懷山藥連作地土壤元素的變化和連作障礙解決方法研究

王帆林 王代軍 成宏斌 潘曉翠

摘要 測定和分析溫縣懷山藥栽培基地土壤元素隨連作年限的變化，分離鑒定懷山藥根際土中化感物質的種類和含量，探究引起懷山藥連作障礙的主要因素，并考察施用殺線菌肥對山藥產量和品質的影響。結果表明：懷山藥連作1～4年土壤元素和有機質含量先增多后減少，以連作2年最高，連作使土壤氮、磷、鉀比例失調，Cu、Cd、Cr、Ni、Pb在土壤表層富集，土壤pH減小。隨著生長期的延長，土壤中全磷、重金屬、Na含量降低，全鉀、Ca增多，Mg和有機質變化不明顯；應用GC-MS和HPLC在山藥根際土中共鑒定出11種化感物質。施用殺線菌肥可有效緩解山藥連作障礙，達到增產提質防病害的功效，以3 000 kg/hm效果最優(yōu)，比對照增產26.83%，根長增加35.26%，畸形率降低82.43%；3 000、6 000和9 000 kg/hm施肥量使山藥增粗10.00%～15.00%，根際線蟲分別比對照減少了82.80%、73.12%和52.69%。

關鍵詞 懷山藥；連作障礙；土壤元素；殺線菌肥

中圖分類號 S344.4 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）02-0161-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.036

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Change of Soil Elements and the Solution of Continuous Cropping Obstacle in Chinese Yam Continuous Cropping Land

WANG Fan-lin，WANG Dai-jun，CHENG Hong-bin et al

（Hainan Academy of Agricultural Reclamation Science Group Co.， Ltd.，Sanya，Hainan 572024）

Abstract The study measured and analyzed the changes of soil elements with continuous cropping years in the Chinese yam cultivation base in Wen County， isolated and identified the types and contents of allelochemicals in the rhizosphere soil of Chinese yam， explored the main factors causing obstacles to continuous cropping of Chinese yam， and investigated the effect of nematicidal bacterial fertilizer on the yield and quality of Chinese yam.The results showed that the contents of soil elements and organic matter increased first and then decreased in 1-4 years of Huai yam continuous cropping， the second year was the highest. The proportion of nitrogen， phosphorus and potassium in soil was imbalanced， Cu， Cd， Cr， Ni and Pb were enriched at the upper soil layer， but soil pH decreased. With the extension of growth period， the contents of total phosphorus， heavy metals and Na in soil decreased， total potassium and calcium increased， and the changes of Mg and organic matter were not obvious. A total of 11 allelochemicals were identified in the rhizosphere soil of yam by GC-MS and HPLC.The application of nematicidal bacterial fertilizer could effectively alleviate the obstacles of continuous cropping of yams， achieve the effect of increasing yield， improving quality and preventing diseases. The effect of 3 000 kg/hm was the best， which increased yield by 26.83% compared to the control， increased root length by 35.26%， and reduced deformity rate by 82.43%.The fertilization amounts of 3 000， 6 000 and 9 000 kg/hm increased the thickness of yam by 10.00%-15.00%， and reduced the number of nematodes in the rhizosphere by 82.80%， 73.12% and 52.69%， respectively， compared to the control.

Key words Chinese yam;Continuous cropping obstacle;Soil elements;Nematicidal bacterial fertilizer

作者簡介 王帆林（1990—），女，甘肅白銀人，農藝師，碩士，從事天然產物開發(fā)與利用研究。*通信作者，研究員，博士，博士生導師，從事天然藥物學研究。

收稿日期 2023-02-14

連作障礙是指植物在經過連作后，在正常栽培管理條件下也會出現生育狀況變差、病蟲害加重、產量降低、品質變劣的現象，也稱“重茬問題”。由于耕地有限，藥用植物栽培面臨嚴峻的連作障礙問題，我國有230多種藥用植物需大面積栽培，其中根莖類占比70%以上。山藥（Dioscorea opposita Thunb.）連作使山藥生長抑制、病蟲害嚴重，甚至絕收。懷山藥是古懷慶府（今河南省焦作市境內）所產的山藥，屬我國有名的道地藥材，懷山藥的輪作周期為5年，該區(qū)域也是道地懷地黃產區(qū)，懷山藥和懷地黃嚴重的連作障礙和市場需求的不斷增大使懷藥不得不在道地產區(qū)之外的區(qū)域種植，嚴重影響了其藥用價值，我國道地懷山藥的生產面臨巨大難題。

引起山藥連作障礙的原因有3個方面：①土壤環(huán)境改變，包括土壤養(yǎng)分失衡和微生物群落破壞；②植物自毒作用，山藥自身次生代謝產物的囤積對山藥生長形成抑制，主要是指化感物質；③病蟲害殘留，連年種植導致山藥土傳病害加劇。上述因素聯動互作，使山藥嚴重減產，并極大降低山藥品質，其中以植物自毒作用在近年來研究較多，且尚無較好的解決辦法。目前發(fā)現，引起植物自毒作用的化感物質幾乎都是植物的次生代謝產物，可劃分為14類，其中酚酸類物質通過對植物膜系統、內源激素、土壤微生物等作用導致植物生長受到抑制，且種類多、較活躍，是目前化感作用研究的重點，如對羥基苯甲酸、咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、香草酸、苯甲酸等，懷山藥根系酚酸類化合物隨生長周期而變化。但是，目前學者對連作障礙機理研究較多，但仍缺乏行之有效的解決辦法，主要通過加強田間管理進行緩解。該研究測定和分析溫縣懷山藥栽培基地土壤元素隨連作年限的變化，分離鑒定懷山藥根際土中化感物質的種類和含量，探究引起懷山藥連作障礙的主要因素，并考察施用殺線菌肥對山藥產量和品質的影響，以期為緩解懷山藥連作障礙提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC 2000液相色譜儀，配有T2100P色譜工作站，上海天美科學儀器有限公司；氣相色譜質譜儀，美國PerkinElmer公司；原子吸收光譜儀，美國PerkinElmer公司；ME2002E電子分析天平、ME204E精密電子分析天平，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；KE52AA旋轉蒸發(fā)器、SHI－Ⅲ型循環(huán)水真空泵、低溫冷卻液循環(huán)泵，上海亞榮生化儀器廠；GOKU－A1超純水系統，銳思捷水純化技術有限公司。

1.2 試劑 阿魏酸、對香豆酸、對羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸標準品，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；微生物菌肥由河南保和堂提供；殺線復合酶制劑由海南省農墾科學院集團有限公司生物工程中心配制；甲醇、甲酸、乙腈，色譜級，賽默飛世爾科技有限公司；工業(yè)乙醇（≥95%），白沙南大洋實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤采樣和元素測定。選擇在地理位置上連片且均有不同連作年限地塊的4塊栽培基地，采用五點取樣法，分別在6月和10月采集土壤，檢測在山藥快速生長期和山藥收獲期土壤磷、氮、鉀、鈣、鎂、鈉、重金屬、有機質和土壤pH。各地塊栽培管理模式一致。

土壤元素測定方法按照相關檢測標準進行，其中土壤全氮含量的測定依據HJ 717—2014，采用凱氏法；土壤全磷含量的測定依據GB 9837—1988；土壤全量鈣、鎂、鈉、鉀元素含量的測定依據NY/T 296—1995，采用氫氟酸-高氯酸消解法；土壤有機質含量的測定依據MY/T 1121.6—2006；土壤重金屬含量的測定依據NY/T 1613.14—2008，采用王水回流消解原子吸收法；土壤酸堿度的測定依據NY/T 1121.2—2017。

1.3.2 根際土提取物制備。山藥挖出后用純水沖洗根上附著的泥土，將收集的泥漿用濾紙過濾后得到山藥根際土，將根際土放入燒杯中，加入10倍體積75%乙醇，超聲提取30 min后用濾紙過濾，并收集濾液，重復提取2次后，將收集到的濾液合并，40 ℃下于真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3～5 mL，用氨水調節(jié)酸堿度至pH≥9。稱取適量柱層析硅膠（200～300目）進行裝柱，依次用3 mL甲醇和3 mL 1%氨水淋洗硅膠柱后，將提取液凝縮液進行上樣，用3 mL甲醇（色譜級）洗脫柱子，再用3 mL 5%乙酸甲醇溶液洗脫，此時收集洗脫液，并常溫揮干溶劑，向洗脫液中加入2 mL甲醇硫酸溶液（4∶1），50 ℃恒溫水浴30 min后，依次加入5 mL 20 g/L無水硫酸鈉溶液和5 mL正己烷（色譜級），振蕩萃取10 min后，10 000 r/min條件下離心3 min，取上層備用。

1.3.3 液相色譜條件。色譜柱為Agligen ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；流動相A為0.1%乙酸溶液，B為甲醇溶液。梯度洗脫：0～35 min，85%～55%A；35～70 min，55%～10%A；70～75 min，10%～0%A；75～80 min，0～55%A；80～85 min，55%～85%A；85～90 min，85%A。流速1 mL/min。

1.3.4 質譜條件。GC-MS分離柱（PE，Elite-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，分流比10∶1；掃描范圍m/z 50～500，延遲時間2.5 min，檢測時間2.6～29.0 min。升溫程序：0～2 min，0～50 ℃；2～4 min，50 ℃；4～9 min，50～200 ℃；9～19 min，200～220 ℃；19～27 min，220～260 ℃；27～29 min，260 ℃。

1.3.5 殺線菌肥對山藥生長的影響試驗。殺線菌肥由微生物肥料和復合酶殺線蟲劑以150∶1質量比混合而成，試驗地為河南省溫縣保和堂四大懷藥規(guī)范種植基地山藥連作地塊。設置殺線菌肥用量分別為3 000、6 000和9 000 kg/hm，小區(qū)面積5 m，每小區(qū)一半施用殺線菌肥，一半為對照，小區(qū)間保護行寬度1 m，每處理4次重復。殺線菌肥經農用車拋灑到對應區(qū)組后，旋耕機翻地兩遍，其他農事操作與基地內規(guī)范化山藥種植保持一致。

山藥收獲期，在各小區(qū)采用五點取樣法劃定5個采樣點，在采樣點內采集0～20 cm土層土壤，并采挖山藥；對新鮮采挖到的山藥進行根粗、長度、鮮重測量。采用波爾曼漏斗分離法對所采土壤中的線蟲進行分離，顯微鏡下觀察線蟲生活狀態(tài)并記錄活線蟲數。

1.4 數據統計分析 所有試驗數據采用Excel 2013軟件進行分析統計。

2 結果與分析

2.1 土壤元素檢測 從表1可以看出，連作1～4年，隨著年限的增加，土壤全量氮磷元素含量先增多后減少，最終低于連作1年，鉀元素含量變化不明顯；相同連作年限，在10月，土壤中全磷含量低于6月，全氮含量與作物生長期無相關性，全鉀含量則有增大現象，說明山藥地土壤中鉀元素隨著作物生長周期逐漸富集。路翠紅等研究表明，氮、磷、鉀施肥比例為1.00∶0.81∶2.00時，懷山藥產量和商品性最好；許念芳等研究也表明，山藥氮、磷、鉀施肥量當量比為1.00∶0.94∶1.58時，山藥經濟產量最高。此次試驗中，連作1～4年山藥地土壤氮、磷、鉀元素比例分別為1∶1.7∶31.1、1∶1.3∶27.2、1∶1.7∶36.3和1∶1.7∶33.4，與山藥高產優(yōu)質栽培所需三大元素的適宜比例相差較大，懷山藥栽培基地存在元素失衡現象，以鉀元素含量過高為主要表現。由此推測，山藥連作和不合理的施肥習慣加重了山藥地養(yǎng)分失調，是引起山藥連作減產的原因之一。此外，對照《全國土壤養(yǎng)分含量分級標準表》對試驗地土壤肥力等級進行劃分，發(fā)現該試驗區(qū)山藥地土壤肥力水平處于極低水平。該試驗區(qū)為四大懷藥道地產區(qū)，由于耕地面積有限，栽培以四大懷藥常年輪作為主要模式，簡單的輪作模式不利于土壤修復，因而應當注重土壤肥力監(jiān)控并及時調整施肥方案。

從表2可以看出，0～50 cm土層中，相同連作年限，在10月，隨著土層深度的增加，Cu、Cd、Cr、Ni、Pb含量總體逐漸降低，表現為重金屬在土壤表層的累積，而在6月，以Cr隨土層深度增加而明顯增多；50～90 cm土層中，隨著山藥生長周期的延長，同一土層重金屬含量均明顯降低，6和10月土壤中5種元素含量與土層深度變化相關性不明顯。以上說明山藥根系對土壤中5種元素均有一定的富集作用，而淺層土壤由于田間施肥、翻耕等使土壤混合較為均勻，根系對元素富集作用不能很好地體現出來。成芬等研究表明，懷山藥對土壤中不同重金屬元素的富集能力表現為Cu＞Zn＞Mn＞Ni＞Cr＞Pb；該試驗檢測結果表明懷山藥對Cu元素吸收力較強，對其余元素吸收能力較弱，這與成芬等的研究結果相一致。

對不同連作年限0～90 cm土壤元素進行整體檢測，結果發(fā)現（表3），隨著山藥連作年限的增大，Cu、Cd、Cr、Ni、Pb含量總體先增多后減少，以連作2年累積最多，但各元素含量水平變化與作物生長期和連作年限的相關性不明顯。此外，根據檢測數據，參照《農用地土壤環(huán)境質量標準》（GB 15618—2010），可以判斷該試驗采樣區(qū)Cu、Cd、Cr、Ni、Pb含量符合國家一級土壤質量標準，試驗地不存在Cu和Ni這2種微量元素缺乏及Cd、Cr、Pb這3種重金屬超標現象，因此該試驗中重金屬污染不是懷山藥連作減產的影響因素。

從表4可以看出，試驗地土壤中Ca、Mg、Na含量處于較低水平，其中以Na含量最高，其次是Ca和Mg。連作1～4年，土壤Ca、Mg、Na在土壤中的含量隨著連作年限的增加變化不明顯，推測此現象與山藥本身對3種元素吸收利用量較小且栽培基地所有田塊施肥方式均一有關。此外，相同連作年限，隨著山藥生長期的延長，土壤中Ca、Mg元素含量變化不明顯，但Na含量明顯降低。

從表5可以看出，土壤有機質含量隨連作年限的增加呈先增多后減少的趨勢，在連作2年時達到最大值，在6月和10月分別為7.75和7.55 g/kg。推測其原因為在連作2年時，隨著山藥營養(yǎng)體在土壤中遺落的增加，土壤中有機質含量升高，此后，由于山藥連作障礙加劇，土壤理化環(huán)境改變，導致土壤有機質減少。

此外，連作1～4年土壤pH逐漸減小，以連作2年減幅最大，但總體在7.4～8.6，且收獲期小于快速生長期。相同生長期，0～90 cm深度的土壤pH隨土層深度的增加無明顯變化。研究表明，隨著山藥的生長代謝，山藥根系分泌物和營養(yǎng)體凋落腐爛釋放出的酸性物質對土壤環(huán)境影響較大，根系分泌的酚酸類物質是導致懷山藥連作障礙的因素之一。該研究中，山藥連作年限越長，土壤酸性越強，與前人的研究結果相符。對于土壤酸度隨土層深度的變化，還需控制好田間管理和采樣方法，以獲得更精確的數據。

2.2 根際土代謝物的分離鑒定

采用GC-MS檢測方法，在山藥根際土提取物中鑒定出7種物質，分別是肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸、硬脂酸、α-桉葉醇和蒿本內酯，檢測以油酸作為標準物質，各組分在山藥根際土中的相對含量分別為0.892、3.817、2.222、2.456、0.579、1.357、0.347 mg/kg。采用HPLC方法，以標準物質為對照，發(fā)現在山藥根際土中還存在對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸和對香豆酸4種常見化感物質，其相對含量分別為0.321、0.363、0.214和0.291 mg/kg，但未檢測到阿魏酸組分，為驗證山藥根際土提取物中是否含有阿魏酸成分，將上述4種化合物同阿魏酸標準品混合溶于甲醇后，同樣方法進行甲酯化，經正己烷萃取后，進行GC-MS分析，結果檢測到與進樣量相同含量的阿魏酸甲酯，由此斷定甲酯化過程對阿魏酸結構無破壞作用，因而可確定該試驗提取得到的土壤次生代謝物中不含阿魏酸。

2.3 殺線菌肥對山藥生長的影響

從表6可以看出，殺線菌肥對提高山藥產量、品質和防治山藥根際線蟲方面具有明顯作用。在產量和品質方面，以殺線菌肥施用量為3 000 kg/hm時山藥產量和品質最好，相比對照，增產26.83%，山藥長度增加35.26%，畸形率降低82.43%。施用3 000 kg/hm殺線菌肥比施用6 000和9 000 kg/hm產量分別高出5.25%和8.79%，山藥長度增加了7.44%和16.63%。此外，施用殺線菌肥對山藥根系膨大具有促進作用，使山藥根粗比對照增大10.00%～15.00%，但膨大作用不隨施肥量的增加而變化。

在防治山藥根際線蟲方面，相比對照，施用殺線菌肥3 000、6 000和9 000 kg/hm山藥根土中線蟲分別比對照減少了82.80%、73.12%和52.69%，表明殺線菌肥對山藥根際線蟲具有一定防治效果。

由此可見，殺線菌肥的施用可有效防治山藥根際線蟲，緩解山藥地連作障礙，提高山藥產量和品質。此外山藥地施用殺線菌肥以3 000 kg/hm效果明顯優(yōu)于6 000和9 000 kg/hm施用量，表明山藥栽培過程中要合理用藥施肥，避免過量施用導致的高投入產出比和農田生態(tài)問題。

3 結論與討論

連作可導致土壤元素發(fā)生變化，是懷山藥連作障礙的原因之一。連作1～4年山藥地各元素和有機質含量先增多后減少，以連作2年最高。連作使土壤三大元素比例失調加重，Cu、Cd、Cr、Ni、Pb這5種重金屬在土壤表層富集，土壤pH也逐漸減小，全磷、重金屬、Na隨山藥生長期而降低，全鉀、Ca增多，Mg變化不明顯，長期單一的作物栽培種類和施肥習慣使懷山藥栽培基地肥力水平較低，懷山藥栽培需根據土壤養(yǎng)分變化調整施肥方案。該試驗在懷山藥根際土中共鑒定出肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸等11種物質，經文獻研究其均屬于化感物質。施用殺線菌肥可明顯改善山藥產量和品質，以3 000 kg/hm施用效果最優(yōu)，比對照增產26.83%，山藥長度增加35.26%，山藥畸形率降低82.43%，施肥使山藥增粗15.00%，3 000、6 000和9 000 kg/hm施肥量土壤中根際線蟲分別比對照減少了82.80%、73.12%和52.69%，因此施用殺線有機肥可明顯提高山藥產量和品質，防治山藥線蟲，有效緩解山藥連作障礙。

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