萎縮芽孢桿菌WL520生物活性及干旱脅迫下促紫花苜蓿生長效應(yīng)

武玲玲,謝永麗,2,3*,楊 杰,楊 雪,2,李俊熹,王 添,高 英,常斐斐

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810016; 2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016;3.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)

草地資源涉及一定地域范圍內(nèi)的草地類型、面積和分布情況,以及由它們所產(chǎn)生的物質(zhì)蘊(yùn)藏量,是青海省畜牧業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ),對青海省經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益具有重要作用[1]。干草及飼草料加工是畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要來源,然而青海地區(qū)屬內(nèi)陸西部地區(qū),海拔高(1 644～6 851 m),紫外線強(qiáng),常年溫度較低,降雨量少,干旱、半干旱、沙荒地較多,包括柴達(dá)木盆地、海西州全境等諸多地方都屬于干旱氣候區(qū),牧草種植后因干旱低溫等不利環(huán)境因素導(dǎo)致牧草產(chǎn)量和品質(zhì)降低,草牧業(yè)發(fā)展嚴(yán)重受限,進(jìn)而對整個(gè)青海省畜牧業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了不利影響。同時(shí),青海干旱低溫的氣候條件導(dǎo)致草地生態(tài)系統(tǒng)脆弱,土壤貧瘠,植被覆蓋率低,能作為飼草的植物品種相對較少,加之秋冬季節(jié)草場植被枯黃,導(dǎo)致可利用優(yōu)良牧草生長期短,產(chǎn)草量低[2-3]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為世界范圍內(nèi)栽培歷史最悠久,種植面積最廣泛的豆科苜蓿屬(MedicagoL.)多年生草本植物[4],其優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、耐刈割的生產(chǎn)特性及保持水土等生態(tài)功能使其作為我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、發(fā)展優(yōu)質(zhì)牧草產(chǎn)業(yè)的重要選擇[5-6],同時(shí)作為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)飼草資源在青海廣泛種植利用。然而,病害逐漸成為制約紫花苜蓿產(chǎn)量增加和質(zhì)量提升的主要因素。銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum),屬半知菌亞門真菌,普遍存在于土壤和動(dòng)植物中,可引起苜蓿根腐病[7];禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum),又稱禾谷鐮刀菌,是引起包括苜蓿在內(nèi)等多種植物病害的真菌病害之一[8];同時(shí),干旱嚴(yán)重制約了其產(chǎn)量的提升和種植面積的擴(kuò)大。因此,提高紫花苜蓿產(chǎn)量及品質(zhì)可為解決牧草資源短缺及青海草地生態(tài)恢復(fù)提供指導(dǎo)依據(jù)和實(shí)踐方法[9-11]。

芽孢桿菌作為一類重要的植物根際促生菌(PGPR),具有能夠進(jìn)行根系定殖、可產(chǎn)植物激素、分泌多種抗菌物質(zhì)等特點(diǎn),部分芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抵抗逆境脅迫的能力[12],能夠與宿主植物建立良好的共生關(guān)系,且因其良好的拮抗、促生等活性成為了研究熱點(diǎn)[13]。柴加麗等[14]報(bào)道,芽孢桿菌作為土壤中廣泛存在的PGPR,自身能夠產(chǎn)生植物生長激素,如赤霉素、生長素及亞精胺等,或產(chǎn)生揮發(fā)性化合物(Volatiles),如2,3-丁二酮等物質(zhì)直接促進(jìn)植物生長;芽孢桿菌也可通過產(chǎn)生植酸酶、嗜鐵素等促進(jìn)植物對難溶性磷、鐵等元素的吸收,從而提高植物根際養(yǎng)分,還可通過抑制植物病原菌的生長,降低植物病害的發(fā)生,從而間接促進(jìn)植物生長[15-16]。黃秋斌等[17]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus) B3-7可定殖在小麥根系,降低小麥紋枯病(Sharp eyespot of wheat)的侵染,從而提高小麥的生物量。楊雪等[18]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) DGL1提高了燕麥(AvenasativaL.)的葉綠素、超氧化物歧化酶(SOD)等含量,且增加了牧草產(chǎn)量,對高原牧草的生長發(fā)育產(chǎn)生了顯著影響。鑒于此,我們提出了篩選能夠應(yīng)對干旱脅迫并具有優(yōu)良性狀的根際促生菌,為逆境環(huán)境下促進(jìn)牧草生長、提高作物產(chǎn)量及改善生態(tài)環(huán)境等提供研究思路及解決方案。

本研究以分離自青海干旱沙地白刺根際的芽孢桿菌菌株WL520為材料,對菌株拮抗活性、耐逆性、產(chǎn)IAA及固氮能力進(jìn)行測定,并進(jìn)一步測定干旱脅迫下,菌株對紫花苜蓿生長及耐逆性方面的影響,以期為耐干旱生物菌肥的研發(fā)提供優(yōu)質(zhì)菌源,同時(shí)為促進(jìn)紫花苜蓿生長、退化植被修復(fù)等方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料:紫花苜蓿(M.sativa)‘新牧1號’由青海省海南藏族自治州同德牧場提供;

菌株:芽孢桿菌WL520分離自青海省海西蒙古藏族自治州烏蘭縣沙地白刺(N.tangutorum)根際;

病原菌:銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)和禾谷鐮孢菌(F.graminearum)由青海大學(xué)草地資源與省部共建實(shí)驗(yàn)室保存;

試劑及培養(yǎng)基:革蘭氏碘液[19]、Salkowski比色液[20]、LB培養(yǎng)基[21]、PDA培養(yǎng)基[22]、Ashby無氮培養(yǎng)基[22]、蛋白酶檢測培養(yǎng)基、淀粉酶檢測培養(yǎng)基、果膠酶檢測培養(yǎng)基、β-1,3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基[20]。

1.2 方法

1.2.1菌株拮抗病原真菌活性測定 打取直徑為5 mm銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)和禾谷鐮孢菌(F.graminearum)菌餅,分別接種至PDA平板中央,以菌餅為中心的4個(gè)對稱點(diǎn)作為接種點(diǎn),各放置4個(gè)直徑 4 mm濾紙小圓片;將菌株WL520接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中,以37℃,200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后,將菌液點(diǎn)接在濾紙小圓片中央培養(yǎng)2 d后觀測菌株抑菌圈的直徑并記錄。

抑菌水解酶活性:用直徑為5 mm的打孔器分別在蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、β-1,3-葡聚糖檢測培養(yǎng)基中央打孔;吸取5 μL活化后的WL520菌液接種至4種檢測培養(yǎng)基中央,28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。蛋白酶、果膠酶檢測培養(yǎng)基直接觀察是否有透明圈產(chǎn)生;淀粉酶、β-1,3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基分別利用革蘭氏碘溶液、0.1%的剛果紅溶液浸染靜置10 min后,倒去染液,觀察培養(yǎng)基是否有透明圈產(chǎn)生,根據(jù)所形成的透明圈判斷該菌株是否具有產(chǎn)水解酶特性。

1.2.2菌株耐旱性測定 利用PEG-6000人工模擬干旱條件,將菌株WL520分別接種至含9%,11%,14%,16% PEG-6000的LB液體培養(yǎng)基中,置于恒溫培養(yǎng)箱37℃,200 r·min-1條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h制成菌懸液,利用分光光度計(jì)測定其OD600值,以不含PEG-6000的LB液體培養(yǎng)基為對照,測定菌液的吸光度值,分析菌株耐旱性。

1.2.3菌株產(chǎn)IAA能力測定 菌株WL520活化14 h后恒溫振蕩培養(yǎng)7 d后與Salkowski比色液(10 mL 0.5 mol·L-1FeCl3+ 30 mL蒸餾水+50 mL 98% H2SO4)按2∶1體積比混合至白色陶瓷板中,黑暗靜置30 min,1個(gè)處理3個(gè)重復(fù),以LB液體為對照,觀察是否發(fā)生顯色變化,若溶液變?yōu)榧t色,則表明菌株具有產(chǎn)IAA能力;將菌株菌懸液離心(4℃,10 000 r·min-1)10 min,取5 mL上清液于離心管中,加入等量比色液,避光靜置30 min后測定其OD530值,根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株WL520產(chǎn)IAA的量[21]。

1.2.4菌株固氮能力測定 將WL520菌株接種至LB液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)12 h后吸取5 μL菌液轉(zhuǎn)接至Ashby無氮液體培養(yǎng)基中搖床恒溫(37℃)培養(yǎng)3 d,所配制的Ashby培養(yǎng)基中加入具有固氮能力的芽孢桿菌,該培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化,菌液變渾濁。根據(jù)顏色變化來判斷該芽孢桿菌是否具有固氮能力,根據(jù)菌液在試管中是否變渾濁作為判斷依據(jù),檢測其固氮能力;同理,吸取5 μL菌液接種于Ashby固體培養(yǎng)基中,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,觀察并記錄菌落生長情況,根據(jù)所形成的透明圈大小,檢測其固氮能力[23]。

1.2.5菌株的分子鑒定 16S rDNA基因序列:以芽孢桿菌WL520基因組DNA為模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。引物序列:正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,反向引物1492R:5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 4 min,94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃2 min,34個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序,測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,并通過MEGA7.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。

gyrB基因序列:以WL520菌株基因組DNA為模板進(jìn)行g(shù)yrB基因擴(kuò)增,引物序列:正向引物UP2r:5′-AGCAGG-GTACGGATGTGCGAGCCR-TCNACRTCNGCRTCNGT-CAT-3′,反向引物UP1:5′-GAAGTCATCATGAC-CGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 4 min,98℃ 10 s,62℃ 1 min,72℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 8 min。將gyrB基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序,測序結(jié)果同上述方法一致,通過MEGA7.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6干旱脅迫下WL520促紫花苜蓿生長效應(yīng)測定 紫花苜蓿培養(yǎng):挑選籽粒飽滿,大小均勻的紫花苜蓿種子于溫水中浸泡30 min軟化種皮,用10%次氯酸鈉溶液消毒20 min后用無菌水沖洗3～5次后自然風(fēng)干。將風(fēng)干后的種子置于直徑為10 cm,高度為10 cm的0.35 L花盆中進(jìn)行盆栽試驗(yàn),50?！づ?1,播種于無菌土中,將其置于28℃,光/暗周期16 h/8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d左右。

菌懸液制備:將菌株WL520接種于含有100 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,37℃,200 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h,轉(zhuǎn)入50 mL離心管,在8 000 rpm·min-1條件下離心5 min,棄上清,無菌水洗滌菌體3次,加入適量無菌水將菌體懸浮,使用分光光度計(jì)測定其600 nm下的吸光度值,待其OD600值調(diào)至1.00制成菌懸液。

紫花苜蓿不同處理組:培養(yǎng)7 d左右,待植株高度達(dá)到5～10 cm時(shí),配制15% PEG-6000溶液,采用PEG-6000人工模擬干旱條件,設(shè)置4個(gè)不同處理組:CK,無菌水為對照,對紫花苜蓿進(jìn)行灌根處理,每3 d灌根1次,共灌根5次;CK+B,用WL520菌株菌懸液對紫花苜蓿進(jìn)行灌根處理,每3 d灌根1次,共灌根5次;D,無菌水每3 d灌根1次,共灌根2次后,用15% PEG-6000溶液每3 d灌根1次,共灌根3次。DB,用15% PEG-6000干旱脅迫對紫花苜蓿進(jìn)行灌根處理,每3 d灌根1次,共灌根2次后,用菌株菌懸液每3 d灌根1次,共灌根3次。每次灌根45 ml,經(jīng)灌根處理后,對其進(jìn)行洗根處理,取出每組不同處理下的15株苜蓿,測定株高、鮮重等生長生理指標(biāo)[25-26]。

葉綠素含量測定:參考植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書[27]。稱取0.2 g新鮮苜蓿葉片,擦凈剪碎放入研缽中,加入2 mL提取液(96%乙醇),充分研磨成勻漿狀至組織變白;過濾并用提取液洗滌后定容至25 mL棕色容量瓶,搖勻;立即測定OD665、OD649和OD470值并按照公式計(jì)算苜蓿幼苗組織中葉綠素的含量。

超氧化物歧化酶(SOD)含量測定:參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書[27]。稱取苜蓿葉片2.5 g,加入少量pH=7.8的磷酸緩沖液,研磨成勻漿,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用同一緩沖液定容;在4℃下,10 000 r·min-1,離心15 min,上清液即為酶粗提取液;取5 mL離心管4支(2支為測定管,2支為對照管),加入反應(yīng)試劑后混勻;1支對照管進(jìn)行遮光處理,與其他各管同時(shí)置于4000 lx日光燈下反應(yīng),溫度設(shè)為35℃;30 min后測定OD560下的吸光度值,按照公式計(jì)算SOD活性。

丙二醛(MDA)含量測定:參考植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書[27]。稱取1 g新鮮苜蓿葉片,加入少量10% TCA和石英砂于研缽中,研磨至勻漿;以4 000 r·min-1離心10 min,吸取2 mL上清液并加入2 mL 0.6% TBA(硫代巴比妥酸)溶液,對照加蒸餾水2 mL,混勻后于沸水浴上反應(yīng)15 min,迅速冷卻后再離心,取上清液測定OD532、OD600和OD450值,并按照公式計(jì)算苜蓿幼苗組織中MDA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株WL520的拮抗活性

2.1.1拮抗病原真菌活性 以銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)為病原指示菌,測定菌株WL520拮抗病原真菌活性,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌WL520對銳頂鐮孢菌、禾谷鐮孢菌抑菌圈直徑分別為16.70 mm、15.20 mm,能較好的抑制病原真菌的生長,表現(xiàn)出良好的拮抗病原真菌活性(圖1,表1)。

表1 菌株WL520拮抗病原真菌活性Table 1 Antagonistic activity of strain WL520 to fungal pathogens

圖1 菌株WL520拮抗病原真菌活性Fig.1 Antagonistic activity of strain WL520 to fungal pathogens注:A,拮抗禾谷鐮孢菌活性;B,拮抗銳頂鐮孢菌活性Note:A,Antagonistic activity to F. graminearum;B,Antagonistic activity to F. acuminatum

2.1.2抑菌水解酶活性 菌株WL520可在蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、β- 1,3 -葡聚糖酶4種抑菌水解酶檢測培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈,表明該菌株在生長過程中具有產(chǎn)生蛋白水解酶、淀粉水解酶、果膠水解酶、β-1,3 -葡聚糖酶4種抑菌水解酶的能力(圖2)。

圖2 菌株WL520抑菌水解酶活性Fig.2 Determination of antimicrobial activity of strain WL520注:A,蛋白酶活性;B,淀粉酶活性;C,果膠酶活性;D,β-1,3-葡聚糖酶活性Note:A,Protease activity;B,Amylase activity;C,Pectase activity;D,β-1,3-Glucanase activity

2.2 菌株WL520耐旱性

干旱條件下,植物生長發(fā)育會(huì)受到嚴(yán)重制約,導(dǎo)致葉片葉綠素含量降低,含有細(xì)胞毒性的代謝物質(zhì)積累,從而使成株植物發(fā)生萎蔫。菌株WL520在含有PEG-6000濃度為9%,11%,14%,16%的LB液體培養(yǎng)基中均能生長(圖3),表明該菌株具有一定的耐旱性。

圖3 芽孢桿菌WL520耐干旱性Fig.3 Drought tolerance of Bacillus WL520

2.3 菌株WL520產(chǎn)IAA能力

通過對菌株WL520進(jìn)行定性及定量的產(chǎn)IAA能力測定,發(fā)現(xiàn)菌株在按一定比例混合的Salkowski溶液當(dāng)中變紅,表明菌株WL520具有產(chǎn)IAA能力;通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.032x+0.019,測得菌株WL520在530 nm處的OD值為0.386,計(jì)算得到其菌株分泌IAA的含量為11.47 mg·L-1,表明菌株WL520具有較好的產(chǎn)IAA能力(圖4)。

圖4 芽孢桿菌WL520產(chǎn)IAA顯色反應(yīng)Fig.4 IAA chromogenic reaction of Bacillus WL520

2.4 菌株WL520固氮能力

有固氮能力的芽孢桿菌增強(qiáng)植物吸收氮元素、改善土壤理化性質(zhì)。將培養(yǎng)12 h后的WL520菌液接種在液體及固體Ashby無氮培養(yǎng)基上后,菌液在液體培養(yǎng)基中渾濁且在無氮固體培養(yǎng)基上形成菌落,表明菌株WL520具有一定的固氮活性(圖5)。

2.5 菌株WL520分子鑒定

將擴(kuò)增到的菌株WL520的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行BLAST同源性序列比對并構(gòu)建基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹。16S rDNA比對結(jié)果顯示:菌株WL520與B.atrophaeusM43具有99%的同源性(圖6);gyrB比對結(jié)果顯示菌株WL520與B.atrophaeusBA59具有100%的同源性(圖7);菌株WL520鑒定為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

圖6 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree constructed based on 16SrDNA gene sequence

圖7 基于gyrB基因序構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化圖Fig.7 Phylogenetic diagram based on gyrB gene sequence construction

2.6 干旱脅迫下WL520促紫花苜蓿生長效應(yīng)

2.6.1紫花苜蓿生物量 菌株WL520菌懸液對紫花苜蓿灌根處理(CK+B)后,植物株高、根長及鮮重分別達(dá)到11.33 cm,10.27 cm和0.165 5 g,與對照(CK)相比,分別提高了53.73%,12%和65.01%;干旱脅迫下,菌懸液灌根(DB)后植株株高、根長及鮮重分別達(dá)到10.93 cm,11.63 cm和0.122 4 g,與干旱脅迫(D)相比,其株高、根長及鮮重分別提高了17.91%,40.12%和57.53%;菌懸液灌根(CK+B)處理后紫花苜蓿株高及鮮重與對照(CK)、干旱脅迫(D)形成顯著差異,其根長沒有顯著差異(P<0.05)。因次,具有干旱耐受性的萎縮芽孢桿菌WL520對紫花苜蓿具有一定促生作用,并在干旱脅迫下對紫花苜蓿具有促生效應(yīng)(圖8,表2)。

表2 紫花苜蓿生物量測定Table2 Biomass determination of alfalfa

圖8 干旱脅迫下WL520促紫花苜蓿生長效應(yīng)Fig.8 Growth-promoting effect of WL520 on alfalfa under drought stress注:CK,對照;CK+B,菌液灌根;D,干旱處理;DB,干旱處理+菌液,下同Note:CK,control;CK+B,root-irrigation by bacterial suspension;D,drought treatment;DB,root-irrigation under drought stress,the same as below

2.6.2紫花苜蓿葉綠素含量 與對照(CK)相比,菌懸液灌根處理(CK+B)后的紫花苜蓿葉綠素含量提高了26%;與干旱處理(D)相比,菌懸液灌根(DB)后其葉綠素含量提高了12%。因此,在菌液灌根(DB)后正常生長和干旱脅迫下,均可提高紫花苜蓿葉綠素含量(圖9)。

圖9 紫花苜蓿葉綠素含量Fig.9 Chlorophyll content of alfalfa

2.6.3紫花苜蓿超氧化物歧化酶(SOD)含量 菌懸液灌根(CK+B)后紫花苜蓿SOD含量為103.2 μg·g-1FW,與對照(CK)相比,明顯提高了72.76%(圖10);干旱脅迫(D)下,植株SOD含量為62.4 μg·g-1FW,菌懸液灌根(DB)后,植株SOD含量為97.87 μg·g-1FW,含量提高了56.84%。菌懸液灌根后,增加了紫花苜蓿體內(nèi)SOD的含量;SOD能夠通過清除植物體內(nèi)過量的氧自由基來保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物大分子的完整性,從而提升了紫花苜蓿的抗逆性。

圖10 紫花苜蓿SOD活性測定Fig.10 Determination of SOD activity in alfalfa

2.6.4紫花苜蓿丙二醛含量 與對照(CK)相比,菌懸液灌根(CK+B)后紫花苜蓿丙二醛含量為1.553 μmol·g-1FW,相比CK降低了5.41%;干旱脅迫(D)處理后,丙二醛含量明顯升高,達(dá)到2.977 μmol·g-1FW,而在菌懸液灌根(DB)后丙二醛含量為1.618 μmol·g-1FW(圖11),相比干旱脅迫(D)降低了45.65%,說明在干旱脅迫(D)下紫花苜蓿生物膜脂過氧化程度提高,而在菌懸液灌根(DB)后丙二醛含量降低,表明菌株WL520可減緩紫花苜蓿膜脂過氧化程度、降低丙二醛含量,從而提高紫花苜蓿的耐旱性。

圖11 紫花苜蓿丙二醛含量Fig.11 Determination of malondialdehyde content in alfalfa

3 討論

紫花苜蓿富含蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分,因其抗逆性強(qiáng)、生長迅速等特點(diǎn)已成為世界上最主要的飼料作物之一。干旱脅迫作為最主要的非生物脅迫因子之一,限制了苜蓿的正常生長發(fā)育,因此探究提高紫花苜?？购档姆椒▽朔珊档貐^(qū)紫花苜蓿栽培的制約具有重要意義[28-29]。

芽孢桿菌營養(yǎng)需求簡單、繁殖生長快、可產(chǎn)抗逆性芽孢等特點(diǎn)而具有顯著生防潛力,成為研發(fā)生防菌劑的理想菌株[30]。芽孢桿菌在生長過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,如Surfactin、Fengycin、EPS、鏈霉素等能抑制病原菌生長,從而間接促進(jìn)植物的生長[31]。本研究發(fā)現(xiàn)菌株WL520對禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)有顯著拮抗作用,同時(shí),它能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、果膠酶等抑菌酶類[32],推測其可通過水解病原菌細(xì)胞壁成分而抑制病原菌的生長,間接促進(jìn)植物生長、提高植物產(chǎn)量。IAA是重要的植物激素,并且是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育全過程的信號物質(zhì),PGPR可以通過自身代謝產(chǎn)生植物激素,來促進(jìn)植物細(xì)胞生長[19];菌株WL520具有較好的產(chǎn)IAA能力,表明該菌株在促植物生長方面具有潛在優(yōu)勢。同時(shí),菌株WL520具有較好的固氮能力,固氮類芽孢桿菌可通過固定大氣中的氮素、豐富土壤營養(yǎng)及改善土壤結(jié)構(gòu)等來促進(jìn)植物生長[33]。

干旱脅迫會(huì)降低植物對水分的吸收利用,加速植物體內(nèi)活性氧的積累,從而抑制種子萌發(fā),影響植物生長發(fā)育。韓德梁等[34]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量下降,SOD和POD兩種氧化酶活性會(huì)隨干旱脅迫的強(qiáng)弱以及時(shí)間發(fā)生不同變化。吳淼等[35-36]出通過提高植物氧化物酶活性、促進(jìn)激素和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的產(chǎn)生來應(yīng)對過氧化損傷,調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的滲透勢來提高植物的吸水能力。施燕華等[37]發(fā)現(xiàn)在不同程度干旱脅迫下添加巨大芽孢桿菌,降低了幼苗葉片和根系中相對電導(dǎo)率和MDA含量,保護(hù)了紫花苜蓿幼苗細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能。本研究中菌株WL520具有一定的耐旱性,在干旱脅迫下,該菌株能夠提高紫花苜蓿的株高、根長、鮮重及葉綠素含量,增加產(chǎn)量,增強(qiáng)植物的光合能力。植物遭受逆境脅迫時(shí)產(chǎn)生大量超氧自由基,使膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),產(chǎn)生丙二醛,而SOD能夠通過清除植物體內(nèi)的氧自由基降低丙二醛含量,從而增強(qiáng)植物的抗逆性。本研究發(fā)現(xiàn)菌株WL520灌根紫花苜蓿幼苗后能夠有效降低紫花苜蓿MDA含量,提高SOD含量,表明菌株WL520可緩解紫花苜蓿在干旱脅迫下所帶來的傷害,增強(qiáng)對逆境的適應(yīng)能力,從而提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究通過對菌株WL520進(jìn)行分子鑒定,測定菌株拮抗、抑菌、耐逆等活性,并測定干旱脅迫下菌株對紫花苜?！履?號’生長效應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)菌株WL520具有優(yōu)良抗性及生物活性,在干旱脅迫下對紫花苜蓿的株高、根長、鮮重產(chǎn)生顯著影響,同時(shí),葉綠素、SOD、MDA含量發(fā)生顯著變化,表明菌株對紫花苜蓿具有顯著促生效應(yīng)。因此,本研究為通過施用根際促生菌提高紫花苜?？购的芰μ峁﹥?yōu)質(zhì)菌株及一定的依據(jù)。