蘭州百合鱗莖花青素合成相關(guān)MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子的篩選分析

范文廣,李保豫,田輝,李欣,任海偉,曹瑩瑩,姜欣彤,柴佳靖,陳少青

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730050)

百合(Liliumspp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(LiliumL.)植物的統(tǒng)稱(chēng),多年生草本植物,地下部分為肉質(zhì)鱗莖,其花姿綽約、花色多彩、氣味芬芳,是世界上最重要的觀賞花卉之一[1]。全世界已發(fā)現(xiàn)百合屬約110種[2],中國(guó)作為百合產(chǎn)地之一,野生百合約47種[3]。百合不僅作為觀賞花卉,其地下鱗莖部分也具有多種營(yíng)養(yǎng)成分,包括多糖、蛋白、皂苷和膳食纖維等[4],具有抗氧化及抗衰老等作用[5]。蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor),鱗片大、肉質(zhì)飽滿、味道甘甜、口感好,是我國(guó)主要的食用百合之一,近些年來(lái)受廣大消費(fèi)者的喜歡[6]。蘭州百合鱗莖的顏色出土?xí)r為白色,但在貯藏運(yùn)輸過(guò)程中,許多鱗片由于花青素的積累而變成紫紅色,極大地降低了百合的商用價(jià)值[7]。

國(guó)內(nèi)外針對(duì)于百合花青素的研究,大多集中在花瓣部分,對(duì)于百合鱗莖花青素的研究非常少。百合中花青素的主要成分為矢車(chē)菊素3-O-β-蕓香糖苷,其次是3-O-β-蕓香糖-7-O-β-葡萄糖苷[8]。影響百合花青素生物合成途徑的相關(guān)基因分為結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因。亞洲百合雜交品種‘Montreux’中,鑒定出查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)與二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol reductase,DFR)基因在百合花青素生物合成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。在東方百合‘Sorbonne’中,發(fā)現(xiàn)查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)和DFR基因與花青素合成緊密相關(guān)[10-11]。亞洲雜交百合‘Montreux’中,分離出2個(gè)MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)基因:LhMYB6與LhMYB12,參與花青素的生物合成[12]。岷江百合(Lilium.regale)中,LrMYB15在外側(cè)花被、葉和苞片上游不同程度的表達(dá),決定了花青素的合成與積累[13]。亞洲百合雜交品種‘Montreux’中,還鑒定有2個(gè)bHLH(basic helix-loop-helix)基因:LhbHLH1和LhbHLH2參與了花青素的合成且關(guān)系密切[14]。岷江百合(Lilium.regale)中發(fā)現(xiàn),在LrbHLH2與LrMYB15協(xié)同作用下調(diào)節(jié)花青素的合成與積累[13]。

當(dāng)前對(duì)于百合鱗莖花青素的研究較少,且針對(duì)百合花青素轉(zhuǎn)錄因子的研究多是以單個(gè)基因的克隆與分析為主,缺乏針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與分析。本研究基于蘭州百合鱗莖測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定出的MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行篩選分析,并篩選出一些花青素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因作為候選基因,分析結(jié)果將為深入研究蘭州百合鱗莖中MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與花青素生物合成的機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

百合鱗莖樣本選自甘肅省蘭州市西果園街道,大小均勻,無(wú)病蟲(chóng)害,無(wú)機(jī)械損傷。取百合鱗片第四層和第五層,用蒸餾水洗滌,浸于1 g/L次氯酸鈉水溶液中浸泡1 min,消除潛在微生物,作為實(shí)驗(yàn)處理的植物材料[15]。將鱗片密封在聚乙烯薄膜塑料袋中(200 mm×150 mm,0.03 mm厚)。然后將鱗莖置于人工氣候培養(yǎng)箱中,(20±2) ℃處理5 d(日照12 h,遮陽(yáng)12 h),相對(duì)濕度保持在70%～80%。分別于第0天和第5天取百合鱗莖,用液氮快速冷凍,然后收集在5 mL的低溫保存管中,送至上海百趣生物科技有限公司測(cè)轉(zhuǎn)錄組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 蘭州百合鱗莖MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用在線ProtParam網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)轉(zhuǎn)錄組鑒定出的MYB和bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子蛋白性質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析[16]。用在線WOLF PSORT網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)對(duì)候選MYB與bHLH基因編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。然后參考DUBOS等[17]的方法,將轉(zhuǎn)錄組中MYB分類(lèi)。

1.3 蘭州百合鱗莖與擬南芥中MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化關(guān)系、功能分析及候選轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域分析

在擬南芥信息數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(http://www.arabidopsis.org)獲取擬南芥MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列。使用MEGA X軟件分別構(gòu)建蘭州百合鱗莖MYB轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),及蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),選用鄰接(neighbor-joining, NJ)法對(duì)序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì),選用Poisson模型并將Bootstrap value設(shè)置為1 000,缺失值處理方式為配對(duì)刪除(pairwise deletion),其他參數(shù)使用默認(rèn)值[18]。利用DNAMANV 6軟件對(duì)蘭州百合鱗MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多序列比對(duì),并通過(guò)CDD v3.17(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/)與Pfamv32.0(https://pfam.xfam.org/)分析候選MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

在蘭州百合鱗莖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中,初步篩選到53個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)序列,73個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)序列,運(yùn)用NCBI在線blastp軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對(duì)篩選,最終鑒定出MYB轉(zhuǎn)錄因子50個(gè),bHLH轉(zhuǎn)錄因子73個(gè)。

2.1 蘭州百合鱗莖MYB轉(zhuǎn)錄因子

2.1.1 蘭州百合鱗莖MYB轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

針對(duì)鑒定出的蘭州百合鱗莖MYB轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)進(jìn)行分析,其中包括蛋白長(zhǎng)度、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和親疏水性。結(jié)果如表1所示,蘭州百合鱗莖轉(zhuǎn)錄組中篩選出的50個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白長(zhǎng)度為93～1 365 aa,分子質(zhì)量大小為10.93～152.08 kDa,等電點(diǎn)為4.63～11.63。預(yù)測(cè)結(jié)果還顯示出50個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)均大于40,為不穩(wěn)定蛋白,且50個(gè)蛋白的平均親水指數(shù)均小于0,屬于親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Cluster-96.0蛋白定位于線粒體,Cluster-4138.2991蛋白定位于細(xì)胞質(zhì),其余48個(gè)MYB蛋白定位于細(xì)胞核中。將蘭州百合鱗莖轉(zhuǎn)錄組中50個(gè)MYB蛋白序列逐個(gè)進(jìn)行在線BLAST,MYB分類(lèi)結(jié)果如表1所示,2個(gè)1R-MYB類(lèi),44個(gè)R2R3-MYB類(lèi),3個(gè)3R-MYB類(lèi),1個(gè)4R-MYB類(lèi)。蘭州百合鱗莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中MYB分類(lèi)結(jié)果表示,1R-MYB占4%,R2R3-MYB占88%,3R-MYB占6%,4R-MYB占2%,不同類(lèi)別的MYB轉(zhuǎn)錄因子分布比例與小麥(Triticumaestivum)、楊樹(shù)(Populusspp.)、谷子(Setariaitalica)和黑果枸杞(Lyciumruthenicum)等研究結(jié)果類(lèi)似[17]。

2.1.2 蘭州百合鱗莖與擬南芥中MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化關(guān)系、功能分析及候選轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEGA X軟件對(duì)蘭州百合鱗莖MYB轉(zhuǎn)錄因子與注釋明確的擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),分析進(jìn)化關(guān)系與功能預(yù)測(cè)。根據(jù)DUBOS等[17]針對(duì)擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子亞族分類(lèi),圖1中使用紅色顯著標(biāo)出的AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114屬于S6亞組,擬南芥中功能明確的調(diào)控花青素生物合成晚期基因并促進(jìn)花青素積累的轉(zhuǎn)錄因子[19]。擬南芥AtMYB75和AtMYB90對(duì)于DFR基因的表達(dá)至關(guān)重要[20],AtMYB113和AtMYB114影響花青素生物合成后期酶的表達(dá)[21]。圖1中Cluster-668.0、Cluster-4138.14450、Cluster-4138.3405、Cluster-4138.19859和Cluster-4138.19860與S6亞組聚集在一起,推測(cè)其具有相似的花青素生物合成相關(guān)功能。

表1 蘭州百合鱗莖MYB轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)以及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 1 Physicochemical properties and prediction of subcellular localization of MYB transcription factors in Lilium davidii var.unicolor bulbs

圖1 蘭州百合鱗莖MYB轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AtMYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree of MYB transcription factor in Lilium davidii var.unicolor bulbs and Arabidopsis thaliana AtMYB transcription factor

將上述5個(gè)蘭州百合鱗莖MYB轉(zhuǎn)錄因子作為候選MYB轉(zhuǎn)錄因子,并利用在線軟件進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2顯示,5個(gè)候選MYB轉(zhuǎn)錄因子中Cluster-4138.3405僅含有1個(gè) 高度保守MYB-binding結(jié)構(gòu)域,屬于1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子,其余4個(gè)經(jīng)預(yù)測(cè)均含有2個(gè)高度保守MYB-binding結(jié)構(gòu)域,屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。該結(jié)果與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究中MYB轉(zhuǎn)錄因子N端存在高度保守DNA-binding結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)果類(lèi)似[21]。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測(cè)還發(fā)現(xiàn)MYB-binding結(jié)構(gòu)域的蛋白數(shù)量為30～50個(gè)氨基酸,該結(jié)果與絹毛委陵菜(Potentillasericea)[22]、漆樹(shù)(Toxicodendronvernicifluum)[23]和亞洲百合(LiliumAsiatic hybrids ‘Little Kiss’)[24]MYB的研究類(lèi)似。

圖2 蘭州百合鱗莖花青素相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of the conserved structure of anthocyanin-related MYB transcription factor proteins in Lilium davidii var.unicolor bulbs

2.2 蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子

2.2.1 蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

對(duì)鑒定出的73個(gè)蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行理化性質(zhì)分析。結(jié)果如表2所示,73個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的蛋白長(zhǎng)度為39～703 aa,分子質(zhì)量為4.61～79.85 kDa,等電點(diǎn)為3.8～11.47。在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明73個(gè)蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白均為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定指數(shù)大于40),并且僅有一個(gè)Cluster-4138.21820平均親水指數(shù)大于0為疏水性蛋白,另外72個(gè)bHLH編碼蛋白均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明,1個(gè)bHLH定位于細(xì)胞外,58個(gè)定位于細(xì)胞核,8個(gè)定位于葉綠體,2個(gè)定位于線粒體,1個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),3個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)。轉(zhuǎn)錄組中73個(gè)bHLH經(jīng)亞細(xì)胞定位,在細(xì)胞各位置中的分布比例類(lèi)似于銀杏(Ginkgo)[25]與黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)[26]。

表2 蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)以及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 2 Physicochemical properties and prediction of subcellular localization of bHLH transcription factors in Lilium davidii var.unicolor bulbs

續(xù)表2

2.2.2 蘭州百合鱗莖與擬南芥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化關(guān)系、功能分析及候選轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEGAX軟件對(duì)蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子與注釋明確的擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),分析進(jìn)化關(guān)系與功能預(yù)測(cè)。根據(jù)擬南芥bHLH亞族分類(lèi),圖3中使用紅色顯著標(biāo)出的分支AtbHLH42、AtbHLH12、AtbHLH1和AtbHLH2屬于IIIf亞族是擬南芥中功能明確的花青素生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[27],AtbHLH32可作為花青素的負(fù)調(diào)節(jié)劑影響擬南芥花青素的合成[28],AtbHLH42可與AtMYB75協(xié)同作用通過(guò)影響DFR基因的表達(dá),進(jìn)而影響花青素的生物合成[29]。其中Cluster-4138.9158、Cluster-18294.0與IIIf亞族聚集在一起,推測(cè)其可能具有較高的親緣性以及相似的花青素生物合成相關(guān)功能。

將上述2個(gè)蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為候選bHLH轉(zhuǎn)錄因子,并進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4顯示,2個(gè)候選bHLH轉(zhuǎn)錄因子均在C端預(yù)測(cè)出螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix,HLH)保守域,分別由50個(gè)和64個(gè)氨基酸構(gòu)成,這一結(jié)果符合bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基本特征,與谷子(SetariaitalicaL.)[30]和黑果枸杞[26]等bHLH研究結(jié)果類(lèi)似。

圖3 蘭州百合鱗莖bHLH轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AtbHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic tree of bHLH transcription factor in Lilium davidii var.unicolor bulbs and Arabidopsis thaliana AtbHLH transcription factor

圖4 蘭州百合鱗莖花青素相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of the conserved structure of anthocyanin-related bHLH transcription factor proteins in Lilium davidii var.unicolor bulbs

2.3 蘭州百合鱗莖花青素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)分析

基于蘭州百合鱗莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),本研究對(duì)比了第0天和第5天的蘭州百合鱗莖分析花青素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量。如表3所示,第0天與第5天各基因的表達(dá)量來(lái)自于蘭州百合鱗莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。研究表明,2個(gè)候選花青素相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子中,Cluster-18294.0在第5天的表達(dá)量略低于第0天,但P值為0.902 95,表示蘭州百合鱗莖第0天VS第5天中該基因無(wú)顯著性表達(dá)差異,而Cluster-4138.9158表達(dá)量顯示出明顯的上升趨勢(shì)。5個(gè)候選花青素相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子中,Cluster-413814450在第5天的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),且存在極其顯著的表達(dá)差異,其余4個(gè)候選MYB轉(zhuǎn)錄因子在第5天皆呈上升趨勢(shì),并具有顯著性差異。

表3 蘭州百合鱗莖花青素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量分析Table 3 Expression analysis of anthocyanin-related transcription factor genes in Lilium davidii var.unicolor bulbs

植物花青素合成過(guò)程中,調(diào)控基因通過(guò)編碼轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量,進(jìn)而影響花青素的合成通路。本課題組關(guān)于蘭州百合鱗莖的轉(zhuǎn)錄組與代謝組研究中[31],花青素合成通路中共發(fā)現(xiàn)20個(gè)差異表達(dá)結(jié)構(gòu)基因。7個(gè)候選花青素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因中Cluster-18294.0未在第5天與第0天發(fā)現(xiàn)差異表達(dá),故推測(cè)其在蘭州百合鱗莖花青素合成中并不起調(diào)控作用。利用皮爾遜系數(shù)法測(cè)定候選基因中6個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因與20個(gè)差異表達(dá)結(jié)構(gòu)基因的相關(guān)性。結(jié)果如圖5所示,Cluster-4138.14450與19個(gè)高表達(dá)花青素相關(guān)結(jié)構(gòu)基因呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,推測(cè)其在蘭州百合鱗莖花青素積累過(guò)程中發(fā)揮抑制作用,Cluster-668.0與5個(gè)差異表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因顯示出負(fù)相關(guān),與其他15個(gè)差異表達(dá)結(jié)構(gòu)基因顯示出正相關(guān)關(guān)系,且皮爾遜系數(shù)普遍較低,故推測(cè)Cluster-668.0對(duì)于蘭州百合鱗莖花青素合成的影響力較弱。其余4個(gè)候選花青素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因與19個(gè)高表達(dá)花青素相關(guān)結(jié)構(gòu)基因均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,且部分皮爾遜相關(guān)性系數(shù)大于0.8,呈現(xiàn)出極正相關(guān)關(guān)系。因此推測(cè)1個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因(Cluster-4138.9158),3個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(Cluster-4138.3405,Cluster-4138.19860與Cluster-4138.19859),對(duì)蘭州百合鱗莖花青素的合成積累起促進(jìn)作用。

圖5 蘭州百合鱗莖花青素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因與結(jié)構(gòu)基因相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of anthocyanin-related transcription factor genes and structural genes in Lilium davidii var.unicolor bulbs

3 結(jié)論

綜上所述,本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選分析了蘭州百合鱗莖的MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族,并通過(guò)與模式植物擬南芥注釋明確的MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析親緣關(guān)系,以及利用皮爾遜系數(shù)分析花青素相關(guān)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因的相關(guān)性,初步篩選出蘭州百合鱗莖花青素相關(guān)的3個(gè)MYB基因(Cluster-4138.3405,Cluster-4138.19860與Cluster-4138.19859)和1個(gè)bHLH基因(Cluster-4138.9158)發(fā)揮促進(jìn)作用,1個(gè)MYB基因(Cluster-4138.14450)起抑制作用,1個(gè)MYB基因(Cluster-668.0)影響力較弱,1個(gè)bHLH基因(Cluster-18294.0)未起調(diào)控作用。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究百合鱗莖花青素相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。