柱花草SgPAL3基因啟動(dòng)子的克隆及上游轉(zhuǎn)錄因子的篩選

戴镕徽 高夢(mèng)澤 王芳 蔣凌雁 羅麗娟

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.007

引用格式：

戴镕徽， 高夢(mèng)澤， 王? 芳，等.柱花草SgPAL3基因啟動(dòng)子的克隆及上游轉(zhuǎn)錄因子的篩選［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（1）：66-74

DAI Rong-hui， GAO Meng-ze， WANG Fang，et al.Cloning of SgPAL3 Gene Promoter and Screening of Upstream Transcription Factors in Stylosanthes［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（1）：66-74

收稿日期：2023-08-14；修回日期：2023-10-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32201449，31872409）；海南大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（XTCX2022NYC02）；海南省自然科學(xué)基金高層次人才項(xiàng)目（320RC466）；海南省科技專項(xiàng)（ZDYF2020211）資助

作者簡(jiǎn)介：

戴镕徽（1999-），女，漢族，黑龍江富錦人，碩士研究生，主要從事抗病相關(guān)基因克隆與功能研究，E-mail：dairh1999@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：lyjiang@hainanu.edu.cn

摘要：柱花草（Stylosanthes spp.）是熱帶地區(qū)廣泛種植的重要草種，炭疽病是危害柱花草的嚴(yán)重病害，柱花草SgPAL3基因具有抗炭疽菌的功能。本研究對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域-2 000～0 bp，-1 500～0 bp序列分別構(gòu)建誘餌載體并檢測(cè)自激活，結(jié)果表明500 ng·mL-1金擔(dān)子素（Aureobasidin A，AbA）可以抑制兩種誘餌載體的自激活。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了柱花草響應(yīng)炭疽菌的酵母cDNA文庫(kù)，其容量為1.20×107，插入片段主要分布在750～2 000 bp，重組率為100%；利用酵母單雜交技術(shù)，篩選與SgPAL3基因啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子，并驗(yàn)證了3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8）與SgPAL3啟動(dòng)子的互作關(guān)系；qRT-PCR分析表明，SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8均響應(yīng)炭疽菌的侵染，說(shuō)明它們可能調(diào)控柱花草對(duì)炭疽病的抗性。本研究為進(jìn)一步解析SgPAL3響應(yīng)炭疽菌侵染的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：柱花草；啟動(dòng)子；酵母單雜；轉(zhuǎn)錄因子；SgPAL3基因

中圖分類號(hào)：Q943.2??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????? 文章編號(hào)：1007-0435（2024）01-0066-09

Cloning of SgPAL3 Gene Promoter and Screening of Upstream

Transcription Factors in Stylosanthes

DAI Rong-hui1，2， GAO Meng-ze1，2， WANG Fang1，2， JIANG Ling-yan1，2*， LUO Li-juan1，2

（1.School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China;

2.Sanya Institute of Breeding and Multipication， Hainan University， Sanya， Hainan Province 572025， China）

Abstract：Stylosanthes （stylo） is an important leguminous forage widely grown in tropical areas. Anthracnose is a serious disease affecting the growth of stylo. Previous studies show that SgPAL3 gene of stylo has function in the resistance against Colletotrichum gloeosporipides. In this study，the promoter regions of -2 000 to 0 bp and -1 500 to 0 bp were cloned into bait vectors，and the concentration of AbA that can inhibit the self-activation of bait vectors was determined. The results showed that 500 ng·mL-1 （Aureobasidin A，AbA） inhibited the self-activation of both bait vectors. The yeast cDNA library of stylo in response to C. gloeosporioides infection was constructed using the Gateway technology. The capacity of the library was 1.20×107. The inserted fragments were mainly distributed from 750 to 2 000 bp，and the recombination rate was 100%. The transcription factors interacting with SgPAL3 gene promoter were screened by yeast one-hybrid technique，and the the interactions of three transcription factors （SgASIL2，SgHAT5 and SgZHD8） with the SgPAL3 promoter were verified by yeast point-to-point experiments. The qRT-PCR analysis showed that the expression of SgASIL2，SgHAT5 and SgZHD8 were all responsive to C. gloeosporioides infection，indicating the these three transcription factors involved in regulating the defense responses of stylo against C. gloeosporioides. These results would lay a foundation for further research on transcriptional regulation mechanisms of SgPAL3 in response to C. gloeosporioides infection.

Key words：Stylosanthes;Promoter;Yeast one-hybrid;Transcription factors;SgPAL3 gene

柱花草是重要的熱帶豆科牧草，因適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)草量高等優(yōu)良特性，還被廣泛用于綠肥和熱區(qū)林果草生態(tài)工程建設(shè)等［1-3］。由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporipides）引起的炭疽病是危害柱花草生產(chǎn)的嚴(yán)重病害［4］。苯丙烷途徑是植物體內(nèi)最重要的次生代謝途徑之一，可以產(chǎn)生多種重要的次生代謝產(chǎn)物［5］。其中，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）是苯丙烷類代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，廣泛存在于高等植物和微生物中，并在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗病過(guò)程中起重要作用［6］。作者團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)對(duì)超量表達(dá)SgPAL3擬南芥（Arabidopsis thaliana）植株接種膠孢炭疽菌的病癥表型觀察、膠孢炭疽菌在植株內(nèi)表達(dá)量和侵染進(jìn)程檢測(cè)，表明超量表達(dá)SgPAL3增強(qiáng)了植株對(duì)炭疽菌的抗病性，暗示著柱花草SgPAL3基因在柱花草抗炭疽病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［7］。但是，目前有關(guān)SgPAL3基因功能在分子水平上的調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道，與SgPAL3基因互作蛋白也有待挖掘。

酵母單雜交（Yeast one-hybrid system，Y1H）是在酵母體內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子之間相互作用的技術(shù)［8］。目前，已通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)在煙草（Nicotiana tabacum）、水稻（Oryza sativa）等模式植物中篩選出可以調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄因子，但在柱花草中應(yīng)用該技術(shù)較少［9-10］。

為篩選與SgPAL3基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，解析柱花草PAL基因的分子調(diào)控機(jī)制，本研究從‘熱研5號(hào)柱花草（Stylosanthes guianensis ‘Reyan No.5）基因組中克隆SgPAL3基因的啟動(dòng)子序列，并對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域-2 000～0 bp，-1 500～0 bp序列分別構(gòu)建誘餌載體，利用酵母單雜交技術(shù)篩選并驗(yàn)證了與SgPAL3啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子。研究結(jié)果為深入研究SgPAL3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為柱花草抗病品種選育提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料及試劑

植物材料為苗齡1個(gè)月的‘熱研5號(hào)柱花草葉片。

菌種為膠孢炭疽菌強(qiáng)致病菌DZ-19和弱致病菌WC-02，由作者團(tuán)隊(duì)篩選保存［11］。

產(chǎn)物純化、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自諾唯贊生物科技（南京）股份有限公司。限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ，Xho Ⅰ和Bstb I購(gòu)于NEB（美國(guó)）有限公司，T4連接酶購(gòu)于Thermo Fisher（美國(guó)）有限公司。酵母培養(yǎng)所需的酵母氮源培養(yǎng)基（Yeast Nitrogen Base，YNB）購(gòu)于索萊寶科技（北京）有限公司。金擔(dān)子素（AbA）和缺陷型培養(yǎng)基（Do Supple ment/-Ura，SD/-Ura，Do Supplement/-Leu，SD/-Leu）購(gòu)自酷來(lái)搏科技（北京）有限公司。

柱花草cDNA文庫(kù)由歐易生物醫(yī)學(xué)科技（上海）有限公司構(gòu)建。酵母單雜交菌株Y1H Gold、誘餌載體pAbAi及Prey載體pGADT7均由歐易生物醫(yī)學(xué)科技（上海）有限公司提供，試驗(yàn)所用引物均由北京擎科生物科技有限公司完成（表1）。測(cè)序由楠山生物技術(shù)（?？冢┯邢薰就瓿伞?/p>

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 柱花草SgPAL3基因啟動(dòng)子的克隆及順式作用元件分析? 根據(jù)SgPAL3基因啟動(dòng)子序列，分別截取起始密碼子5方向上游1 500 bp和2 000 bp作為SgPAL3基因啟動(dòng)子候選序列，使用Oligo 7設(shè)計(jì)上下游引物并分別引入Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。提取‘熱研5號(hào)柱花草的基因組DNA作為模板，pAbAi-SgPAL3-A/B-F，pAbAi-SgPAL3-R為引物（表1），使用高保真DNA聚合酶2 × Phanta Max Master Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到SgPAL3基因啟動(dòng)子。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min，95℃ 15 s，53℃ 15 s，72℃ 80 s，32個(gè)循環(huán)。

利用在線分析軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/plantcare/html/），預(yù)測(cè)SgPAL3基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。

1.2.2? 誘餌載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化酵母Y1H Gold? 用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ酶對(duì)載體pAbAi和SgPAL3啟動(dòng)子的純化片段分別進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶在16℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆送至公司進(jìn)行測(cè)序。獲得誘餌載體pAbAi-SgPAL3，并將重組誘餌載體分別命名為pAbAi-SgPAL3-A，pAbAi-SgPAL3-B。

用Bstb I酶線性化誘餌載體pAbAi-SgPAL3-A，pAbAi-SgPAL3-B。將1 μg純化后的線性化載體轉(zhuǎn)入Y1H酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Ura平板上，28℃培養(yǎng)3～5 d后挑取單菌落，使用pAbAi-F/R（表1）為檢測(cè)引物進(jìn)行PCR鑒定。若擴(kuò)增出一段條帶約0.39 kb+insert size的片段，則表明誘餌載體成功整合到酵母Y1H Gold基因組中，即為誘餌菌株Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］。

1.2.3? 誘餌酵母菌株對(duì)AbA敏感性的檢測(cè)? 從SD/-Ura平板上挑取鑒定為陽(yáng)性的酵母單菌落，置于SD/-Ura液體培養(yǎng)基中28℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)；使用ddH2O重懸至OD600=0.002（即每100 μL重懸液中包含2 000個(gè)細(xì)胞），各取100 μL上述菌液涂布在含有不同AbA濃度的SD/-Ura培養(yǎng)基上，AbA質(zhì)量濃度分別為0，100，200，300，400，500 ng·mL-1，28℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)酵母菌落的生長(zhǎng)情況確定抑制誘餌菌株生長(zhǎng)所需的最小AbA質(zhì)量濃度。

1.2.4? 酵母cDNA文庫(kù)的構(gòu)建? 采用全株噴灑孢子懸浮液的方式對(duì)1月齡‘熱研5號(hào)柱花草分別噴灑膠孢炭疽菌DZ-19和WC-02，提取接種后0，24，48，60，96小時(shí)（hours post inoculation，hpi）的10種樣品RNA，并等量混勻，委托歐易生物醫(yī)學(xué)科技（上海）有限公司通過(guò)Gateway技術(shù)構(gòu)建酵母cDNA文庫(kù)。

1.2.5? 酵母單雜交cDNA文庫(kù)的篩選及測(cè)序分析? 根據(jù)歐易生物醫(yī)學(xué)科技（上海）有限公司提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酵母單雜篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)。將次級(jí)酵母文庫(kù)質(zhì)粒10 μg分別轉(zhuǎn)化到誘餌酵母菌株Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］感受態(tài)細(xì)胞里，取轉(zhuǎn)化后的重懸菌液100 μL，涂布到含有相應(yīng)濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，單克隆長(zhǎng)出至大小1～2 mm，初篩完成；將初篩平板上長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移到同樣的篩選培養(yǎng)基SD/-Leu/AbA*上，進(jìn)行二次篩選。挑取生長(zhǎng)較大的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，使用表1檢測(cè)引物3AD/T7進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物送至公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)合接種膠孢炭疽菌的柱花草轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析［4］及Nr同源物種注釋結(jié)果對(duì)其進(jìn)行功能注釋，并在CDD網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。

1.2.6? 候選轉(zhuǎn)錄因子的酵母單雜交驗(yàn)證? 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的轉(zhuǎn)錄本序列，獲得候選轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增候選轉(zhuǎn)錄因子的全長(zhǎng)，利用同源重組的方法構(gòu)建到pGADT7載體上，正反向引物序列見(jiàn)表1。

提取候選轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒，將誘餌酵母制備成感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)共轉(zhuǎn)的方式將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)中，使用3AD/T7（表1）為檢測(cè)引物進(jìn)行PCR鑒定；挑取陽(yáng)性克隆，接種于SD/-Leu液體培養(yǎng)基于28℃搖床擴(kuò)繁。使用ddH2O將菌液按照1∶10，1∶100，1∶1 000稀釋后，分別點(diǎn)于SD/-Leu和SD/-Leu/AbA*平板，倒置于28℃培養(yǎng)箱3～5 d，觀察生長(zhǎng)情況。

1.2.7? 候選基因qRT-PCR鑒定? 為了明確候選轉(zhuǎn)錄因子在接種膠孢炭疽菌后的表達(dá)特性，對(duì)1月齡‘熱研5號(hào)柱花草噴灑接種膠孢炭疽菌DZ-19，提取接種后0，24，48，60，72，96 hpi的樣品RNA，采用Vazyme公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，用Oligo 7設(shè)計(jì)目的基因的引物（表1），以UBCE1為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。采用2-△△Ct方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 柱花草SgPAL3基因的克隆和序列分析

以‘熱研5號(hào)柱花草葉片的DNA為模板，擴(kuò)增SgPAL3基因的啟動(dòng)子序列。結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增的條帶大小分別約為2 000 bp和1 500 bp。將所克隆的片段回收后連接到pAbAi載體上，挑選陽(yáng)性克隆送至公司進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的序列一致，相似性達(dá)100%。根據(jù)測(cè)序獲得的啟動(dòng)子序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE對(duì)SgPAL3啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件分析。表2結(jié)果表明，在SgPAL3啟動(dòng)子區(qū)中含有核心啟動(dòng)子元件TATA-box，CAAT-box，植物激素響應(yīng)元件ERE，TCA-element，ABRE，AAGAA-motif，光響應(yīng)元件Box-4，G-box，LAMP-element，環(huán)境脅迫響應(yīng)元件ARE，WUN-motif，分生組織表達(dá)調(diào)節(jié)元件CAT-box，細(xì)胞周期結(jié)合元件MSA-like以及MYB，MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。但是，僅在2 000 bp的SgPAL3啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件W-box。

2.2? 誘餌載體的構(gòu)建及酵母菌株的轉(zhuǎn)化

用載體引物對(duì)轉(zhuǎn)入誘餌載體的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，得到與目的基因大小一致的條帶，如圖2A所示。將對(duì)應(yīng)菌液送至公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的片段一致，表明上述誘餌載體構(gòu)建成功。

將構(gòu)建好的誘餌載體pAbAi-SgPAL3-A，pAbAi-SgPAL3-B用Bst BI單酶切鑒定，酶切后的質(zhì)粒與原質(zhì)粒的條帶大小存在差異，如圖2B所示，說(shuō)明成功獲得線性化載體。回收A中的線性化載體并轉(zhuǎn)入Y1H Gold酵母菌感受態(tài)細(xì)胞中，使用通用引物對(duì)單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，如圖2C所示，酵母單菌落中分別含有約2.39 kb（2.0 kb+0.39 kb）和一段約1.89 kb（1.5 kb+0.39 kb）的片段，說(shuō)明誘餌載體成功轉(zhuǎn)入酵母基因組，成功獲得了酵母誘餌菌株Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］。

2.3? AbA抗性篩選

挑取上述兩種酵母菌株的陽(yáng)性菌落，用ddH2O重懸細(xì)胞，直至OD600=0.002，分別涂布于含AbA濃度0，100，200，300，400，500 ng·mL-1的SD/-Ura培養(yǎng)基上。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)化菌株在100 ng·mL-1 AbA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，而在500 ng·mL-1 AbA培養(yǎng)基上完全停止生長(zhǎng)，說(shuō)明500 ng·mL-1可用于酵母單雜篩選。

2.4? 酵母cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與質(zhì)量檢測(cè)

采用接種膠孢炭疽菌后的柱花草葉片構(gòu)建了酵母cDNA文庫(kù)（圖4A），庫(kù)容量為1.20×107。隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，插入片段主要分布在750～2 000 bp，重組率為100%，結(jié)果如圖4B所示，說(shuō)明文庫(kù)質(zhì)量較好，且符合篩庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。

2.5? SgPAL3啟動(dòng)子片段與柱花草cDNA文庫(kù)的酵母單雜篩選

在SD/-Leu/AbA（500 ng·mL-1）平板初篩中，Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］共獲得198個(gè)的陽(yáng)性酵母菌落，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］共獲得68個(gè)陽(yáng)性酵母菌落。劃線二次培養(yǎng)后，使用通用引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆的PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送至公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖5所示，Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］共得到132條序列，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］共得到42條序列。

在NCBI上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，并結(jié)合柱花草響應(yīng)炭疽菌侵染的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和Nr同源物種的注釋信息，共獲得了83個(gè)候選基因。將候選基因的核酸序列在CDD網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，共篩選到3個(gè)基因具有典型的DNA結(jié)合域，預(yù)測(cè)為轉(zhuǎn)錄因子（表3），分別為T(mén)rihelix家族的ASIL2、HD-Zip家族的HAT5和ZF-HD家族的ZHD8。

2.6? 酵母單雜交驗(yàn)證

為了驗(yàn)證SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8是否與SgPAL3-A啟動(dòng)子存在互作關(guān)系，將誘餌載體SgPAL3-A分別與3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建的酵母表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化后觀察酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。結(jié)果如圖6所示，在SD/-Leu培養(yǎng)基上，誘餌酵母細(xì)胞均能生長(zhǎng)，說(shuō)明AD質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入誘餌酵母細(xì)胞；在添加了500 ng·mL-1 AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上，陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子均能正常生長(zhǎng)，陰性對(duì)照不生長(zhǎng)，表明SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8與SgPAL3-A啟動(dòng)子區(qū)存在互作關(guān)系。

2.7? 候選基因熒光定量表達(dá)分析

為確定轉(zhuǎn)錄因子SgASIL2、SgHAT5和SgZHD8是否響應(yīng)炭疽菌的侵染，以接種膠孢炭疽菌后0，24，48，60，72和96 hpi‘熱研5號(hào)柱花草葉片的cDNA為模板，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖7所示，在接種膠孢炭疽菌后，SgASIL2的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)整體下調(diào)的趨勢(shì)，SgHAT5和SgZHD8的相對(duì)表達(dá)量則呈現(xiàn)先降低、后升高、再降低的趨勢(shì)，并在60 hpi達(dá)到峰值。以上結(jié)果表明，SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8均對(duì)炭疽菌的侵染有響應(yīng)，推測(cè)它們可能為SgPAL3啟動(dòng)子響應(yīng)炭疽菌的調(diào)控因子。

3? 討論

研究發(fā)現(xiàn)，大量的轉(zhuǎn)錄因子參與植物苯丙烷的代謝調(diào)控，不同類型的轉(zhuǎn)錄因子可分別結(jié)合到PAL，C4H及4CL等基因的啟動(dòng)子區(qū)，激活或抑制其表達(dá)［9，12］。轉(zhuǎn)錄調(diào)控依賴于順式作用元件和反式作用因子的協(xié)調(diào)作用，是植物基因表達(dá)調(diào)控中的重要環(huán)節(jié)［13-14］。順式作用元件具有序列和功能保守型，如TCA-element，ABRE，TGACG-motif是植物激素生長(zhǎng)素、脫落酸、茉莉酸甲酯的響應(yīng)元件，MBS，ARE，LTR是植物干旱響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)、低溫脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件［15］。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與各種生物及非生物脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件相互作用，調(diào)控下游逆境脅迫應(yīng)答靶基因的表達(dá)，使植物適應(yīng)各種逆境［16］。如植物轉(zhuǎn)錄因子可以與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，激活或抑制其表達(dá)，從而參與激素介導(dǎo)的抗病反應(yīng)［17］。SgPAL3在柱花草接種炭疽菌后顯著上調(diào)，超量表達(dá)SgPAL3的植株對(duì)炭疽菌的抗病性增強(qiáng)，預(yù)示SgPAL3是柱花草抗炭疽菌的正調(diào)控因子［18］。本研究對(duì)SgPAL3基因上游2 000 bp和1 500 bp啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)（表2），表明其可能在植物抵御病原菌侵染、生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)激素信號(hào)分子的刺激等生物過(guò)程中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步探究SgPAL3受哪些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，本研究通過(guò)構(gòu)建響應(yīng)炭疽菌侵染的酵母cDNA文庫(kù)、單雜交技術(shù)篩庫(kù)和點(diǎn)對(duì)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（圖4～6），證明了SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8與SgPAL3的2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域存在互作關(guān)系。

ASIL2屬于Trihelix家族，該基因家族既調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，又能幫助植物響應(yīng)逆境脅迫［19-20］。Ruiz等［21］研究發(fā)現(xiàn)，ASIL1及其同源基因ASIL2可能參與營(yíng)養(yǎng)階段對(duì)某些生物和非生物脅迫的反應(yīng)。ASIL2基因負(fù)調(diào)控番茄（Solanum lycopersicum）對(duì)干旱和鹽脅迫的適應(yīng)性［22］。HAT5屬于HD-Zip家族，番茄中過(guò)表達(dá)PsHAT5增強(qiáng)了番茄的耐旱耐鹽性和低溫敏感性［23］，吉林人參（Jilin Ginseng）中HD-Zip家族的表達(dá)模式存在時(shí)空特異性，目前無(wú)生物脅迫方面的報(bào)道［24］。ZHD8屬于ZF-HD家族，該基因家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育、非生物響應(yīng)和生物脅迫過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用［25］。Wang等［26］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄（Vitis vinifera L.）在接種白粉菌（Erysiphe necator）后，多數(shù)VvZHD基因表達(dá)下調(diào)，如VvZHD1，4，8和12。黃瓜在接種白粉菌（Sphaerotheca fuliginea）和霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis）后，CsZHD家族出現(xiàn)了差異表達(dá)，CsZHD8和CsZHD4在接種后顯示出先降低、后升高、再降低的表達(dá)模式［27］。本研究通過(guò)熒光定量實(shí)驗(yàn)，比較了不同時(shí)間處理后的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，在接種炭疽菌后，SgASIL2在接種炭疽菌后顯著下調(diào)表達(dá)（圖7A），預(yù)示其在柱花草抗炭疽菌過(guò)程中可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，與向小雪［22］的結(jié)果類似。SgHAT5（圖7B）和SgZHD8（圖7C）在接種后呈現(xiàn)先下調(diào)、后上調(diào)、再下調(diào)的趨勢(shì)，表達(dá)趨勢(shì)與黃瓜CsZHD4，CsZHD8，葡萄VvZHD8相似，預(yù)示本研究中SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8參與了柱花草抗炭疽菌的過(guò)程。在60 hpi SgHAT5（圖7B）和SgZHD8（圖7C）的表達(dá)量達(dá)到峰值，可能與響應(yīng)炭疽菌的模式有關(guān)。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8的相對(duì)表達(dá)量響應(yīng)炭疽菌的侵染而發(fā)生變化，且SgPAL3基因可與轉(zhuǎn)錄因子SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8結(jié)合，但SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8通過(guò)調(diào)控SgPAL3參與柱花草抗炭疽菌的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4? 結(jié)論

本研究通過(guò)構(gòu)建柱花草的cDNA酵母文庫(kù)、酵母單雜交篩庫(kù)和點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了3個(gè)可與SgPAL3基因啟動(dòng)子區(qū)域互作的轉(zhuǎn)錄因子：Trihelix家族的SgASIL2，HD-Zip家族的SgHAT5和ZF-HD家族的SgZHD8。熒光定量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了柱花草中，SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8均響應(yīng)炭疽菌的侵染。研究結(jié)果為進(jìn)一步解析SgPAL3響應(yīng)炭疽菌侵染的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］張世子，楊麗云，高靜，等. 柱花草響應(yīng)炭疽菌侵染的差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（3）：699-709

［2］鄒曉燕，王林杰，黃杰，等. 柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆與表達(dá)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（6）：1388-1395

［3］王俐媛，王堅(jiān)，丁西朋，等. 3種圭亞那柱花草根系分泌物對(duì)雜草幼苗生長(zhǎng)的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（6）：1500-1508

［4］JIANG L Y，WU P P，YANG L Y，et al. Transcriptomics and metabolomics reveal the induction of flavonoid biosynthesis pathway in the interaction of Stylosanthes-Colletotrichum gloeosporioides［J］. Genomics，2021，113（4）：2702-2716

［5］耿曉?shī)?，朱宇林，蒙柳密，? 牛大力苯丙氨酸解氨酶的克隆和生物信息分析［J］. 分子植物育種，2022，20（5）：1514-1521

［6］DONG N，LIN H. Contribution of phenylpropanoid metabolism to plant development and plant environment interactions［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（1）：180-209

［7］萬(wàn)敉町. 膠孢炭疽菌侵染柱花草和擬南芥的分子檢測(cè)技術(shù)研究［D］. 海口：海南大學(xué)，2022：38-41

［8］王雪，王盛昊，于冰. 轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作分析技術(shù)及其在植物應(yīng)答逆境脅迫中的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2021，37（33）：112-119

［9］余婧，楊慧，余世洲，等. 煙草NtCBT基因啟動(dòng)子酵母單雜誘餌載體構(gòu)建及互作蛋白篩選［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2022，38（10）：73-79

［10］李濯雪. 利用酵母單雜交方法對(duì)OsHsfB2c啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的篩選［D］. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：34

［11］GAO M Z，WAN M T，YANG L Y，et al. Molecular and physiological characterization of Arabidopsis-Colletotrichum gloeosporioides pathosystem［J］. Plant Pathology，2021，70（5）：1168-1179

［12］NING Y，WANG G L. Breeding plant broad-spectrum resistance without yield penalties［J］. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America，2018，115（12）：2859-2861

［13］XIE Z L，NOLAN T M，JIANG H，et al. AP2/ERF Transcription Factor Regulatory Networks in Hormone and Abiotic Stress Responses in Arabidopsis［J］. Frontiers in Plant Science，2019（10）：228

［14］劉寬，李劍，段鈺晶，等. 植物非生物逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子研究進(jìn)展［J/OL］.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220410.2211.016.html，2022-04-12/2023-08-14

［15］張雪，程荔書(shū)，張軍，等. 高等植物不同類型啟動(dòng)子及其相關(guān)順式元件研究進(jìn)展［J］. 高師理科學(xué)刊，2023，43（4）：60-67

［16］WANG Y，XU W，CHEN Z X，et al. Gene structure，expression pattern and interaction of Nuclear Factor-Y family in castor bean （Ricinus communis）［J］. Planta，2018，247（3）：559-572

［17］劉東曉，王幼平，吳健. WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物激素介導(dǎo)的抗病途徑中的作用［J/OL］.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220512.0937.010.html，2022-05-12/2023-08-14

［18］王薈. 柱花草與炭疽菌互作的生理響應(yīng)及苯丙氨酸解氨酶基因SgPAL1的功能研究［D］. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2018：55-56

［19］BUBNA G A，LIMA R B，ZANARDO D Y，et al. Exogenous caffeic acid inhibits the growth and enhances the lignification of the roots of soybean （Glycine max）［J］. Plant Physiol，2011，168（14）：1627-1633

［20］王震，馬偉. 中藥大青葉、板藍(lán)根基原植物菘藍(lán)Trihelix基因家族鑒定及非生物脅迫下表達(dá)模式分析［J］. 中華中醫(yī)藥雜志，2023，38（5）：2109-2115

［21］RUIZ K A，PELLETIER J M，WANG Y C，et al. A reevaluation of the role of the ASIL trihelix transcription factors as repressors of the seed maturation program［J］. Plant Direct. 2021，5（10）：e345

［22］向小雪. Trihelix轉(zhuǎn)錄因子SlASIL2在番茄生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫中的功能研究［D］. 重慶：重慶大學(xué)，2022：97-98

［23］LIU X Y，LI A，WANG S S，et al. Overexpression of Pyrus sinkiangensis HAT5 enhances drought and salt tolerance，and low-temperature sensitivity in transgenic tomato［J］. Frontiers in Plant Science，2022（13）：1036254

［24］李俐. 吉林人參HD-Zip基因家族的系統(tǒng)分析及PgHB14-2基因轉(zhuǎn)化番茄的研究［D］. 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：31-32

［25］付鴻博，李杰，楊永超，等. 石榴ZF-HD基因家族鑒定與分析［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，51（6）：119-125

［26］WANG H，YIN X J，LI X Q，et al. Genome-wide identification，evolution and expression analysis of the grape （Vitis vinifera L.） zinc finger-homeodomain gene family［J］. International Journal of Molecular Sciences，2014，15（4）：5730-5748

［27］LAI W，ZHU C X，HU Z Y，et al. Identification and Transcriptional Analysis of Zinc Finger-Homeodomain （ZF-HD） Family Genes in Cucumber［J］. Biochemical Genetics，2021，59（4）：884-901

（責(zé)任編輯? 劉婷婷）