醬香型白酒釀造過(guò)程中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量分布

向丹華,李沛祺,王佳寶,陳雙,徐巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇 無(wú)錫,214122)

醬香型作為我國(guó)白酒的典型香型,其釀造工藝歷經(jīng)“八次發(fā)酵”、“九次蒸煮”、“七次取酒”,生產(chǎn)過(guò)程具有“四高兩長(zhǎng)”(“高溫制曲”、“高溫堆積”、“高溫餾酒”、“生產(chǎn)周期長(zhǎng)”、“陳釀貯存時(shí)間長(zhǎng)”)的典型特征,形成了具有“醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體綿柔、回味悠長(zhǎng)、空杯留香”的獨(dú)特風(fēng)味特點(diǎn)[1]。目前研究表明醬香型白酒香氣組分種類(lèi)十分多樣,包括醇類(lèi)、醛酮類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、萜烯類(lèi)、含氮類(lèi)、含硫類(lèi)等超過(guò)300種。其中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物由于香氣特征獨(dú)特,香氣閾值極低,是醬香型白酒中一類(lèi)對(duì)風(fēng)味品質(zhì)具有重要影響的香氣化合物[2]。代表性的甲硫醇[3](爛白菜、燒焦的橡膠味,46%酒精水溶液中化合物的香氣閾值為2.2 μg/L)、乙硫醇[4](洋蔥、橡膠味,46%酒精水溶液中化合物的香氣閾值為0.8 μg/L)、2-甲基-3-呋喃硫醇[5](烘烤味,53%酒精水溶液中化合物的香氣閾值為0.004 8 μg/L)和糠硫醇[6](烤芝麻、咖啡味,46%酒精水溶液中化合物的香氣閾值為0.1 μg/L)等揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物在原酒中含量的變化會(huì)顯著影響醬香型白酒的風(fēng)味品質(zhì)[7]。醬香型白酒輪次基酒的貯存、重新組合形成了復(fù)雜而獨(dú)特的酒體風(fēng)格[8],輪次基酒的風(fēng)味特征是保證醬香型白酒品質(zhì)的重要條件基礎(chǔ),很大程度上決定了成品酒的品質(zhì)[9]。然而,揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物在釀造過(guò)程中研究較少,監(jiān)測(cè)揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物在白酒釀造過(guò)程中的規(guī)律性變化是實(shí)現(xiàn)調(diào)控輪次基酒風(fēng)味品質(zhì)的重要途徑。

由于白酒中揮發(fā)性硫醇化合物的含量極低(大多在μg/L或ng/L水平),且不穩(wěn)定易分解[10],對(duì)這類(lèi)化合物的分析檢測(cè)十分具有挑戰(zhàn)性[11]。往往需要通過(guò)特殊的衍生化處理再結(jié)合氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)[12]或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[13]才能有效檢測(cè)。用于硫醇類(lèi)化合物檢測(cè)的衍生化試劑通常有2,3,4,5,6-五氟溴化芐(pentafluorobenzyl bromide,PFBBr)[14]、丙炔酸乙酯(ethyl propiolate,ETP)[15-16]、4,4′-聯(lián)吡啶二硫醚(4,4′-dithiodipyridine,DTDP)[17]等。衍生化試劑的選擇既與檢測(cè)的目標(biāo)化合物相關(guān),也與測(cè)定樣品的基質(zhì)性質(zhì)相關(guān),選擇合適的衍生化試劑是揮發(fā)性硫醇化合物準(zhǔn)確檢測(cè)的關(guān)鍵因素之一。

因此,本研究擬將衍生化與固相萃取(solid phase extraction,SPE)方法結(jié)合,聯(lián)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)檢測(cè)技術(shù)對(duì)醬香型白酒中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物進(jìn)行定量分析,解析不同釀造輪次的輪次基酒以及不同時(shí)間蒸餾出的餾分酒中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物含量變化規(guī)律,可為實(shí)現(xiàn)醬香型白酒釀造過(guò)程中揮發(fā)性硫醇類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采用的樣品由某醬香型白酒有限公司提供,包括3組不同生產(chǎn)輪次的基酒樣品,以及單一輪次60 min內(nèi)中不同發(fā)酵層(上層、中層、下層)酒醅,經(jīng)過(guò)連續(xù)6 min間段蒸餾的基酒。上層和中層取酒時(shí)間點(diǎn)為6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 min。下層取酒時(shí)間點(diǎn)3、9、15、21、27、33、39、45、51、57 min。醬香型白酒的蒸餾階段,餾出酒的酒精度由高到低逐漸降低。具體樣品信息如表1所示。

1.1.2 主要試劑

甲硫醇、乙硫醇、巰基乙酸乙酯、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、乙酸3-巰基己酯、2-巰基丙酸乙酯、1-丁硫醇、1-戊硫醇、2-苯乙硫醇(內(nèi)標(biāo)),Sigma-Aldrich(上海)或百靈威(北京),純度均大于95%;C18固相萃取柱(6 mL,500 mg)、2′-脫氧胸苷-5′-二磷酸(2′-deoxythymidine-5′-diphosphate,DTDP)、乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA-Na2)、鹽酸和乙醛,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)或安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司(上海);甲酸為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海);乙腈為質(zhì)譜級(jí),Sigma-Aldrich(上海)。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀、液相色譜柱(BEH C18 2.1 mm×100 mm,1.7 μm),沃特世科技(上海)有限公司;N-EVAP111型氮吹儀,美國(guó)Organomation公司;Milli-Q超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白酒中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的衍生化處理

通常,PFBBr和ETP在堿性pH下與硫醇類(lèi)化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)。然而,白酒的pH值約為4,屬于酸性環(huán)境,針對(duì)白酒進(jìn)行揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的衍生化,DTDP是一種非常好的選擇,它能與硫醇迅速反應(yīng),并且能在較廣的pH范圍內(nèi)發(fā)生[18]。因此采用衍生化試劑DTDP將白酒中的揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物進(jìn)行衍生化處理,衍生化試劑的制備過(guò)程如下:將220 mg DTDP溶于20 mL超純水和100 μL濃鹽酸(37%質(zhì)量分?jǐn)?shù))的混合液中,超聲反應(yīng)溶解后,用超純水定容至100 mL,制得衍生化試劑(10 mmol/L)。并將DTDP溶液貯存在-20 ℃下備用[19]。

表1 不同生產(chǎn)輪次以及不同時(shí)間蒸餾出的醬香型 白酒樣品信息Table 1 Information of sauce-aroma baijiu distilled in different production rounds and at different time

使用超純水或乙醇將白酒酒精度調(diào)整至25%vol左右,總體積為40 mL,加入濃度為58.7 mg/L的2-苯乙硫醇溶液68 μL,同時(shí)添加EDTA-Na240 mg,50%乙醛160 μL和新鮮解凍的衍生化試劑(4,4′-聯(lián)吡啶二硫醚,10 mmol/L)400 μL。渦旋振蕩5 min后,靜置25 min。甲硫醇、乙硫醇、巰基乙酸乙酯、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、乙酸3-巰基己酯、2-巰基丙酸乙酯、1-丁硫醇和1-戊硫醇,9種揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別配制于20 mL的53%vol酒精水溶液中進(jìn)行上述前處理過(guò)程。

1.3.2 SPE分離白酒中的硫醇的衍生物

將靜置后的樣品或配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次通過(guò)使用6 mL甲醇和6 mL超純水活化處理的C18固相萃取柱。然后用3 mL的甲醇進(jìn)行洗脫,并收集洗脫液,在常溫下使用氮吹儀用溫和的氮?dú)饬鳚饪s至400 μL,過(guò)膜后避光貯存于4 ℃冰箱中,以待分析。

1.3.3 UPLC-MS/MS 儀器條件設(shè)置

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(multiple reaction-monitoring, MRM)模式的正電離模式進(jìn)行檢測(cè)。柱溫始終保持在40 ℃,流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈(B),洗脫梯度為:0～13 min, 15%～22% B;13～14 min, 22%～30% B;14～18 min, 30%～35% B;18～18.5 min, 35%～100% B;18.5～21.5 min, 100% B;21.5～22 min, 100%～15% B。流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣體積為10 μL。選擇以下質(zhì)譜檢測(cè)條件:離子源的條件溫度為150 ℃,去溶劑溫度為500 ℃,毛細(xì)管電壓3 kV,去溶劑氣流速800 L/h。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)中醬香型白酒中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量范圍[4],確定硫醇類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的用量,添加一定量的硫醇類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶解于53%vol乙醇溶液中,依次進(jìn)行2倍梯度稀釋。配制成10個(gè)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。通過(guò)與樣品進(jìn)行相同的前處理方法后進(jìn)樣分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)使用MassLynx V4.1進(jìn)行處理。繪圖是通過(guò)使用Origin Pro 2022b完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS / MS 檢測(cè)醬香型白酒揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的方法的建立

硫醇類(lèi)化合物的質(zhì)譜參數(shù)是參考YAN等[4]優(yōu)化的結(jié)果,定量離子對(duì)(m/z)、錐孔電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜信息為甲硫醇(母離子:158.0,子離子:110.7,錐孔電壓:23,碰撞電壓:19);乙硫醇(172.0,143.0,23,19);1-丁硫醇(199.7,143.4,25,19);1-戊硫醇(214.0,143.2,27,17);糠硫醇(223.7,143.8,21,19),2-甲基-3-呋喃硫醇(224.0,110.6,23,25);巰基乙酸乙酯(230,143.4,25,27);2-巰基丙酸乙酯(244.0,143.2,25,27);乙酸3-巰基己酯(286.2,143.3,23,23)以及內(nèi)標(biāo)2-苯乙硫醇(248.5,143.5,23,20)。通過(guò)上面得到的質(zhì)譜信息,采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的檢測(cè)。根據(jù)結(jié)果對(duì)硫醇類(lèi)化合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 硫醇類(lèi)化合物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves for the detection of thiol compounds

不同的硫醇類(lèi)衍生物在液相色譜上進(jìn)行分離,采用乙腈作為有機(jī)相,在添加0.1%甲酸后,有了更好的峰形和響應(yīng),最終在18 min內(nèi)的流動(dòng)相梯度下的完全分離。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品衍生物進(jìn)樣,確定單個(gè)硫醇衍生物的出峰時(shí)間。將9個(gè)硫醇類(lèi)衍生物的出峰位置整理在同一視圖上,如圖1所示。

圖1 硫醇衍生物UPLC-MS/MS的出峰時(shí)間Fig.1 The peak time of thiol derivatives detected by UPLC-MS/MS

2.2 醬香型白酒不同輪次中的揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量分布

醬香型白酒的一個(gè)完整的生產(chǎn)過(guò)程需要持續(xù)一整年(歷經(jīng)8次發(fā)酵、9次蒸煮、7次取酒)。在醬香型白酒的生產(chǎn)過(guò)程中,揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物作為一類(lèi)影響醬香型白酒風(fēng)味品質(zhì)的重要風(fēng)味物質(zhì),研究不同生產(chǎn)輪次中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量變化規(guī)律對(duì)于實(shí)現(xiàn)醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中硫醇類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的含量控制具有重要的參考意義。因此,本研究采用3組不同輪次的基酒樣品進(jìn)行檢測(cè)。3組不同輪次的輪次基酒中,甲硫醇的質(zhì)量濃度為28.56～746.67 μg/L,乙硫醇的質(zhì)量濃度為2.97～3.02 μg/L,1-丁硫醇的質(zhì)量濃度為0.53～3.49 μg/L,1-戊硫醇的質(zhì)量濃度為0.59～1.87 μg/L,糠硫醇的質(zhì)量濃度為16.96～26.09 μg/L,2-甲基-3-呋喃硫醇質(zhì)量濃度為0.65～17.31 μg/L,巰基乙酸乙酯的質(zhì)量濃度為0.12～0.42 μg/L,2-巰基丙酸乙酯的質(zhì)量濃度為0.05～0.14 μg/L,乙酸3-巰基己酯的質(zhì)量濃度為0.16～2.40 μg/L。隨著輪次的增加,甲硫醇、糠硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇等重要揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量整體變化有一定上升的趨勢(shì),結(jié)果如圖2所示。

a-甲硫醇;b-糠硫醇;c-2-甲基-3-呋喃硫醇圖2 一至七輪次醬香型白酒中甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇的含量變化Fig.2 The content changes of methanethiol, 2-furfurylthiol, and 2-methyl-3-furanethiol in sauce-aroma Baijiu from one to seven round

2.3 醬香型白酒單一輪次下不同蒸餾時(shí)間的硫醇類(lèi)化合物的含量變化規(guī)律

醬香型白酒中的硫醇類(lèi)化合物整體輪次含量變化規(guī)律已經(jīng)得到解析,為了進(jìn)一步觀察單一輪次蒸餾過(guò)程中硫醇類(lèi)化合物的含量變化規(guī)律。醬香型白酒的3組不同發(fā)酵層(上層、中層和下層)的不同出酒時(shí)間的餾分酒從出酒開(kāi)始計(jì)時(shí),上層和中層,每隔6 min收集餾分,下層從3 min時(shí)開(kāi)始收集第一組餾分,共計(jì)30個(gè)餾分,進(jìn)行揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的檢測(cè)分析。檢測(cè)結(jié)果如圖3～圖5所示。在蒸餾階段,餾分酒中的揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量變化為甲硫醇(61.26～1 204.38 μg/L),乙硫醇(2.98～3.34 μg/L),1-丁硫醇(0.69～17.45 μg/L),1-戊硫醇(0.64～4.72 μg/L),糠硫醇(17.53～80.63 μg/L),2-甲基-3-呋喃硫醇(0.86～20.31 μg/L),巰基乙酸乙酯(0.16～0.47 μg/L),2-巰基丙酸乙酯(0.08～0.36 μg/L),乙酸3-巰基己酯(0.02～3.67 μg/L)。

醬香型白酒上層酒醅的蒸餾過(guò)程中,餾分酒中的糠硫醇、2-巰基丙酸乙酯、乙酸3-巰基己酯、1-戊硫醇、巰基乙酸乙酯、1-丁硫醇的濃度變化總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。甲硫醇總體呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì),2-甲基-3-呋喃硫醇總體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),乙硫醇含量變化較為穩(wěn)定。中層酒醅的蒸餾過(guò)程中,1-丁硫醇、乙酸3-巰基己酯、2-甲基-3-呋喃硫醇、1-戊硫醇、巰基乙酸乙酯、2-巰基丙酸乙酯的濃度變化總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),糠硫醇和乙硫醇濃度變化較為穩(wěn)定。下層酒醅的蒸餾過(guò)程中,1-丁硫醇、1-戊硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、2-巰基丙酸乙酯、巰基乙酸乙酯、乙酸3-巰基己酯濃度變化總體呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì),甲硫醇呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),糠硫醇和乙硫醇的濃度變化較為穩(wěn)定。醬香型白酒的三層不同發(fā)酵酒醅的餾分中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的部分變化規(guī)律是不同的,這可能也是醬香型白酒形成3種典型體(醬香、醇甜、窖底香)[20],產(chǎn)生差異的原因之一。

醬香型白酒的三層發(fā)酵酒醅在蒸餾過(guò)程中,甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇等重要揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物,其含量變化會(huì)出現(xiàn)一個(gè)甚至多個(gè)拐點(diǎn)。在酒醅的連續(xù)蒸餾過(guò)程中,硫醇類(lèi)化合物等風(fēng)味物質(zhì)通過(guò)蒸餾過(guò)程中的萃取作用轉(zhuǎn)移到餾分酒中,其含量并不是一直下降的,這說(shuō)明揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物在酒醅中的總量并不是恒定不變的,發(fā)酵過(guò)程中不僅僅只產(chǎn)生含量恒定的揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物,同時(shí)也可能產(chǎn)生了一定量的硫醇前體物質(zhì)[21],在蒸餾加熱過(guò)程中,前體物質(zhì)的熱降解反應(yīng)可能增加了揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的總量。

圖3 上層酒醅不同蒸餾時(shí)間的餾分酒中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量變化規(guī)律Fig.3 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of upper layers fermented grains at different distillation time

圖4 中層酒醅不同蒸餾時(shí)間的餾分酒中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量變化規(guī)律Fig.4 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of middle layers fermented grains at different distillation time

圖5 下層酒醅不同蒸餾時(shí)間的餾分酒中揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的含量變化規(guī)律Fig.5 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of bottom layers fermented grains at different distillation time

甲硫醇和硫化氫可能來(lái)源于蛋氨酸或半胱氨酸衍生物的降解[22]。酒醅在發(fā)酵過(guò)程中含硫氨基酸會(huì)大量積累,在蒸餾過(guò)程中將酒醅中大量合成的蛋氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫醇,通過(guò)蒸餾作用萃取到餾分酒中?？妨虼己?-甲基-3-呋喃硫醇是白酒中重要的硫醇類(lèi)化合物,它們?cè)卺u香型白酒釀造過(guò)程中的前體物質(zhì)可能是糖類(lèi)和氨基酸,糠硫醇的中間體之一是糠醛和硫化氫[23],2-甲基-3-呋喃硫醇的中間體之一是4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮[24],糠醛和4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮是糖的降解產(chǎn)物。在蒸餾過(guò)程中,前體物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng),最后產(chǎn)生糠硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇,而隨著蒸餾的進(jìn)行,前體物質(zhì)的減少,中間體物質(zhì)的消耗,糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇的生成也逐漸緩慢。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)DTDP衍生化結(jié)合SPE前處理后進(jìn)行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的方法,對(duì)醬香型白酒不同釀造輪次基酒以及單一輪次不同時(shí)間蒸餾出的餾分酒中的揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物進(jìn)行定量分析,確定其含量變化范圍并對(duì)其含量變化規(guī)律進(jìn)行解析。結(jié)果表明,隨著輪次的增加,醬香型白酒中香氣閾值極低的2-甲基-3-呋喃硫醇、糠硫醇等揮發(fā)性硫醇的含量隨著輪次的增加而上升,不同輪次間揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物可能存在一定的累積效應(yīng),導(dǎo)致下一輪次中硫醇類(lèi)化合物含量的增加。不同發(fā)酵層酒醅的餾分酒中硫醇類(lèi)化合物的含量變化規(guī)律為絕大部分呈現(xiàn)出先上升后下降的變化規(guī)律,部分硫醇含量變化穩(wěn)定,蒸餾過(guò)程的熱反應(yīng)促進(jìn)了甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇等重要揮發(fā)性硫醇類(lèi)化合物的生成。