小麥肽及其與大豆肽、豌豆肽復(fù)配肽的體外組合對TNF-α刺激C2C12骨骼肌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

程改平,李明亮,劉婧,徐淼,李可,閆九明,任瑋,秦修遠(yuǎn)

1(四川大學(xué)華西醫(yī)院,四川 成都,610041)2(江南大學(xué),糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 3(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)4(北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京,100015)

很多研究已經(jīng)證實,小分子的食源性低聚肽具有比整蛋白、氨基酸和分子質(zhì)量較大的多肽更好的吸收特性,且具有一定的生理功能[1]。小麥肽、大豆肽和豌豆肽分別是以小麥蛋白、大豆分離蛋白、豌豆蛋白為原料經(jīng)過生物酶水解獲得的小分子低聚肽。

不同的實驗證實了小麥肽、大豆肽、豌豆肽在運(yùn)動營養(yǎng)方面都具有積極作用。金振濤等[2]通過高效液相色譜法測定了小麥肽中谷氨酰胺含量達(dá)到了(23.54±0.49)%,而谷氨酰胺已被證實能夠促進(jìn)在上骨骼肌的肌纖維中肌結(jié)蛋白desmin的合成,具有促進(jìn)運(yùn)動性肌肉微損傷的修復(fù)作用[3]。潘興昌等[4]對過度訓(xùn)練的散打運(yùn)動員進(jìn)行了小麥肽的干預(yù),發(fā)現(xiàn)小麥肽能夠通過減輕因運(yùn)動訓(xùn)練引起的的血睪酮降低和血皮質(zhì)醇含量增加,有效減輕握力降低、反應(yīng)時延長和骨骼肌損傷,促進(jìn)運(yùn)動性疲勞的恢復(fù),對于過度訓(xùn)練的發(fā)生有一定預(yù)防作用。其中對于骨骼肌的保護(hù)作用,ZHENG等[5]從清除自由基的角度也得到了相似的研究結(jié)論。FUSHIKI等[6]證明了大豆肽可以輔助大鼠運(yùn)動過程中肌肉的增長。魏源[7]通過大鼠實驗發(fā)現(xiàn)大豆肽能夠抑制離心運(yùn)動引起的骨骼肌組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶含量的升高,且比大豆蛋白能夠更顯著地減輕骨骼肌組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化[7]。李明亮等[8]也通過小鼠力竭游泳實驗發(fā)現(xiàn)了大豆肽和小麥肽的復(fù)配能夠協(xié)同增效,能夠通過提高小鼠自身的抗氧化能力抑制生物膜的脂質(zhì)過氧化,來緩解骨骼肌的損傷。豌豆肽是近年來開發(fā)的一款新原料肽,在緩解胰島素抵抗[9]、增強(qiáng)免疫力[10]、抑制ACE酶活性[11-12]等方面均已見報道。豌豆肽來源于豌豆蛋白,豌豆蛋白的氨基酸組成均衡,符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)模式,優(yōu)于大豆蛋白。因此,豌豆肽對于運(yùn)動營養(yǎng)理論上也具有積極作用。目前,學(xué)界關(guān)于豌豆肽對于骨骼肌的作用的研究還鮮見,且多種生物活性肽復(fù)合的協(xié)同功能也少有研究。

因此,本研究建立TNF-α刺激模型,基于本實驗室前期研究已確立的大豆肽+豌豆肽復(fù)配比例,探究小麥肽、大豆肽、豌豆肽三者復(fù)合物對小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12的影響作用,通過肌源調(diào)控因子和相關(guān)肌球蛋白、泛素連接酶、雷帕霉素靶蛋白與其相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá),結(jié)合Akt/mTOR通路初探作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心;高糖培養(yǎng)基(DMEM),Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),GIBCO公司;雙抗、細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting Kit-8, CCK-8)法檢測試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α, TNF-α),Sigma公司;絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt,又稱作蛋白激酶B或protein kinase B)磷酸化Akt(p-Akt),哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、磷酸化m-TOR (p-mTOR)、成肌分化抗原(MyoGenic differentiation antigen, MyoD)、肌細(xì)胞生成素(MyoGenin, MyoG)、含三方基序63(tripartite motif containing 63 Gene, TRIM63),Proteintech公司;肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)、肌肉萎縮盒F基因(musle atrophy F-box, MAFbx),Santa Cruz Biotechnology, Inc.。小麥肽、大豆肽、豌豆肽,由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司饋贈。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜,新加坡ESCO公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱,Thermo Fisher Scientific公司;熒光酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;流式細(xì)胞儀,BD C6公司;SDS-PAGE電泳系統(tǒng),Bio-Rad公司;熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

C2C12細(xì)胞培養(yǎng)在含5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,生長培養(yǎng)基采用含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS和1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。細(xì)胞融合達(dá)80%左右時用0.25%(體積分?jǐn)?shù))胰酶進(jìn)行消化傳代,平均2～3 d傳代1次。

1.3.2 實驗分組

本實驗室前期實驗已確定大豆肽和豌豆肽的復(fù)配劑量為大豆肽∶豌豆肽=2∶1(質(zhì)量比,下同)。對數(shù)期生長的C2C12細(xì)胞的實驗分組情況如下:對照組,模型組,實驗組分為小麥肽組(XM),大豆肽+豌豆肽組(DD+WD),小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=1∶1組,小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=1∶2組,小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=1∶3組,小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=3∶1組,小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=2∶1組,共9組。

1.3.3 細(xì)胞活力檢測

C2C12細(xì)胞按照1×105/mL的濃度接種于96孔板中,將1.3.2節(jié)所述各實驗組設(shè)置的梯度配比設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為0、100、200、400、600、800 μg/mL,與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h,CCK-8法檢測細(xì)胞存活率,根據(jù)細(xì)胞存活率選擇最佳處理濃度。

1.3.4 誘導(dǎo)細(xì)胞分化

C2C12細(xì)胞按照5×105/mL的濃度接種于6孔板中,同時加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞培養(yǎng)1 d貼壁后,棄去DMEM完全培養(yǎng)基,加入分化培養(yǎng)基(含2%馬血清和1%雙抗的DMED高糖培養(yǎng)基),繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.5 TNF-α刺激模型建立

對照組的細(xì)胞不做任何處理,只加入分化培養(yǎng)基;模型組的細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中含有終質(zhì)量濃度為25 ng/mL的TNF-α;實驗組的細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中含有終質(zhì)量濃度為25 ng/mL的TNF-α和對應(yīng)劑量的肽樣品。細(xì)胞在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d,期間每天更換培養(yǎng)基并保證樣品相應(yīng)濃度。

1.3.6 Western Blot

收集6孔板細(xì)胞,裂解,提取細(xì)胞全蛋白用于Western Blot,分別檢測以下蛋白的表達(dá)水平:MyHC,MAFbx,TRIM63,MyoD,MyoG,Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2022統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示。采用Tukey′s Method進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各項試驗設(shè)置3～6次重復(fù)。本文圖中*代表與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05),#代表與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05);**代表與對照組相比差異極顯著(P<0.01),##代表與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞存活率檢測

用CCK-8法檢測小麥肽、大豆肽和豌豆肽復(fù)配物對C2C12細(xì)胞的存活率影響,以確定安全劑量范圍。由圖1可知,在肽質(zhì)量濃度為200 μg/mL和400 μg/mL時,肽處理不會對細(xì)胞存活率產(chǎn)生顯著影響;其余各配比處理組在各濃度時都不會對細(xì)胞存活率產(chǎn)生顯著影響。本實驗后續(xù)采取肽的終質(zhì)量濃度為200 μg/mL。

2.2 MyoD、MyoG和MyHC蛋白表達(dá)檢測

肌球蛋白重鏈(MyHC)是肌球蛋白的基本組成單位。MyoD和MyoG屬于肌源調(diào)控因子,MyoD是肌肉譜系的決定性調(diào)控因子,MyoG基因表達(dá)可以被MyoD激活,促進(jìn)肌肉干細(xì)胞分化。由圖2可知,經(jīng)TNF-α處理后,C2C12細(xì)胞中MyoD、MyoG和MyHC的蛋白表達(dá)量相比于對照組出現(xiàn)了不同程度的下降,尤其是肌球蛋白重鏈MyHC的表達(dá)水平與對照組相比顯著降低,這與陳靖陽等[13]研究H2O2刺激C2C12細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激引起的MyoD、MyoG基因表達(dá)下降趨勢一致;經(jīng)過肽樣品處理后,上述3種蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的升高,其中,XM∶DD+WD=1∶3處理組細(xì)胞中3種蛋白的表達(dá)量相比于模型組升高最為顯著。

a-XM;b-DD+WD;c-XM∶DD+WD=1∶1;d-XM∶DD+WD=1∶2;e-XM∶DD+WD=1∶3;f-XM∶DD+WD=3∶1;g-XM∶DD+WD=2∶1圖1 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率Fig.1 Cell survival rate measured by CCK-8 assay

a-MyHC;b-MyoD;c-MyoG圖2 MyoD、MyoG和MyHC蛋白條帶及灰度分析Fig.2 Protein band and gray analysis of MyoD、MyoG and MyHC

2.3 TRIM63和MAFbx蛋白表達(dá)檢測

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑[14]。蛋白質(zhì)先被泛素標(biāo)記,然后被蛋白酶體識別和降解。在幾乎所有類型的肌肉萎縮中,2種較重要的E3泛素連接酶:與骨骼肌蛋白降解肌肉相關(guān)的MAFbx[15]和參與骨骼肌萎縮的TRIM63(也稱為MuRF1)[16]都被誘導(dǎo)高表達(dá)。由圖3可知,在模型組中,2種蛋白的表達(dá)量相比于對照組都顯著升高,經(jīng)過肽樣品處理后,2種蛋白的表達(dá)水平開始出現(xiàn)下降。其中,以XM∶DD+WD為1∶3和2∶1兩個處理組細(xì)胞中2種蛋白的表達(dá)水平相比于模型組降低最為顯著。

2.4 Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR蛋白表達(dá)檢測

雷帕霉素靶蛋白mTOR是Akt下游重要底物之一,mTOR主要通過p70 s6k和4E-BP1 2條傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)蛋白的合成和分解,另外,Akt活化后也能抑制糖原合酶激酶3β(GSK3β)的活性,從而增加蛋白質(zhì)的合成,Akt-mTOR- P70 s6K和Akt-GSK3β通路是協(xié)同作用,共同促進(jìn)肌細(xì)胞的肥大效應(yīng)[17-18]。由圖4可以看出,模型組中Akt和mTOR的磷酸化水平相比于對照組顯著降低,而經(jīng)過肽樣品處理后2種蛋白的磷酸化水平出現(xiàn)了不同程度的升高,其中,以XM∶DD+WD=1∶3處理組細(xì)胞中2種蛋白的磷酸化水平相比于模型組升高最為顯著。

a-Akt及其磷酸化產(chǎn)物;b-mTOR及其磷酸化產(chǎn)物圖4 Akt、mTOR和其磷酸化蛋白條帶及灰度分析Fig.4 Protein band and gray analysis of Akt、mTOR and their phosphorylated form

3 結(jié)論

肌肉組織是不能自身形成新纖維的終末分化結(jié)構(gòu),C2C12細(xì)胞是來源于小鼠骨骼肌C2細(xì)胞系的細(xì)胞株,具有分化能力,因此通常作為成肌細(xì)胞增殖和分化的模型[19]。TNF-α是一種促炎癥細(xì)胞因子,多項研究已發(fā)現(xiàn)在一些肌肉萎縮、老年肌少癥患者的骨骼肌的表達(dá)明顯升高,也常被用做肌肉衰減或關(guān)節(jié)健康研究模型的刺激因子[20-21]。MyoD、MyoG、MyHC、MAFbx、TRIM63與肌肉生長、分化、降解過程密切相關(guān)。肌源調(diào)控因子MyoD、MyoG和相關(guān)肌球蛋白MyHC是肌肉分化的標(biāo)志基因表達(dá)的蛋白,泛素連接酶MAFbx是蛋白降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,被認(rèn)為是經(jīng)典的蛋白降解標(biāo)志,泛素連接酶TRIM63是TRIM家族蛋白之一,其含量能夠反映骨骼肌蛋白質(zhì)分解機(jī)制的泛素蛋白酶體途徑表達(dá)增多的情況[22-23]。

蛋白的表達(dá)過程在RNA表達(dá)后經(jīng)過修飾、折疊、磷酸化等步驟形成具有功能的蛋白質(zhì),因此RNA表達(dá)水平不等于蛋白表達(dá)水平,考察蛋白表達(dá)水平的變化能夠反應(yīng)模型及給藥后細(xì)胞的真實變化。本研究建立了TNF-α刺激C2C12細(xì)胞模型,實驗表明TNF-α能引起C2C12細(xì)胞中肌源調(diào)控因子MyoD、MyoG和相關(guān)肌球蛋白MyHC的蛋白表達(dá)水平下降,也能夠引起與肌肉蛋白降解相關(guān)的泛素連接酶MAFbx和TRIM63表達(dá)升高。小麥肽、大豆肽、豌豆肽均在不同實驗中被證實對于肌肉促進(jìn)、運(yùn)動營養(yǎng)健康具有積極作用。本研究中,小麥肽與大豆肽+豌豆肽以1∶3的質(zhì)量比進(jìn)行復(fù)配在幾種配比中可以最有效地改善由TNF-α造成的C2C12細(xì)胞肌蛋白含量降低,提高C2C12細(xì)胞中成肌調(diào)節(jié)因子和肌肉蛋白的表達(dá)水平。

合成代謝是肌肉再生、修復(fù)與重塑的基礎(chǔ)。影響肌肉健康的關(guān)鍵合成代謝通路是絲氨酸蘇氨酸激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)通路,在蛋白翻譯(上調(diào)翻譯起始和核糖體生物發(fā)生)中作用關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)MyoD、MyoG、MyHC、MAFbx、TRIM63蛋白表達(dá)的變化趨勢與磷酸化的Akt和mTOR的表達(dá)趨勢一致,說明小麥肽與大豆肽+豌豆肽改善C2C12細(xì)胞肌蛋白表達(dá)的作用受到Akt/mTOR通路調(diào)節(jié),肽能夠降低細(xì)胞中E3泛素連接酶的表達(dá)和提高Akt/mTOR的蛋白磷酸化水平,從而降低細(xì)胞中蛋白降解和促進(jìn)蛋白合成。