects of agitation intensity on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.7 S-ABA發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實驗基礎(chǔ)上,以攪拌強(qiáng)度(A)、初始pH(B);CaCO3添加量(C)、接種量(D)、通氣量(E)以及碳氮比(F)為自變量,以S-ABA產(chǎn)量為主要響應(yīng)值,菌絲球直徑為次要響應(yīng)值,對6個影響因素進(jìn)行評價,進(jìn)行Plackett-Burman試驗。根據(jù)實驗結(jié)果,選取對S-ABA產(chǎn)量、菌絲球直徑顯著性影響的因素為攪拌轉(zhuǎn)速、接種量和初始pH,進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken 中心組合原理進(jìn)行的響應(yīng)面實驗,實驗設(shè)計方案與結(jié)果見表5、表6。

2.8 響應(yīng)面試驗回歸方程的建立及方差分析

利用Design-Expert11軟件對試驗設(shè)計的結(jié)果進(jìn)行多項式回歸擬合分析,得到S-ABA產(chǎn)量回歸方程:R=7 028.37-332.64A-774.03B-255.84C-350.51AB-1 178.82AC-815.74BC-1 691.35A2-1 535.5B2-2 510.53C2,根據(jù)表7中有關(guān)于回歸模型的方差分析,可以發(fā)現(xiàn)此數(shù)學(xué)模型的P<0.000 1,表示該模型的回歸性極顯著,失擬項P=>0.1,不顯著,說明該模型的擬合性好,相關(guān)系數(shù)R2=0.983 9,該模型可靠性高,可用于Botrytis cinerea產(chǎn)S-ABA的優(yōu)化,根據(jù)F值可知,各個因素對S-ABA產(chǎn)量的影響大小順序是:接種量>攪拌轉(zhuǎn)速>初始pH。

表5 Box-Behnken實驗設(shè)計的因素水平表和編碼Table 5 Factor level table and coding for Box-Behnken experimental design

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Response surface experimental design and results

表7 S-ABA的回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance in the regression model of S-ABA

對另一響應(yīng)值菌絲球尺寸,根據(jù)試驗設(shè)計的結(jié)果進(jìn)行多項式回歸擬合分析,得到菌絲球直徑的回歸方程:R=0.863 2-0.398A+0.120 2B-0.029 5C+0.143 4AB+0.110 8AC+0.021 1BC-0.107 8A2+0.198 3B2+0.148 6C2,根據(jù)表8關(guān)于回歸模型的方差分析表現(xiàn),可以發(fā)現(xiàn)此數(shù)學(xué)模型類似于S-ABA產(chǎn)量回歸模型,在影響因子顯著性上與S-ABA積累量不同,為攪拌轉(zhuǎn)速>接種量>初始pH,此數(shù)學(xué)模型的P<0.000 1,表示該模型的回歸性極顯著,失擬項P=>0.1,不顯著,說明該模型的擬合性好,相關(guān)系數(shù)R2=0.983,該模型可靠性高,可用于Botrytiscinerea菌體形態(tài)的優(yōu)化。

響應(yīng)面的等高線、坡度以及坐標(biāo)軸的交點在響應(yīng)面實驗中反映了試驗的各個因子對結(jié)果響應(yīng)值的影響的大小,由圖5可知,攪拌強(qiáng)度、初始pH以及接種量交互作用顯著,影響S-ABA產(chǎn)量最顯著的因素是接種量的大小,表現(xiàn)為響應(yīng)面弧度變化最大,其次是攪拌強(qiáng)度,且攪拌強(qiáng)度與初始pH交互作用、接種量與初始pH交互作用影響也極顯著。同時,影響菌絲球形態(tài)的因素交互作用表現(xiàn)如圖6所示。

表8 菌絲球直徑的回歸模型的方差分析Table 8 Analysis of variance for regression models of filamentous sphere diameter

a-攪拌轉(zhuǎn)速與接種量交互作用對S-ABA產(chǎn)量的影響;b-攪拌轉(zhuǎn)速與初始pH交互作用對S-ABA產(chǎn)量的影響; c-接種量與初始pH交互作用對S-ABA產(chǎn)量的影響圖5 各因素的交互作用對S-ABA產(chǎn)量的影響Fig.5 The impact of the interaction of various factors on the yield of S-ABA

a-攪拌轉(zhuǎn)速與接種量交互作用對菌絲球直徑的影響;b-攪拌轉(zhuǎn)速與初始pH交互作用對菌絲球直徑的影響; c-接種量與初始pH交互作用對菌絲球直徑的影響圖6 各因素的交互作用對菌絲球直徑的影響Fig.6 The influence of the interaction of various factors on the diameter of filamentous spheres

2.9 響應(yīng)面驗證試驗

利用已經(jīng)建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測S-ABA的最佳工藝條件為攪拌強(qiáng)度535.819 r/min;初始pH=5.127 11;接種量10.777 9%,考慮到實際的操作,修正以上工藝參數(shù)如下,攪拌強(qiáng)度535 r/min;初始pH 5.1;接種量11%。

在此條件下3次重復(fù)實驗結(jié)果為:S-ABA產(chǎn)量平均值7 189.52 mg/L,菌絲球直徑0.95 mm,與理論預(yù)測值產(chǎn)量7 105.3 mg/L、菌絲球尺寸0.913 875 mm,偏差較小,說明該模型能夠較好地預(yù)測S-ABA的發(fā)酵結(jié)果,同時相對于單因素實驗最高產(chǎn)量6 938 mg/L提升3.63%,與原工藝相比(平均產(chǎn)量6 597.82 mg/L),提升了約8.23%,與福生公司生產(chǎn)平均產(chǎn)量6 400～6 600 mg/L相比,提升11.5%。

3 結(jié)論

通過單因素實驗、Plackett-Burman試驗,分別以S-ABA積累量、菌絲球直徑作為響應(yīng)值,在6種變量中確定了攪拌強(qiáng)度、接種量、初始pH為最主要的影響因素,后續(xù)通過3因素3水平的Box-Behnken實驗進(jìn)行響應(yīng)面分析,明確了對S-ABA產(chǎn)量的影響大小順序是:接種量>攪拌轉(zhuǎn)速>初始pH,而在對菌絲球形態(tài)影響因子顯著性攪拌轉(zhuǎn)速>接種量>初始pH,各因素交互性上,針對S-ABA的產(chǎn)量,攪拌強(qiáng)度與初始pH交互作用、接種量與初始pH交互作用影響極顯著,同時針對菌絲球尺寸變化,攪拌強(qiáng)度與接種量的符合作用影響極顯著。

通過響應(yīng)面實驗得到最佳工藝參數(shù):攪拌強(qiáng)度535 r/min;初始pH 5.1;接種量:11%。在此條件下3次重復(fù)實驗結(jié)果為:S-ABA產(chǎn)量平均值7 189.52 mg/L,菌絲球直徑0.95 mm,與理論預(yù)測值產(chǎn)量7 105.3 mg/L、菌絲球尺寸0.913 875 mm,偏差較小,說明該模型能夠較好地預(yù)測S-ABA的發(fā)酵結(jié)果,且平均實驗產(chǎn)量與原工藝相比(平均產(chǎn)量6 597.82 mg/L),提升了約8.23%,與福生公司生產(chǎn)平均產(chǎn)量6 400～6 600 mg/L相比,提升11.5%,工藝優(yōu)化效果明顯。