MsWRKY33轉錄調控MsACS2影響紫花苜蓿耐鹽性的研究

李心 武敬也 陳菲兒 樊璐 馬琳 王學敏

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.006

引用格式：

李? 心， 武敬也， 陳菲兒，等.MsWRKY33轉錄調控MsACS2影響紫花苜蓿耐鹽性的研究［J］.草地學報，2024，32（1）：54-65

LI Xin， WU Jing-ye， CHEN Fei-er，et al.Effects of Transcriptional Regulation of MsACS2 by MsWRKY33 on Salt Tolerance of Alfalfa［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（1）：54-65

收稿日期：2023-05-29；修回日期：2023-10-29

基金項目：國家自然科學基金（31872410）；財政部和農業(yè)農村部：國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系（CARS-34）；科技部、財政部、國家科技資源共享服務平臺（NCGRC-2023-63）資助

作者簡介：

李心（1998-），女，漢族，河南焦作人，碩士研究生，主要從事飼草遺傳育種方向研究，E-mail：18513988633@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：wangxuemin@caas.cn;malin@caas.cn

摘要：乙烯作為重要的植物激素之一，在植物逆境脅迫應答中發(fā)揮重要作用。ACS基因是乙烯合成過程中的關鍵限速酶（ACC合成酶）基因，本研究通過探究紫花苜蓿MsWRKY33轉錄因子對ACS基因的調控關系，為MsWRKY33參與紫花苜蓿耐鹽脅迫響應的具體調控機制奠定理論基礎。利用同源克隆、載體構建、酵母單雜交、酵母雙雜交、qRT-PCR等技術，驗證MsWRKY33對AtACS2和MsACS2的轉錄調控，并對鹽脅迫下轉基因株系中MsACS2表達模式進行分析。結果顯示：MsWRKY33轉錄因子可以與W-box元件特異性結合，且對AtACS2和MsACS2具有轉錄調控作用；MsWRKY33轉基因株系中MsWRKY33基因的表達量顯著高于對照，轉基因株系中MsACS2的表達是在MsWRKY33基因大量表達后呈上升趨勢，進一步說明紫花苜蓿MsACS2基因的表達可能受MsWRKY33轉錄因子的正向調控。因此，紫花苜蓿受到鹽脅迫時可誘導MsWRKY33的表達，MsWRKY33轉錄因子通過正向調控MsACS2表達，可能影響乙烯合成，從而影響紫花苜蓿的鹽脅迫響應。

關鍵詞：紫花苜蓿；酵母單雜交；MsWRKY33；MsACS2；耐鹽性

中圖分類號：S541.9??? 文獻標識碼：A????? 文章編號：1007-0435（2024）01-0054-12

Effects of Transcriptional Regulation of MsACS2 by

MsWRKY33 on Salt Tolerance of Alfalfa

LI Xin， WU Jing-ye， CHEN Fei-er， FAN Lu， MA Lin*， WANG Xue-min*

（Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

Abstract：Ethylene，as one of the important plant hormones，plays an important role in plant stress response. The ACS gene is a key rate limiting enzyme （ACC synthase） gene in the ethylene synthesis process. In this study，we laid a theoretical foundation for understanding the specific regulatory mechanism of MsWRKY33 participating in salt-tolerant response of alfalfa by exploring the regulatory relationship of MsWRKY33 transcription factor on ACS gene. We used homologous cloning，vector construction，Y1H，Y2H，qRT-PCR and other techniques to verify the transcriptional regulation of MsWRKY33 on AtACS2 and MsACS2，meanwhile，analyzed the expression pattern of MsACS2 in transgenic lines under salt stress. The results showed that the MsWRKY33 transcription factor could specifically bind to the W-box element and had transcriptional regulatory effects on AtACS2 and MsACS2;The expression level of MsWRKY33 gene in the transgenic lines was significantly higher than that in the control. The expression of MsACS2 in transgenic lines showed an increasing trend after the large amount of MsWRKY33 gene expression，further indicating that the expression of MsACS2 gene in alfalfa might be positively regulated by the MsWRKY33 transcription factor. The results indicated that the expression of MsWRKY33 could be induced when alfalfa was subjected to salt stress. The MsWRKY33 transcription factor might affect ethylene synthesis and salt stress response of alfalfa by positively regulating the expression of MsACS2.

Key words：Alfalfa; Yeast One-Hybridization technique; MsWRKY33; MsACS2; Salt tolerance

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）有“牧草之王”的美稱，是全國乃至世界上種植面積最大的牧草，其產量和品質兼優(yōu)，營養(yǎng)價值極高，具有改良土壤鹽漬化［1-2］、豐富土壤有機質等功效。土壤鹽漬化是影響作物產量和品質的主要非生物脅迫因子之一［3］，目前，全世界超過1.0×109 hm2的土地受到鹽堿地的影響，而中國的鹽堿土面積也達到了1.0×108 hm2［4］。我國紫花苜蓿的產業(yè)發(fā)展深受土壤鹽漬化的制約［5］。

乙烯被稱為植物應激激素，植物在受到鹽脅迫時體內會產生大量乙烯［6-7］。植物激素乙烯（ethylene）是1種氣體小分子（C2H4），不僅參與植物的眾多發(fā)育過程，如種子萌發(fā)、細胞伸長、組織分化、葉片和花的衰老脫落、果實成熟等［8-9］，還參與植物對生物脅迫和非生物脅迫等多種應答反應［10-12］。乙烯合成有兩個關鍵步驟：第1步是ACC合成酶（ACS）將s-腺苷-甲硫氨酸（SAM）轉化為1-氨基-環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC），第2步是ACC氧化酶（ACO）將ACC氧化裂解并生成乙烯［6，19-20］。ACS被認為是乙烯生物合成過程中的關鍵限速酶，所以ACC合成酶的活性直接關系到乙烯的含量，ACS的調控對乙烯的生物合成至關重要。擬南芥ACS5和ACS7基因在鹽脅迫下均能受到顯著誘導［5］，煙草（Nicotiana tabacum L.）NtACS1基因在鹽脅迫下也能被誘導表達［15］，乙烯和乙烯前體物ACC能顯著增加擬南芥的耐鹽性［16］。乙烯可通過促進ROS的清除來調節(jié)植物對鹽脅迫的應答，如乙烯通過影響RBOHF介導的ROS和Na+/K+平衡來提高擬南芥的耐鹽性［17］。乙烯處理或EIN3的活化可以通過直接調控POD的表達來增強過氧化物酶的活性，從而阻止過量ROS的積累，提高了植物對鹽脅迫的耐受性［18］?；蜣D錄水平的調控是植物應答各種信號刺激的重要過程，當植物受到脅迫時，會產生一系列的信號激活特定轉錄因子與順式作用元件結合從而啟動基因的表達使植物對逆境做出反應［21］。

WRKY轉錄因子作為最大的轉錄因子家族之一，參與植物體內多種信號轉導過程［22］；WRKY轉錄因子蛋白家族所有成員都含有WRKY結構域，包括N端“WRKYGQK”序列和C端鋅指型結構序列［23，24］，根據(jù)WRKY結構域的數(shù)量和鋅指結構的類型將WRKY轉錄因子分為3類［25］。在幾乎所有受到WRKY轉錄因子蛋白調控的基因啟動子區(qū)域中都能發(fā)現(xiàn)（T）（T）TGAC（C/T）這一保守結構，即為W-box。W-box是WRKY轉錄因子與目標基因特異性結合的區(qū)域，高度保守［24］。ACS2基因受到WRKY轉錄因子的調控，如Li等［26］通過ChIP-qPCR實驗證明在擬南芥中WRKY33轉錄因子通過與ACS2和ACS6的啟動子中的W-box結合從而調控ACS基因的表達；Chen等［27］通過ChIP實驗證明在擬南芥中WRKY8轉錄因子可以與ACS6啟動子中的W-box結合。

本課題在前期的研究中發(fā)現(xiàn)了1個包含2個WRKY結構域的紫花苜蓿WRKY33轉錄因子，該基因受鹽脅迫誘導表達并過量累積，研究顯示其可以通過與目標基因啟動子區(qū)的W-box特異性結合，從而調控下游基因的表達［28］；本研究前期通過構建過表達載體pCAMBIAI1300-MsWRKY33，利用農桿菌介導法獲得過表達MsWRKY33紫花苜蓿株系，為了深入解析MsWRKY33參與紫花苜蓿耐鹽脅迫的分子機制，我們利用RNA-seq技術對正常條件和鹽脅迫條件下的非轉基因（對照）和轉基因株系進行了轉錄組分析。其中發(fā)現(xiàn)了1個ACS2類基因被顯著上調。因此我們推測MsWRKY33可能通過轉錄調控激活ACS2基因的表達，從而影響植物體內乙烯的合成，進而可能參與紫花苜蓿對鹽脅迫的響應。在植物受到鹽脅迫時會誘導ACS基因表達以產生大量的乙烯，目前已有研究證明在擬南芥中WRKY轉錄因子可以通過與ACS基因啟動子中W-box結合以誘導ACS的表達，如AtWRKY33可調控ACS2和ACS6基因的表達［26］，AtWRKY8可調控ACS6的表達［27］，AtWRKY29可調控ACS基因的表達［29］，但在紫花苜蓿中卻鮮有報道。我國紫花苜蓿產業(yè)深受土壤鹽漬化制約，因此了解MsWRKY33對ACS基因的轉錄調控途徑對于解析MsWRKY33轉錄因子參與紫花苜蓿耐鹽脅迫的具體調控機制具有重要意義，也為紫花苜蓿耐鹽性分子育種奠定了理論基礎。本研究利用酵母單雜交技術驗證MsWRKY33對ACS2的轉錄調控，旨在探究紫花苜蓿MsWRKY33轉錄因子調控MsACS2的機制，為紫花苜蓿耐鹽性調控的分子機制解析奠定理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料及試劑

紫花苜蓿‘中苜1號（Medicago sativa L.‘Zhongmu No.1）由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所楊青川研究員惠贈；轉基因MsWRKY33紫花苜蓿L3和L4是由本課題前期通過構建pCAMBIA1300-MsWRKY33過表達載體并利用農桿菌介導的方法轉化‘中苜1號所獲得的MsWRKY33紫花苜蓿轉基因株系，保存于本實驗室。KOD-Plus，TaKaRa LA Taq酶、總RNA提取試劑盒、FastKing1步法除基因組cDNA第1鏈合成預混試劑盒均購自北京天根生化科技公司，零背景pTOPO-Blunt Simple平末端克隆試劑盒、Axyprep DNA凝膠回收試劑盒、EZ-HiFi無縫克隆試劑盒、Dh5α感受態(tài)和限制性內切酶購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

酵母單雜交所用誘餌載體pHiSi、獵物載體pGADT7和酵母YM4271保存于中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，各種酵母培養(yǎng)基均購自成都遠諾天成科技有限公司，Y1HGold感受態(tài)細胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

試驗中所用引物的合成和測序工作由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2? AtACS2和MsACS2基因啟動子的克隆及順式作用元件分析

在擬南芥數(shù)據(jù)庫中（https：//www.arabidopsis.org/）查詢AtACS2基因序列，使用Primer 5.0軟件設計克隆引物AtACS2-PRO-F和AtACS2-PRO-R（表1），使用LA Taq酶以擬南芥DNA為模板進行PCR擴增；根據(jù)AtACS2基因序列在紫花苜蓿數(shù)據(jù)庫（https：//www.alfalfatoolbox.org/）中查找紫花苜蓿的同源基因MsACS2，使用Primer 5.0軟件設計基因啟動子克隆引物MsACS2-PRO-F和MsACS2-PRO-R（表1），使用LA Taq酶以紫花苜?！熊?號為模板進行PCR擴增。將擴增出的基因片段進行純化回收并構建T載體，送至北京擎科生物科技有限公司測序。

將獲得的AtACS2，MsACS2基因啟動子序列利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）在線網站進行順式作用元件分析。

1.3? 誘餌載體的構建

設計含有EcoRI和SacI酶切位點的引物W-box-F/R，該引物包含3個串聯(lián)重復的W-box（TTGACT）；根據(jù)AtACS2基因啟動子序列利用Primer5.0軟件設計含有EcoRⅠ和SacⅠ酶切位點的引物pHiSi-AtACS2-F/R，根據(jù)MsACS2基因啟動子序列利用Primer 5.0軟件設計含有XmaI和XhoI酶切位點的引物pAbAi-MsACS2-F/R（表1）。使用KOD-Plus酶以pTOPO-AtACS2和pTOPO-MsACS2載體為模板進行PCR擴增。將pHiSi載體用EcoRⅠ和SacⅠ酶進行雙酶切，pAbAi載體用XmaI和XhoI酶進行雙酶切，將得到的片段和線性化載體進行純化回收，使用EZ-HiFi無縫克隆試劑盒進行連接，轉化Dh5α，涂布于LB（Amp）抗性平板，經菌液PCR驗證出陽性克隆并送擎科北京公司生物科技有限測序。

1.4? 獵物載體pGADT7-MsWRKY33的構建

提取紫花苜?！熊?號的總RNA，將RNA反轉錄為cDNA。根據(jù)紫花苜蓿MsWRKY33（GenBank登錄號KP642130.1）的cDNA序列利用Primer5.0軟件設計含有BamHⅠ和SacⅠ酶切位點的引物AD-MsWRKY33-F/R（表1），以紫花苜蓿總cDNA序列為模板進行PCR擴增，pGADT7載體用BamHⅠ和SacⅠ進行雙酶切，將得到的片段和線性化載體進行純化回收后使用EZ-HiFi無縫克隆試劑盒進行連接，轉化Dh5α，涂布于LB（Amp）抗性板，經菌液PCR驗證陽性克隆并送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.5? 酵母單雜交驗證MsWRKY33和W-box的結合關系

將pHiSi和pHiSi-W-box用XhoI線性化后轉入YM4271酵母菌株并涂布于SD/-His缺性培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～7天后，挑取平板上陽性酵母單克隆接入至液體培養(yǎng)基SD/-His中，30℃ 200 rpm培養(yǎng)至OD600＝0.8，然后將菌液依次稀釋10-1，10-2分別點至不同濃度的3-AT的SD/-His平板上，篩選可以抑制其自激活性的3-AT濃度。

按照表2將獵物載體和誘餌載體的不同組合轉入酵母YM4271中，涂布于SD/-Leu/-Ura選擇培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3～7天后，挑取酵母單克隆接入液體培養(yǎng)基SD/-Leu/-Ura中，30℃ 200 rpm培養(yǎng)至OD600＝0.8，將菌液依次稀釋10-1，10-2點至SD/-Leu/-Ura/-His平板（含可以抑制其自激活性的合適濃度的3-AT），觀察酵母生長狀況并拍照。

1.6? 酵母單雜交驗證MsWRKY33和AtACS2啟動子的結合關系

將pHiSi-AtACS2（1 ng，使用前用XhoI線性化）用醋酸鋰-PEG法轉入酵母菌株YM4271，具體方法同1.5，然后將成功轉入質粒的酵母菌液依次稀釋10-1，10-2并點至不同濃度3-AT的SD/-His平板上，篩選其可以抑制其自激活的3-AT濃度。

將pGADT7，pGADT7-MsWRKY33和pHiSi，pHiSi-AtACS2以兩兩組合的方式共轉酵母YM4271，將成功轉入質粒的酵母酵母菌液依次稀釋10-1，10-2點至SD/-Leu-His-Ura（加入能夠抑制其相應載體本底表達的合適濃度的3-AT），30℃倒置培養(yǎng)3～7天，觀察其酵母生長狀況。

1.7? 酵母單雜交驗證MsWRKY33和MsACS2啟動子的結合關系

將pAbAi-MsACS2質粒5 μg用BstBI酶切4～6 h，用膠回收試劑盒進行純化回收，利用醋酸鋰-PEG法轉化至Y1HGold感受態(tài)細胞（購自北京莊盟生物科技有限公司）。然后將成功轉入質粒的酵母菌液依次稀釋10-1，10-2并點至不同濃度AbA SD/-Ura平板上，篩選可以抑制其自激活的AbA濃度。

將含有pAbAi-MsACS2的Y1HGold酵母菌株制成感受態(tài)細胞，然后將pGADT7和pGADT7-MsWRKY33利用醋酸鋰-PEG法轉入酵母感受態(tài)中，待缺性平板上長出3 mm酵母單克隆即為含pAbAi-MsACS2，pGADT7和pAbAi-MsACS2，pGADT7-MsWRKY33質粒的酵母菌株，然后將菌液依次稀釋10-1，10-2并點至含有可以抑制其本底表達的合適濃度的AbA SD/-Ura-Leu平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～7天，觀察酵母生長狀況并拍照。

1.8? NaCl處理下的下游基因表達量分析

該課題前期通過構建過表達載體pCAMBIA1300-MsWRKY33，并利用農桿菌介導法獲得過表達MsWRKY33紫花苜蓿株系L3和L4。取CK（非轉基因株系），L3和L4（轉基因株系）植株生長頂端葉片數(shù)片放于液氮冷凍并提取RNA，再將RNA反轉錄為cDNA，將得到的cDNA用無菌水進行稀釋，使cDNA的終濃度至10 μg·μL-1，利用Primer 5.0軟件設計特異性引物qMsWRKY33-F/R和Msactin-F/R（表1）。通過qRT-PCR對該課題前期保存的轉基因MsWRKY33紫花苜蓿株系L3和L4進行基因表達量鑒定。

將MsWRKY33轉基因株系（L3，L4）和非轉基因株系（‘中苜1號）扦插擴繁，用塑料蓋子覆蓋3天后揭蓋，等待生長3～4周后單株分苗，放置人工氣候培養(yǎng)室中培養(yǎng)，刈割3～4次后選取長勢一致的株系，統(tǒng)一澆200 mM NaCl溶液，在鹽處理后的0，3，6，9，12，24和36 h對植株地上生長部分的葉片進行取樣，每個時間點3次重復，液氮速凍，放于-80℃保存。

根據(jù)MsACS2和MsWRY33序列信息，設計qMsWRKY33-F/R，qMsACS2-F/R特異引物（表1）。按照總RNA提取試劑盒說明書提取樣本RNA，利用FastKing1步法除基因組cDNA第1鏈合成預混試劑盒將RNA反轉為cDNA。RT-PCR以cDNA（10 μg·μL-1）為模板，用GenStar公司的熒光定量試劑進行qRT-PCR擴增。以紫花苜蓿MsActin為內參基因，利用qRT-PCR法檢測MsACS2和MsWRKY33在轉基因株系和對照株系中的表達模式。擴增體系為：2×SYBR qPCR Mix 10 μL，F(xiàn)引物0.4 μL，R引物0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL；反應程序為：95℃預變性，60℃ 30 s，40個循環(huán)，分別設3個生物學重復，基因表達量的計算使用2-ΔΔCt法。

2? 結果與分析

2.1? AtACS2和MsACS2基因啟動子的克隆及其啟動子中的順式作用元件分析

在擬南芥網站（https：//www.arabidopsis.org/）上查詢基因AtACS2的啟動子序列，在紫花苜蓿數(shù)據(jù)庫中（https：//www.alfalfatoolbox.org/）查找AtACS2的同源基因MsACS2序列，利用Premier 5.0軟件設計基因啟動子區(qū)域片段擴增引物（表1），經過PCR擴增后有清晰的條帶（圖1），且條帶位置符合片段大?。ˋtACS2：2 013 bp；MsACS2：1 283 bp）。將擴增的條帶進行切膠回收，膠回收后與pTOPO—Blunt-Simple載體連接，轉化Dh5α感受態(tài)，挑選陽性克隆經測序均連接成功。

為了確定AtACS2和MsACS2潛在的生物學功能，將AtACS2和MsACS2基因啟動子序列使用PlantCARE在線網站對基因啟動子中的順式作用元件進行預測（表3，表4）。兩個基因的啟動子中除了含有CAAT-box和TATA-box啟動子必備核心元件、脫落酸響應元件ABRE和MYB識別元件外，還包括許多與植物抗逆有關的重要元件如GT1-motif防御應激元件TC-rich repeats，SA誘導元件As1/ocs，最重要的，包含能與MsWRKY33轉錄因子特異性結合的W-box元件，這說明AtACS2和MsACS2基因可能參與植物對逆境脅迫的響應，且這種響應可能受到WRKY轉錄因子的調控。

2.2? 同源基因AtACS2，MsACS2蛋白序列比對

根據(jù)AtACS2基因序列在紫花苜蓿數(shù)據(jù)庫中查找紫花苜蓿的同源基因MsACS2，使用DNAMAN軟件對AtACS2和MsACS2基因的蛋白序列進行對比，AtACS2和MsACS2基因的蛋白序列相似度較高，AtACS2和MsACS2在氨基酸水平上相似度高達53.9％，說明AtACS2和MsACS2可能具有相似的生物學功能（圖2）。

2.3? 誘餌載體和獵物載體的構建

分別挑取pHiSi-AtACS2，pABAi-MsACS2和pGADT7-MsWRKY33單克隆菌斑進行菌液PCR驗證，凝膠電泳結果顯示擴增出的DNA片段大小與AtACS2，MsACS2和MsWRKY33基因片段大小相吻合（圖3），經測序與序列對比分析后證明重組載體構建成功。

2.4? MsWRKY33與W-box結合活性分析

WRKY轉錄因子可以與靶基因啟動子區(qū)域的W-box特異性結合，調控下游基因的表達，為證明MsWRKY33這一功能，本研究利用酵母單雜交技術開展了兩者的結合活性分析。首先將W-box序列TTGACT設計合成3個串聯(lián)重復序列，連接至pHiSi載體，并將構建成功的pHiSi-W-box載體轉化至YM4271酵母感受態(tài)，將轉化成功后的菌液點至不同濃度的3-AT SD/-His平板上，篩選可以抑制其本底表達的3-AT濃度，如圖所示（圖4a），菌液在3-AT濃度≤100 mM時可以正常生長，但在濃度達到150 mM后不能生長，因此確定可以抑制本底表達的3-AT濃度為150 mM。

進而，將pHiSi-W-box和pGADT7-MsWRKY33共轉化至酵母YM4271，同時設置陰性對照組合：pHiSi+pGADT7，pHiSi+pGADT7-MsWRKY33，pHiSi-W-box+pGADT7，待轉化成功后將酵母菌液點至含150 mM 3-AT濃度的SD/-His-Leu-Ura平板上。pGADT7-MsWRKY33與pHiSi-w-box共轉化的酵母可以生長，而陰性對照組pHiSi+pGADT7，pHiSi-W-box+pGADT7，pHiSi+pGADT7-MsWRKY33酵母均無法生長。說明MsWRKY33轉錄因子能夠與W-box順式作用元件特異性結合（圖4b）。

2.5? MsWRKY33與下游基因AtACS2啟動子的結合活性分析

將pHiSi和pHiSi-ACS2轉入酵母YM4271，將轉化成功的酵母菌液點至不同濃度的3-AT SD/-His板上，篩選可以抑制其本底表達的3-AT濃度。結果顯示，能夠抑制pHiSi，pHiSi-ACS2本底表達的3-AT濃度分別為160 mM和80 mM（圖5a）。再將pHiSi-ACS2與pGADT7-MsWRKY33共轉至酵母YM4271，并同時將陰性對照組合：pHiSi+pGADT7，pHiSi+pGADT7-MsWRKY33，pHiSi-ACS2+pGADT7共轉至酵母YM4271，將轉化成功的酵母菌液點至加入其對應能夠抑制其本底表達的合適濃度3-AT的SD-/His-Leu-Ura缺性培養(yǎng)基上，觀察酵母生長情況。結果顯示，轉化組合pHiSi-ACS2+ pGADT7-MsWRKY33的酵母可以正常生長，而其余對照均無法生長（圖5b），說明MsWRKY33轉錄因子可以與AtACS2的啟動子特異性結合，MsWRKY33轉錄因子對AtACS2具有轉錄調控作用。

2.6? MsWRKY33與下游基因MsACS2啟動子的結合活性分析

將pABAi-MsACS2轉入Y1HGold酵母菌株，將轉化成功的酵母菌液點至含不同濃度AbA的SD/-Ura平板上，篩選其可以抑制其本底表達的AbA濃度為600 ng·mL-1；再將pGADT7，pGADT7-MsWRKY33和pABAi，pABAi-MsACS2質粒以兩兩組合的方式共轉化Y1HGold酵母菌株，將轉化成功的酵母菌液點至含600 ng·mL-1 AbA的SD/-Ura-Leu平板上。其中，含AD/pABAi，AD-MsWRKY33/pABAi，AD/pABAi-pMsACS2重組質粒的酵母菌液在SD/-Leu-Ura上可以正常生長，在SD/-Leu-Ura（600 ng·mL-1 AbA）上無法生長，而含AD-MsWRKY33/pABAi-pMsACS2重組質粒的酵母菌液可以在SD/-Leu-Ura（600 ng·mL-1 AbA）上生長，說明MsWRKY33同樣可以和MsACS2基因啟動子結合從而調控其基因表達，也進一步說明MsACS2可能具有與AtACS2相近的生物學功能（圖6）。

2.7? NaCl處理下的下游基因表達量分析

對該課題前期獲得的轉基因MsWRKY33紫花苜蓿株系進行表達量鑒定，qRT-PCR顯示過表達株系L3和L4基因表達水平均顯著高于紫花苜?！熊?號對照株系（圖7）。為了進一步驗證MsWRKY33與MsACS2基因的調控關系，利用實時熒光定量PCR的方法分析了200 mM NaCl處理下，MsWRKY33和MsACS2在CK（‘中苜1號）和MsWRKY33轉基因株系L3和L4中的表達水平，發(fā)現(xiàn)MsWRKY33在CK，L3和L4株系中均能被誘導表達，但在鹽處理的3～24 h內兩個轉基因株系的MsWRKY33表達水平均顯著高于CK（圖8）。CK株系中MsWRKY33表達水平呈逐漸上升趨勢，而在轉基因株系中呈先上升后下降的趨勢，且在6 h時達到峰值。3個株系中MsACS2的表達水平在0～36 h內均呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，在36 h時轉基因株系L3和L4的MsACS2基因表達水平達到最高且顯著高于CK。在轉基因株系和對照株系受到鹽脅迫后的36 h內，MsWRKY33的表達量一直處于高位，說明鹽脅迫可以誘導MsWRKY33基因的表達，且轉基因株系中的表達量顯著高于對照株系；轉基因株系在受到鹽脅迫24 h后，ACS2基因表達量才逐漸上升，與此相比CK株系的ACS2基因表達水平一直處于低位，這說明了MsACS2基因可能受到MsWRKY33轉錄因子的調控。

3? 討論

3.1? MsWRKY33轉錄因子特異性結合W-box順式作用元件

土壤鹽漬化已經成為人們農業(yè)生產的重要阻礙因素，全球已有超過8億的土地受到鹽漬化的影響［4］，中國的鹽堿土面積也達到了1.0×108hm2［4］。紫花苜蓿是全國乃至世界范圍內種植最多的牧草品種，主要分布在我國的西北、華北和東北等地，其分布區(qū)域和生長環(huán)境大都在土壤鹽漬化嚴重的地區(qū)，因此，了解紫花苜蓿耐鹽性的分子機制對于苜蓿品種的選育和農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

轉錄因子在植物生長發(fā)育中扮演重要角色，WRKY轉錄因子作為植物體內重要的轉錄因子之一參與植物體生長發(fā)育過程及生物及非生物逆境響應［30］，且研究表明WRKY轉錄因子與紫花苜蓿耐鹽堿性相關［31］。在幾乎所有受到WRKY蛋白調控的基因啟動子區(qū)域中都能發(fā)現(xiàn)（T）TGAC（C/T）這一高度保守的W-box元件；W-box多存在于許多與植物防衛(wèi)反應相關基因的啟動子中［24］。ZmWRKY104通過與下游基因ZmSOD4啟動子區(qū)W-box結合從而啟動ZmSOD4基因的表達增強玉米（Zea mays L.）SOD活性，以更好地清除植物體內由于鹽脅迫所產生的活性氧，從而增強了玉米的耐鹽性［32］。PsnWRKY70與PsnNAM，PsnMYB和PsnGT1基因的啟動子中W-box結合從而啟動下游基因的表達來響應鹽脅迫［33］。以上研究均揭示了WRKY轉錄因子的調控機制，即WRKY轉錄因子通過與下游靶基因的啟動子區(qū)域的W-box結合從而調控其表達。本研究結果也表明紫花苜蓿MsWRKY33轉錄因子可以特異性的結合W-box順式作用元件。

3.2? MsWRKY33轉錄因子可能正向調控MsACS2基因的表達

本課題前期對正常條件和鹽脅迫條件下的對照株系和轉基因株系的紫花苜蓿進行了轉錄組測序，其中發(fā)現(xiàn)有1個編碼ACC合成酶（乙烯合成過程中的關鍵限速酶）ACS2基因顯著上調。ACS（ACC合成酶）是乙烯合成途徑中的關鍵限速酶，其活性直接影響到乙烯的生成量［34］。乙烯合成過程中的重要酶類ACS，ACO及乙烯在植物耐鹽脅迫中起著重要作用。鹽脅迫可以促進植物體內乙烯的合成，如在煙草中，鹽處理能誘導NtACS1，NtACO1，NtACO2和NtACO3基因的表達［15-16］，同時乙烯及乙烯前體ACC也能顯著增加植物的耐鹽性［16］。乙烯的動態(tài)平衡在鹽脅迫應答中起著復雜的作用。因此，我們推測MsWRKY33通過轉錄調控ACS2基因的表達從而影響乙烯的合成，進而可能影響紫花苜蓿的耐鹽性。

MsWRKY33轉錄因子可以與下游基因AtACS2啟動子特異性結合，同源性分析結果顯示，紫花苜蓿中的ACS2基因與AtACS2同源性高達53.9%，因此我們有理由相信MsACS2基因與AtACS2具有相類似的生物學功能。為了進一步確定MsWRKY33轉錄因子是否對紫花苜蓿ACS2同源基因也有調控作用，我們克隆了ACS2在紫花苜蓿中的同源基因MsACS2，并通過酵母單雜交驗證了MsWRKY33對MsACS2也具有調控作用。本研究也證明了MsWRKY33轉錄因子可以特異性結合W-box順式作用元件，而AtACS2和MsACS2基因啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)兩者都含有W-box元件，說明MsWRKY33轉錄因子可能是通過與AtACS2和MsACS2基因啟動子中的W-box元件結合從而調控其基因表達。近年來，植物的遺傳轉化技術成為研究植物基因組學的強有力工具［35］，基因的遺傳轉化技術比傳統(tǒng)的雜交、回交等育種技術效率更高［36］。通過利用基因遺傳轉化技術研究苜?；虻墓δ?，揭示基因的作用機制已成為研究前沿。TaACS2，TaACS7和TaACS8在TaWRKY51-RNAi株系中表達上調，而在TaWRKY51-OE株系中表達下調，說明TaWRKY51對TaACS2，TaACS7和TaACS8基因的調控是負向的［37］。在本研究中，轉基因株系和對照株系受到鹽脅迫后MsWRKY33基因表達量總體處于高位，而轉基因株系在受到鹽脅迫24 h后，ACS2基因表達量才逐漸上升，與此相比對照株系的ACS2基因表達水平一直處于低位，這可能是從MsWRKY33基因被鹽誘導從而轉錄翻譯為MsWRKY33轉錄因子蛋白，MsWRKY33轉錄因子蛋白轉錄調控ACS2基因這一過程需要時間，所以才導致ACS2基因表達較MsWRKY33出現(xiàn)滯后。因此，MsACS2基因可能受到MsWRKY33轉錄因子的調控且這種調控作用可能是正向的。

目前，已有研究證明WRKY轉錄因子可以調節(jié)ACS2基因的表達。AtWRKY33直接參與MPK3/MPK6級聯(lián)下游ACS2和ACS6表達的激活，以響應病原體入侵［26］；擬南芥AtWRKY29正調控ACS5，ACS6，ACS8，ACS11和ACO5基因的表達從而促進乙烯的合成［38］；小麥（Triticum aestivum L.）TaWRKY51通過結合ACS基因啟動區(qū)域的W-box順式作用元件抑制ACS基因表達從而影響乙烯的合成，進而對小麥側根的發(fā)育產生影響［37］；擬南芥WRKY8通過直接調控ACS6基因的表達參與了植物對TMV-cg的防御反應［27］。本研究發(fā)現(xiàn)MsWRKY33可能通過與MsACS2基因啟動子區(qū)的W-box結合從而調控其表達?，F(xiàn)有研究大都集中在模式植物擬南芥的WRKY轉錄因子直接靶向調控乙烯合成的關鍵限速酶基因從而調控乙烯生物合成，探討其在生物脅迫和植物生長發(fā)育方面的影響［26-27，37-38］，而本研究旨在探究WRKY轉錄因子調控ACS基因從而影響乙烯生物合成，且乙烯可能參與苜蓿的耐鹽脅迫進程，但乙烯參與紫花苜蓿鹽脅迫的具體分子機制仍需進一步探究。

3.3? 乙烯可能增強紫花苜蓿對鹽脅迫的耐受性

乙烯是通過對ROS的清除以增強植物對鹽脅迫的耐受性，如乙烯通過影響RBOHF介導的ROS和Na/K平衡來提高擬南芥的耐鹽性［39］；乙烯預處理或者EIN3（關于乙烯激活的轉錄因子）的活化能夠直接轉錄調控POD的表達來增強過氧化物酶（POD）的活性以清除ROS，從而提高植物對鹽脅迫的耐受性［40］。當紫花苜蓿受到鹽脅迫時，MsWRKY33可能會通過轉錄調控MsACS2基因上調從而使乙烯的生物量增加，乙烯可能通過清除植物體內的ROS活性氧來增強紫花苜蓿的耐鹽性，其具體機制仍需進一步探究。

4? 結論

本研究克隆了AtACS2和MsACS2基因啟動子，利用PlantCARE在線網站分析它們基因啟動子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其均含有與WRKY轉錄因子結合的逆境響應元件W-box；酵母單雜交實驗證實了MsWRKY33可以與W-box順式作用元件、AtACS2和MsACS2啟動子特異性結合；qRT-PCR結果表明MsWRKY33基因能被鹽脅迫誘導表達，且ACS2基因可能受到WRKY33轉錄因子的正向調控并誘導其表達。因此，紫花苜蓿在受到鹽脅迫時可誘導體內MsWRKY33的表達，MsWRKY33可能通過與其下游基因MsACS2啟動子中W-box元件結合進而正向調控其表達，影響乙烯合成，進而影響紫花苜蓿對鹽脅迫的響應。

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（責任編輯? 彭露茜）