非釀酒酵母與釀酒酵母在米酒混菌發(fā)酵中的相互作用機(jī)制分析

李柔,劉源,宋開闊,徐巖,王棟*

1(釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 3(海天醋業(yè)集團(tuán)有限公司,江蘇 宿遷,223600)

米酒在我國具有悠久的歷史,其生產(chǎn)和消費(fèi)相當(dāng)廣泛。我國傳統(tǒng)米酒釀造具有多菌種混合發(fā)酵的特點(diǎn),有研究表明在米酒釀造過程中存在著豐富的酵母菌[1]。根據(jù)酵母在釀造中的功能,可分為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非釀酒酵母(non-Saccharomycesyeasts,NSY)。釀酒酵母具有發(fā)酵效率高、耐受酒精濃度高的特點(diǎn),通常是酒類發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌[2]。一般非釀酒酵母的發(fā)酵效率較低,產(chǎn)酒精能力弱[3],通常無法用于酒類產(chǎn)品的純種發(fā)酵。但非釀酒酵母通過一系列的復(fù)雜生化反應(yīng)可以產(chǎn)生大量的酶、甘油、酯類和其他代謝物,改善酒體的口感和香氣,賦予酒體地域特色[4]。近年來,很多研究開始將釀酒酵母與非釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵,對(duì)二者進(jìn)行“取長補(bǔ)短”,旨為保證發(fā)酵效率的同時(shí),又能改善產(chǎn)品品質(zhì)[5-6]。其中在葡萄酒釀造領(lǐng)域應(yīng)用較多[7]。

在酵母混菌發(fā)酵過程中,非釀酒酵母通常主要存在于發(fā)酵的早期階段,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,非釀酒酵母會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被釀酒酵母取代[8],說明非釀酒酵母雖然可以與釀酒酵母共同參與酒精發(fā)酵,但其生長會(huì)受到抑制,有報(bào)道乙醇[9]、中長鏈脂肪酸[10]等釀酒酵母代謝物的影響較大。此外,不同酵母間還存在較為復(fù)雜的相互作用。在酵母混合釀造葡萄酒中,葡萄有孢漢生酵母(Hanseniasporauvarum)、美極梅氏酵母(Metschnikowiapulcherrima)等非釀酒酵母會(huì)與釀酒酵母競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)物質(zhì),導(dǎo)致發(fā)酵遲緩甚至停止[11];某些酵母甚至還會(huì)產(chǎn)生致死毒素抑制其他酵母生長[12]。近年來,細(xì)胞間接觸被認(rèn)為能夠降低酵母,尤其是非釀酒酵母[13]的活力。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母能促使釀酒酵母的糖代謝相關(guān)基因過量表達(dá),有利于釀酒酵母的生長代謝[14]。綜上所述,不同酵母間相互作用機(jī)理復(fù)雜,影響因素較多。同時(shí),不同酵母菌株間的差異也較大。研究不同酵母間的相互作用及其機(jī)制對(duì)于釀造行業(yè)及相關(guān)領(lǐng)域具有較重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

我國傳統(tǒng)米酒釀造中也存在這樣的問題,酒藥和開放的釀造過程會(huì)帶入豐富的非釀酒酵母,如扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、假絲酵母(Candida)、畢赤酵母(Pichia)等[1]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,這些非釀酒酵母逐漸被釀酒酵母所取代[15],釀酒酵母作為酒精發(fā)酵的主導(dǎo)菌大量存在,但是相關(guān)的作用機(jī)制尚不清楚。隨著米酒純種釀造等新工藝的開發(fā),非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵對(duì)于米酒風(fēng)味和品質(zhì)的提升也受到了重視[16],對(duì)不同酵母間相互作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)也提出了新的要求,加深對(duì)這一問題的理解可以更好地指導(dǎo)我們選育和利用非釀酒酵母,設(shè)計(jì)發(fā)酵策略,優(yōu)化發(fā)酵過程,更大限度地利用微生物特性提高米酒品質(zhì)。

本研究以2株與米酒釀造相關(guān)的常見非釀酒酵母為研究對(duì)象,采用同時(shí)接種和順序接種2種方式與釀酒酵母進(jìn)行米酒混菌發(fā)酵,通過對(duì)發(fā)酵過程理化參數(shù)、生物量變化的監(jiān)測(cè),分析酵母間的相互影響及其相關(guān)因素,并對(duì)釀酒酵母發(fā)酵代謝物、營養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)、細(xì)胞-細(xì)胞接觸等因素的影響進(jìn)行了探究,旨在對(duì)不同酵母間相互作用機(jī)制有更多的認(rèn)識(shí),為更加合理地調(diào)控微生物代謝,實(shí)現(xiàn)米酒釀造新工藝的優(yōu)化,釀造優(yōu)質(zhì)米酒提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

本研究用于米酒釀造的釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeLBM-2901,Sc),保藏于江南大學(xué)釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室。假絲酵母(CandidaglabrataLBM-202,Ca)為從傳統(tǒng)米酒發(fā)酵醪中分離而來,扣囊復(fù)膜酵母(SaccharomycopsisfibuligeraLBM-201,Sf)為從米酒酒藥中分離得到。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,瓊脂20,蒸餾水100 mL,115 ℃滅菌30 min;YPD液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,蒸餾水100 mL,115 ℃滅菌30 min。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖、無水乙醇、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、3,5-二硝基水楊酸、甲醇,上海國藥集團(tuán);放線菌酮,青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;酵母粉、蛋白胨,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀,美國Agilent公司;酶標(biāo)儀,美國Bio-Tek公司;Milli-Q純水儀,美國Millipore公司;臺(tái)式高速離心機(jī),德國Eppendorf公司;恒溫培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器公司;電子天平,瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米酒發(fā)酵

為便于研究,本研究采用液態(tài)發(fā)酵的方式進(jìn)行米酒發(fā)酵,具體操作參照鄒凌波[17]的方法,主要過程包括大米浸泡、蒸飯后加入α-淀粉酶液化、糖化酶糖化,制得的糖化米汁還原糖含量為200 g/L左右,115 ℃滅菌30 min備用。米酒發(fā)酵分別采用酵母純種發(fā)酵和混菌發(fā)酵的方式進(jìn)行。先將酵母活化,取保藏菌株接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)48 h,使得培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)達(dá)到108CFU/mL,備用。

純種發(fā)酵:將活化后的釀酒酵母(Sc)、非釀酒酵母(Ca或Sf)分別接種于100 mL糖化米汁中,酵母接種量均為106CFU/mL,于帶發(fā)酵栓的錐形瓶中30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每天定時(shí)取樣,檢測(cè)CO2失重、生物量等;發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心5 min取上清液,測(cè)定發(fā)酵液還原糖和酒精含量。失重小于0.2 g即為發(fā)酵結(jié)束。

混菌發(fā)酵:混菌發(fā)酵采用兩種方式,即同時(shí)接種發(fā)酵和順序接種發(fā)酵。同時(shí)接種發(fā)酵:活化后的釀酒酵母Sc分別與非釀酒酵母Ca或Sf同時(shí)接種于糖化米汁中進(jìn)行發(fā)酵(分別記為Si-SC+CA,Si-SC+SF);順序接種發(fā)酵:活化后的非釀酒酵母Ca或Sf先接種于糖化米汁中,發(fā)酵3 d后,再接種釀酒酵母Sc(分別記為Se-SC+CA,Se-SC+SF)。酵母菌的接種量均為106CFU/mL,培養(yǎng)條件、理化指標(biāo)及生物量測(cè)定方法同純種發(fā)酵。

樣品均設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.2 酵母生物量測(cè)定

PD-L1在多種腫瘤中存在高表達(dá)。PD-L1通過與活化T細(xì)胞上表達(dá)的受體 PD-1相互作用，傳遞抑制信號(hào)導(dǎo)致T細(xì)胞失去活性[34]。相關(guān)的臨床研究已在進(jìn)行中，PD-L1抑制劑阿維單抗和度伐魯單抗等單克隆抗體正在進(jìn)行不同實(shí)體瘤的Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)[35]，覆蓋了非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和膀胱癌等多個(gè)瘤種，尚未見心臟毒性的報(bào)道。阿維單抗作為一、二線治療尿路上皮癌的常見3～4級(jí)免疫介導(dǎo)性不良反應(yīng)有肺炎、皮疹和呼吸困難[36-37]。Barata等[38]完成1項(xiàng)回顧性單中心研究發(fā)現(xiàn)，79例患者使用阿特珠單抗治療后，尚未出現(xiàn)心臟相關(guān)不良反應(yīng)。

酵母生物量的測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法[18]。在純種發(fā)酵條件下,直接在YPD平板上進(jìn)行酵母計(jì)數(shù)。

在混菌發(fā)酵培養(yǎng)條件下,首先利用YPD平板進(jìn)行總酵母數(shù)的計(jì)數(shù)。適量濃度的放線菌酮(cycloheximide)能夠抑制釀酒酵母的生長,而不影響非釀酒酵母的菌落形成[19],所以利用添加400 mg/L放線菌酮的YPD平板可進(jìn)行非釀酒酵母的計(jì)數(shù)?？偨湍笖?shù)減去非釀酒酵母數(shù)即為釀酒酵母數(shù)。

1.3.3 還原糖和酒精測(cè)定

發(fā)酵液還原糖含量采用DNS法測(cè)定[20]。

酒精含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[21]。樣品經(jīng)10%三氯乙酸沉淀后靜置1 h,取上清液用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾,濾液供液相進(jìn)樣。高效液相色譜儀色譜柱為Aminex HPX-87H(150 mm×4.6 mm,Bio-Rad),視差折光檢測(cè)器(RID)為Waters 2414,流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸,流速0.6 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4 釀酒酵母發(fā)酵代謝物對(duì)非釀酒酵母的影響

釀酒酵母發(fā)酵代謝物的制備:分別取釀酒酵母Sc純種發(fā)酵2 d和6 d的米酒發(fā)酵液靜置10 min,取發(fā)酵清液于6 000 r/min無菌離心10 min,取上清液在超凈臺(tái)中過0.22 μm無菌濾膜,得到無細(xì)胞的發(fā)酵上清液作為釀酒酵母Sc發(fā)酵代謝物溶液,貯存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.5 酵母的非接觸發(fā)酵

根據(jù)HU等[22]設(shè)計(jì)的一種模型,設(shè)計(jì)透析袋分室發(fā)酵實(shí)驗(yàn),以達(dá)到分隔酵母菌株發(fā)酵的目的,同時(shí)維持發(fā)酵體系成分均一。取10 kDa截留分子質(zhì)量的透析袋,經(jīng)過滅菌后,在無菌條件下加入適量糖化米汁,置于裝有等量糖化米汁的錐形瓶內(nèi)。將非釀酒酵母接種于透析袋內(nèi),Sc接種于透析袋外;為驗(yàn)證透析袋對(duì)于物質(zhì)交換的影響,作為對(duì)照,將非釀酒酵母接種于透析袋外,Sc接種于透析袋內(nèi)。接種量均為106CFU/mL,錐形瓶加發(fā)酵栓封口進(jìn)行發(fā)酵。處理樣品設(shè)置3個(gè)平行,30 ℃、低速振蕩發(fā)酵,每隔一天測(cè)定透析袋內(nèi)外的生物量、乙醇、還原糖含量,連續(xù)測(cè)定7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母純種發(fā)酵和混菌發(fā)酵過程變化

首先對(duì)兩種非釀酒酵母Sf和Ca進(jìn)行米酒純種發(fā)酵及與釀酒酵母Sc混菌發(fā)酵,同時(shí)以Sc純種發(fā)酵作為對(duì)照,發(fā)酵過程中葡萄糖和酒精的含量變化如圖1、圖2所示。在純種發(fā)酵過程中,2株非釀酒酵母都表現(xiàn)出一定的酒精發(fā)酵能力,但是利用還原糖和產(chǎn)酒精速度都低于釀酒酵母Sc。Sc純培養(yǎng)在發(fā)酵第10天能達(dá)到9.52%的酒精度,而Sf在第14天結(jié)束發(fā)酵時(shí)僅能達(dá)到8.91%酒精度,是3株酵母中產(chǎn)酒精量最低、剩余還原糖含量最高的菌株。相較于Sf,Ca利用還原糖、產(chǎn)酒精能力更強(qiáng),發(fā)酵能力較接近于Sc(圖2)。這一結(jié)果同已有的報(bào)道一致[23],表明非釀酒酵母在米酒發(fā)酵過程中存在劣勢(shì),即發(fā)酵效率低,發(fā)酵周期長。當(dāng)然,不同的非釀酒酵母發(fā)酵能力也存在差異。在2株非釀酒酵母與Sc混合發(fā)酵中,同時(shí)接種發(fā)酵能夠提高發(fā)酵效率,發(fā)酵第6天時(shí)還原糖均基本消耗完全,酒精度分別為9.46%(Si-SC+CA)和9.94%(Si-SC+SF)。但是在順序接種發(fā)酵中,2株非釀酒酵母與Sc組合發(fā)酵表現(xiàn)出不同的結(jié)果。由于釀酒酵母Sc具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力,Sc的加入使得與Sf的混菌發(fā)酵效率明顯提高(圖1),但其發(fā)酵效率低于Sc純種發(fā)酵。但是Ca與Sc的順序接種發(fā)酵效率卻低于Ca的純種發(fā)酵(圖2),表明Sc的加入降低了Ca的發(fā)酵效率。

a-還原糖;b-酒精含量圖1 Sf純種發(fā)酵及與Sc混菌發(fā)酵過程中還原糖和 酒精含量變化Fig.1 Sugar consumption and ethanol content profiles of pure and mixed fermentations of Sf and Sc注:SF:Sf純種發(fā)酵;SC:Sc純種發(fā)酵;Si-SC+SF: Sc與Sf同時(shí)接種發(fā)酵;Se-SC+SF:Sc與Sf順序接種發(fā)酵。

a-還原糖;b-酒精含量圖2 Ca純種發(fā)酵及與Sc混合發(fā)酵過程中變化Fig.2 Sugar consumption and ethanol content profiles of pure and mixed fermentation of Ca and Sc注:CA:Ca純種發(fā)酵;SC:Sc純種發(fā)酵;Si-SC+CA:Sc與Ca 同時(shí)接種發(fā)酵;Se-SC+CA:Sc與Ca順序接種發(fā)酵。

以上結(jié)果表明,非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵時(shí),不同的接種方式對(duì)米酒發(fā)酵過程的影響是不同的,可能存在較為復(fù)雜的機(jī)制。同時(shí)接種發(fā)酵對(duì)于發(fā)酵效率的提升可能是由于不同酵母間的協(xié)同作用,但在順序接種發(fā)酵中,不同的非釀酒酵母受到釀酒酵母的影響存在差異,Ca與Sc的混合可能抑制了它們的混合發(fā)酵。

2.2 純種和混菌發(fā)酵中不同酵母生物量的變化

進(jìn)一步對(duì)2種混菌發(fā)酵過程中不同酵母生物量的變化進(jìn)行了考察,并與各自酵母純種發(fā)酵過程中的生物量變化進(jìn)行比較,結(jié)果如圖3所示。在純種發(fā)酵過程中,2株非釀酒酵母與釀酒酵母的生物量變化相似,均在發(fā)酵第2天生物量到達(dá)最高,發(fā)酵過程中基本維持在較高濃度(107～108CFU/mL)。在混菌發(fā)酵過程中,無論是哪種混菌發(fā)酵方式,Sc的生物量變化與其純種發(fā)酵過程類似,沒有受到明顯影響;對(duì)于非釀酒酵母,在發(fā)酵初期(釀酒酵母數(shù)量較低時(shí)),Ca和Sf的生物量變化也沒有受到顯著影響,但是當(dāng)Sc生物量達(dá)到約107CFU/mL后,2株非釀酒酵母在2種混菌發(fā)酵中的生物量都會(huì)迅速下降,之后Sc成為發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌株。這種現(xiàn)象在一些同時(shí)接種發(fā)酵研究中也有報(bào)道[5]。研究結(jié)果表明,在混菌發(fā)酵過程中,無論哪種非釀酒酵母,較高濃度Sc的抑制作用都是明顯存在的,而非釀酒酵母對(duì)釀酒酵母的影響則非常有限。因此,由于非釀酒酵母受到了顯著的抑制,混菌發(fā)酵過程主要是由Sc主導(dǎo)發(fā)酵進(jìn)程,特別是在中后期。雖然同時(shí)接種發(fā)酵相比于純種發(fā)酵提高了發(fā)酵效率,可能與發(fā)酵初期2種酵母尚未明顯相互影響,從而具有一定的協(xié)同作用有關(guān),但是較高濃度的釀酒酵母對(duì)于非釀酒酵母的抑制仍然是明顯的,而釀酒酵母抑制非釀酒酵母的主要影響因素仍值得進(jìn)一步研究。

a-Sf純種及與Sc混菌發(fā)酵;b-Ca純種及與Sc混菌發(fā)酵圖3 純種和混菌發(fā)酵中酵母生物量變化Fig.3 Changes of different yeast biomass in pure and mixed fermentations

2.3 釀酒酵母發(fā)酵代謝物以及營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)非釀酒酵母的影響

一般認(rèn)為非釀酒酵母對(duì)于酒精的耐受性較弱[24],營養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及釀酒酵母代謝產(chǎn)物也會(huì)影響非釀酒酵母的生長[25],這些都可能是在混菌發(fā)酵中非釀酒酵母受抑制的原因。為了進(jìn)一步明確這些因素對(duì)于非釀酒酵母的影響,將釀酒酵母Sc發(fā)酵米酒過程中不同發(fā)酵時(shí)間(2、6 d)發(fā)酵液經(jīng)過處理,制備釀酒酵母發(fā)酵代謝物溶液作為培養(yǎng)基,分別接入2株非釀酒酵母,探究Sc發(fā)酵代謝物對(duì)于非釀酒酵母生長的影響。同時(shí),也添加酒精或葡萄糖,考察酒精或營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于非釀酒酵母生長的影響。結(jié)果如圖4 所示。

由圖4可知,與純種發(fā)酵相比,非釀酒酵母Sf和Ca在釀酒酵母發(fā)酵代謝物溶液中發(fā)酵的生物量均有不同程度的降低,但仍維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平,并未出現(xiàn)生物量的快速下降。說明釀酒酵母Sc發(fā)酵代謝物對(duì)于非釀酒酵母的生長存在一定程度的抑制,但是并不是在混菌發(fā)酵中抑制非釀酒酵母生長的主要因素。葡萄糖的添加對(duì)于2種非釀酒酵母基本沒有影響。對(duì)于Sf,較高濃度的酒精在發(fā)酵前期對(duì)其生長有一定的限制(圖4-a),但是也未使其在發(fā)酵過程中生物量快速下降。

a-Sf生物量變化;b-Ca生物量變化圖4 非釀酒酵母在釀酒酵母米酒發(fā)酵代謝物溶液中的生長情況Fig.4 The growth of non-saccharomyces yeasts in the metabolite solution of Sc from the fermentation of Mijiu

實(shí)際上在順序接種發(fā)酵中,Sc接種1 d后,2株非釀酒酵母的生物量均降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)(圖3),此時(shí)酒精度約為3%(圖1、圖2)。而在純種發(fā)酵過程中,即使酒精度超過8%,2株非釀酒酵母的生物量也未出現(xiàn)迅速下降。這些都說明在混菌發(fā)酵過程中,引起酵母生物量迅速下降的主要原因可能并不是酒精的毒害作用,雖然一定濃度的酒精對(duì)Sf的生長有一定的影響。從純培養(yǎng)中也可以發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后期培養(yǎng)體系中碳源匱乏,而Sf、Ca的生物量基本可以穩(wěn)定在較高水平,說明營養(yǎng)物質(zhì)限制也不是非釀酒酵母生物量快速降低的原因。

2.4 細(xì)胞非接觸發(fā)酵對(duì)非釀酒酵母的影響

本研究利用透析袋將不同酵母細(xì)胞隔離開來,采用非釀酒酵母與Sc非接觸發(fā)酵,進(jìn)一步考察細(xì)胞-細(xì)胞接觸對(duì)非釀酒酵母的影響。為排除透析袋對(duì)于酵母生長的影響,將非釀酒酵母分別接種于透析袋內(nèi)、外進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖5、圖6可以看出,非釀酒酵母在透析袋內(nèi)外的位置不同,對(duì)于與Sc非接觸發(fā)酵過程中還原糖、酒精含量以及生物量的變化趨勢(shì)無明顯影響,說明透析袋除了分隔不同酵母,并未明顯影響發(fā)酵體系的物質(zhì)交換和均一性。從酵母生物量的變化來看,2株非釀酒酵母Sf和Ca無論是在透析袋內(nèi)、外,酵母的生長情況與純種發(fā)酵時(shí)基本類似,生物量可以穩(wěn)定在107～108CFU/mL,沒有出現(xiàn)混菌發(fā)酵中生物量快速降低的現(xiàn)象(圖3)。

a-Sc接種于透析袋外;b-Sc接種于透析袋內(nèi)圖5 Sf與Sc非細(xì)胞接觸發(fā)酵過程的主要參數(shù)變化Fig.5 Biomass, sugar and ethanol concentration changes during the fermentations of Sf and Sc without cell-cell contact

a-Sc接種于透析袋外;b-Sc接種于透析袋內(nèi)圖6 Ca與Sc非細(xì)胞接觸發(fā)酵過程的主要參數(shù)變化Fig.6 Biomass, sugar and ethanol concentration changes during the fermentations of Ca and Sc without cell-cell contact

這一結(jié)果表明,非釀酒酵母在混菌發(fā)酵中生物量下降的主要原因應(yīng)該不是酵母的代謝產(chǎn)物,而非釀酒酵母與釀酒酵母的細(xì)胞-細(xì)胞接觸可能是主要原因。

3 結(jié)論

利用2種非釀酒酵母(Sf、Ca)分別與釀酒酵母Sc進(jìn)行米酒混菌發(fā)酵,采用不同的混菌發(fā)酵方式(同時(shí)接種、順序接種),可以得到不同的發(fā)酵表現(xiàn)。雖然2株非釀酒酵母表現(xiàn)出不同的發(fā)酵能力,但是無論采用何種發(fā)酵方式,都受到釀酒酵母Sc的影響。當(dāng)Sc生物量達(dá)到107CFU/mL的較高水平時(shí),Sf、Ca生物量出現(xiàn)快速下降,生長受到明顯抑制;相反,Sc的生長并未受到明顯的影響。利用Sc米酒發(fā)酵液為培養(yǎng)體系,考察釀酒酵母發(fā)酵代謝物及酒精和還原糖含量對(duì)非釀酒酵母的影響,結(jié)果表明釀酒酵母發(fā)酵代謝物在一定程度上會(huì)影響非釀酒酵母的生長活力,較高濃度的酒精也會(huì)對(duì)Sf的生長產(chǎn)生一定的影響,但這些因素都不會(huì)引起混菌發(fā)酵中非釀酒酵母生物量的快速下降。采用透析袋分隔發(fā)酵的方式對(duì)非釀酒酵母和釀酒酵母進(jìn)行細(xì)胞非接觸發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)Sc與非釀酒酵母的生長都未受到明顯影響,結(jié)果表明非釀酒酵母和釀酒酵母細(xì)胞-細(xì)胞接觸是非釀酒酵母在混合發(fā)酵過程中受到抑制,生物量快速下降的主要原因。綜上所述,在米酒混菌發(fā)酵中,釀酒酵母對(duì)非釀酒酵母的生長有明顯的抑制作用,這種作用機(jī)理較為復(fù)雜,主要是通過高濃度的Sc活細(xì)胞接觸來實(shí)現(xiàn)的。非釀酒酵母對(duì)Sc的影響卻較為有限。相關(guān)作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果為釀酒酵母與非釀酒酵母間的相互作用研究提供了一些參考,加深了對(duì)于傳統(tǒng)米酒發(fā)酵過程中酵母變化的認(rèn)識(shí),對(duì)于米酒釀造新工藝及其釀造策略優(yōu)化也具有一定的借鑒作用。