超聲波萃取苦荬菜葉中β-谷甾醇的工藝優(yōu)化及其動(dòng)態(tài)積累

閆雨婷,郝俊峰,榮 榮,賈玉山,王志軍,格根圖*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019; 2.興安盟林業(yè)和草原局,內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400)

苦荬菜(LactucaindicaL.),別名山萵苣、苦菜、鵝菜、涼麻等,是菊科萵苣屬的一年生或多年生草本植物,野生種分布遍及全國(guó)[1-3]?？噍げ藢?duì)環(huán)境的適應(yīng)性極強(qiáng),具有耐寒耐旱、耐鹽堿和耐瘠薄等優(yōu)點(diǎn),在我國(guó)分布較廣[4],東三省及內(nèi)蒙古地區(qū)均大面積種植[5]?？噍げ藸I(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,是一種適口性極好的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的青綠飼料。其葉量大,脆嫩多汁帶苦味,鮮草可直接飼喂各種畜禽和草食性魚(yú)類(lèi),也可打漿添加草粉、米糠等飼喂[6-7]。此外,苦荬菜還具有較高的藥用價(jià)值,其富含黃酮類(lèi)、脂類(lèi)、萜類(lèi)、甾醇類(lèi)等活性物質(zhì),具有清熱解毒、消炎止痛、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤等生物活性[8-9]。

蒙早苦荬菜(LactucaindicaL.cv. Mengzao)含有豐富的活性物質(zhì),包括甾醇類(lèi)物質(zhì),且多集中于開(kāi)花初期的葉片中[4,10]。作為蒙早苦荬菜中主要的活性物質(zhì),天然甾醇存在于各種植物中,目前植物甾醇已應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域[11]。植物甾醇主要包括豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、谷甾烷醇等。而β-谷甾醇是植物甾醇的主要成分,占總量60%～90%[12]。在醫(yī)療領(lǐng)域,植物甾醇作為一組植物來(lái)源的化合物,能夠降低血液中有害膽固醇的水平和動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[13]。采用β-谷甾醇對(duì)小鼠進(jìn)行干預(yù)治療,可以達(dá)到抑制神經(jīng)炎癥、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的效果,改善小鼠的認(rèn)知功能[14]。王凱等[15]研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用,可抑制肝癌細(xì)胞的增殖。在養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域,β-谷甾醇的促生長(zhǎng)、抑菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)特性使它在無(wú)抗養(yǎng)殖中具有良好的應(yīng)用前景[16]。日糧中添加β-谷甾醇能改善肉雞飼料效率[17]。

目前,關(guān)于植物甾醇的提取方法有多種,常見(jiàn)的提取方法有溶劑結(jié)晶法、絡(luò)合法、皂化法、蒸餾法(簡(jiǎn)單蒸餾法、分子蒸餾法)、吸附法(柱吸附法、高壓流體吸附法)、超臨界CO2萃取法、酶提取法等[18-19]。對(duì)于植物甾醇提取工藝的研究中,大部分采用熱水浸提法、乙醇回流法等[20],這類(lèi)工藝有提取時(shí)間較長(zhǎng)、提取溫度較高、提取率較低的缺點(diǎn)。而超聲波法具有時(shí)間短、提取率高、不需加熱(不破壞熱敏有效成分)等優(yōu)點(diǎn)[21],現(xiàn)如今關(guān)于植物甾醇提取的研究也多圍繞此方法進(jìn)行[22-24]。本研究以蒙早苦荬菜葉片為材料,通過(guò)超聲波提取法,研究不同時(shí)間、溫度、超聲頻率、料液比對(duì)蒙早苦荬菜葉中提取量的影響,并探究其動(dòng)態(tài)積累規(guī)律。通過(guò)本研究,可為苦荬菜的精深加工提供方向,也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用β-谷甾醇奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為蒙早苦荬菜,是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的飼草品種。2018年6月—2018年9月,選取不同生育期(幼嫩期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、開(kāi)花初期、開(kāi)花中期、開(kāi)花末期和結(jié)實(shí)期)的蒙早苦荬菜葉片,分別采集不同植株葉片,將采集的新鮮葉片沖洗并自然晾干表面水分,用植物粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩,備用。

1.2 試劑與儀器

試劑:無(wú)水乙醇、甲醇(均為色譜純),甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(β-谷甾醇),均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

儀器設(shè)備:E2695-2489高效液相色譜紫外聯(lián)用儀,沃特世科技(上海)有限公司;C18 4.6×250 mm,5 μm色譜柱,美國(guó)安捷倫科技有限公司;VOSHIN-1500C低溫超聲波萃取儀,無(wú)錫沃信儀器制造有限公司。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1超聲波輔助提取法

①單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì):以70%乙醇為提取溶劑,以超聲時(shí)間、溫度、頻率、料液比為四因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn),重復(fù)3次。

時(shí)間:固定溫度30℃、頻率20 KHz、料液比1∶10 g·mL-1,分別考察不同提取時(shí)間(min)對(duì)苦荬菜主要活性物質(zhì)提取量的影響。

溫度:固定時(shí)間20 min、頻率20 KHz、料液比1∶10 g·mL-1,分別考察不同提取溫度(℃)對(duì)苦荬菜主要活性物質(zhì)提取量的影響。

頻率:固定時(shí)間20 min、溫度30℃、料液比1∶10 g·mL-1,分別考察不同提取頻率(KHz)對(duì)苦荬菜主要活性物質(zhì)提取量的影響。

料液比:固定時(shí)間20 min、溫度30℃、頻率20 KHz,分別考察不同料液比(g·mL-1)對(duì)苦荬菜主要活性物質(zhì)提取量的影響。

②正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用超聲波輔助提取法,以70%乙醇為提取溶劑,將時(shí)間、溫度、頻率、料液比為四因素,按L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行苦荬菜活性物質(zhì)的提取,重復(fù)3次。

③驗(yàn)證試驗(yàn):基于正交試驗(yàn)結(jié)果,稱取1.00 g粉碎樣品,在最適提取條件下,平行試驗(yàn)3次。

1.3.2色譜條件 流動(dòng)相:100%甲醇等度洗脫。流量:1.0 mL·min-1。進(jìn)樣量:20 μL。檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm。柱溫:30℃。甾醇高效液相色譜圖見(jiàn)圖1,其A為β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液,B為樣品溶液。

1.3.3對(duì)照品溶液制備 稱取β-谷甾醇2.95 mg,精密稱取至100 mL容量瓶中,用70%甲醇稀釋溶解定容至25 mL,搖勻靜置15 min,分別取2 mL,4 mL,6 mL,8 mL,10 mL,12 mL配制成23.13 μg·mL-1,46.26 μg·mL-1,69.39 μg·mL-1,92.52 μg·mL-1,115.65 μg·mL-1,138.78 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在色譜條件下進(jìn)行分析,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4方法檢驗(yàn)

①線性關(guān)系:在相同色譜條件下,將不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL,色譜峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),得回歸方程Y=54.289x-260.36,R2=0.999 9,對(duì)照品在β-谷甾醇質(zhì)量濃度23.13～138.78 μg·mL-1范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

②精密度試驗(yàn):將最低濃度的照品溶液進(jìn)樣10 μL,在擬定的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)=0.13%(n=6),表明儀器精密度良好。

③穩(wěn)定性試驗(yàn):將供試品溶液在0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h時(shí)進(jìn)樣10 μL,平行試驗(yàn)6次,記錄峰面積,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=0.28%(n=6),其供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

④重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取苦荬菜樣品粉末1.0 g 6份,按供試品溶液制備,在擬訂色譜條件下進(jìn)樣10 μL,記錄峰面積,RSD=0.95%(n=6),表明重復(fù)性良好。

⑤加樣回收試驗(yàn):稱取已知提取量的苦荬菜樣品粉末0.25 g左右,6份,用70%乙醇稀釋至10 mL,按供試品溶液處理。加入1 mL β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液(2.84 mg·mL-1),相同色譜條件下測(cè)定。結(jié)果平均回收率為95.66%,RSD為0.06%,表明該測(cè)定方法合理。

1.3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用SAS 9.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(ANOVA)、使用Excel進(jìn)行圖表制作、使用SPSS 23軟件建立PROBIT回歸模型。每個(gè)試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1提取時(shí)間對(duì)甾醇提取率的影響 由圖2可知,甾醇在20～80 min范圍內(nèi)呈先上升再下降的趨勢(shì),在提取時(shí)間20 min時(shí)最低,并由此開(kāi)始升高,在提取時(shí)間40 min時(shí)達(dá)到最高,在60～80 min時(shí)持續(xù)下降。

圖2 提取時(shí)間對(duì)β-谷甾醇物質(zhì)提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction of β-sitosterol

2.1.2提取溫度對(duì)甾醇提取率的影響 由圖3可知,甾醇提取率在40℃～70℃范圍內(nèi)呈先上升再下降的趨勢(shì),在40℃時(shí)最低,在40℃～60℃時(shí)持續(xù)上升,在60℃時(shí)最高,在60℃～70℃時(shí)下降,并在70℃條件下達(dá)到相對(duì)較低值。

圖3 提取溫度對(duì)β-谷甾醇物質(zhì)提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of β-sitosterol

2.1.3料液比對(duì)甾醇提取率的影響 由圖4可知,甾醇提取率在1∶10～1∶40 g·mL-1范圍內(nèi)呈先上升再下降的趨勢(shì),在1∶10～1∶20 g·mL-1時(shí)上升,在1∶20 g·mL-1時(shí)呈最高值,在1∶20～1∶40 g·mL-1時(shí)下降,1∶20～1∶30 g·mL-1時(shí)下降幅度較大,1∶30～1∶40 g·mL-1時(shí)下降幅度較小,在1∶10 g·mL-1時(shí)最低。

圖4 料液比對(duì)β-谷甾醇物質(zhì)提取量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction of β-sitosterol

2.1.4提取頻率對(duì)甾醇提取率的影響 由圖5可知,甾醇提取率在40～100 KHz范圍內(nèi)呈上升-下降-上升趨勢(shì),在40～60 KHz時(shí)上升,在60 KHz時(shí)最高,在60～80 KHz時(shí)下降,并在80 KHz時(shí)最低,在80～100 KHz時(shí)繼續(xù)上升,100 KHz時(shí)達(dá)到相對(duì)較高值。

圖5 提取頻率對(duì)β-谷甾醇物質(zhì)提取量的影響Fig.5 Effect of extraction ultrasonic frequency on extraction of β-sitosterol

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn),β-谷甾醇為研究對(duì)象,提取時(shí)間、提取溫度、超聲頻率、料液比為因素,每一個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

由表2可知,β-谷甾醇提取量在提取條件A1B3C3D3時(shí)最高,即提取時(shí)間20 min、溫度60℃、頻率80 KHz、料液比為1∶30 g·mL-1,提取量為12.08 mg·g-1,與其他組相比差異顯著(P<0.05)。由R值可知,各因素對(duì)苦荬菜甾醇提取量的影響大小順序?yàn)?D>A>C>B,即料液比>時(shí)間>頻率>溫度。根據(jù)K值,最佳提取條件為A1B1C3D3,與甾醇提取量為最高的試驗(yàn)組條件不一致,需進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)。

表2 超聲波輔助提取法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 2 Ultrasonic -assisted extraction orthogonal test design and result analysis

β-谷甾醇對(duì)照組提取量為2.64 mg·g-1,RSD為1.16%。在提取條件A3B3C3D1下,提取量達(dá)到12.08 mg·g-1,RSD為0.05%(表3)。在提取條件A1B1C3D3下,甾醇提取量為12.31 mg·g-1,RSD為0.84%(表3),顯著高于其他兩組(P<0.05)。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verification test results

由表4可知,根據(jù)F值,甾醇各因素影響均極顯著差異(P<0.01),甾醇正交試驗(yàn)平方和誤差為0.07。

表4 超聲波輔助提取法正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test by ultrasonic assisted extraction

2.3 不同生育時(shí)期干燥樣品中的活性物質(zhì)提取量差異

將苦荬菜新鮮葉片干燥處理后,根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分別提取苦荬菜甾醇物質(zhì),分析苦荬菜甾醇物質(zhì)提取量隨生育時(shí)期的變化。

由圖6可知,不同生育期的葉中甾醇提取量差異較大,呈下降-上升-下降的趨勢(shì)。在開(kāi)花初期,甾醇提取量最高,達(dá)13.22 mg·g-1。在結(jié)實(shí)期時(shí)最低,僅有6.35 mg·g-1。因此,對(duì)葉片甾醇物質(zhì)的提取最好選擇在開(kāi)花初期,以便獲得最大量的活性物質(zhì)。

圖6 蒙早苦荬菜β-谷甾醇提取量隨生育時(shí)期變化分析Fig.6 Analysis of the variation of β-sitosterol extraction with fertility period in Lactuca indica L.cv. Mengzao注:圖中不同大寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different capital letters in the figure indicate significant differences(P<0.05)

3 討論

超聲輔助提取是一種利用超聲波輻射產(chǎn)生的多級(jí)效應(yīng)加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑,提高提取效率的方法[25]。超聲輔助不僅能降低萃取溫度,加快能量轉(zhuǎn)移,選擇性萃取,更利于提取熱敏化合物,還可使用多種溶劑[26]。榮榮[4]通過(guò)研究得到超聲波輔助提取法與其他兩種提取法相比更適用于苦荬菜甾醇類(lèi)物質(zhì)的提取。本研究的最佳工藝條件為時(shí)間20 min、溫度40℃、頻率80 KHz、料液比1∶30 g·mL-1,提取量為13.22 mg·g-1。提取量隨提取時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì),是由于隨著超聲時(shí)間地增加細(xì)胞膜破碎數(shù)量越多,破碎程度越大,植物甾醇溶出越多,但超聲時(shí)間超過(guò)40 min后,細(xì)胞破碎程度增大后雜質(zhì)也相應(yīng)增多,不利于植物甾醇提取,提取量有所降低[27]。在本研究中,提取量隨提取溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì),原因可能是,當(dāng)溫度高于60℃時(shí),溶劑汽化程度變大,減小了溶劑與原料的接觸面積,同時(shí)可能造成有效成分的分解,從而降低了植物甾醇的提取量[28]。提取量隨料液比的增加呈上升-下降-平緩的趨勢(shì),隨著溶劑體積增加,原料與提取溶劑接觸面積增大,溶出的植物甾醇隨之增多,其提取量顯著增加,當(dāng)料液比達(dá)到1∶20 g·mL-1時(shí),提取量最大,隨著提取溶劑體積的繼續(xù)增加,其他物質(zhì)會(huì)隨著體積增大而相應(yīng)增加,抑制植物甾醇溶出,植物甾醇含量有所下降,最終趨于平緩。提取量隨超聲頻率的增加呈先上升后下降的趨勢(shì),由于超聲波功率越大,空化作用越強(qiáng)烈,但超聲功率增大到一定程度時(shí)(頻率80 KHz)容易產(chǎn)生大量無(wú)用的空化泡,增加散射衰減,形成聲屏障,反而會(huì)減弱提取效果[29]。夏秋敏等[30]對(duì)蘋(píng)果籽進(jìn)行植物甾醇的提取,得出的最佳提取工藝與本研究差異較大。李會(huì)珍等[27]對(duì)紫蘇中甾醇物質(zhì)進(jìn)行提取得出的最佳工藝也與本研究存在差異。因此,不同植物材料需要不同提取工藝條件才可最大限度地提取出活性物質(zhì)。

本文對(duì)蒙早苦荬菜干燥葉片進(jìn)行了不同生育期活性物質(zhì)提取量差異的研究。李賽飛等[31]從段木靈芝子中提取活性物質(zhì),研究表明在段木靈芝生產(chǎn)過(guò)程中,子實(shí)體彈射孢子早期之前,采收越早,多糖和三萜含量越高。隨著生育期的推移,植物不斷的生長(zhǎng)同時(shí)積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),但當(dāng)達(dá)到營(yíng)養(yǎng)峰值時(shí),莖葉比例增加,逐漸老化,植株中結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量增加,影響化學(xué)營(yíng)養(yǎng)成分含量的變化[32]。在一般條件下,植物的光合作用和酶活性對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和有效成分的積累有影響[33-34]。在本研究中,甾醇類(lèi)物質(zhì)的提取量在開(kāi)花初期達(dá)到最高水平,隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其原因可能為隨著夏季氣溫的升高,葉片中的養(yǎng)分迅速積累,但隨之被花吸收,葉片中β-谷甾醇含量隨之下降[35]。董金平等人[36]指出,中華苦荬菜中的活性成分在5-7月生長(zhǎng)旺盛期提取量達(dá)到最高,同樣王璐璐等人[37]從中華苦荬菜中提取有效成分,發(fā)現(xiàn)活性提取物提取量在盛花期達(dá)到峰值,之后逐漸下降。本研究選擇開(kāi)花初期獲得了預(yù)期成果,這與上述研究結(jié)論一致。研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)苦菜各部位進(jìn)行總黃酮的提取時(shí),各部位中葉片含量最高[38]。馬春梅等人[39]從菊科植物毛菊苣中提取甾醇類(lèi)物質(zhì),發(fā)現(xiàn)它們主要集中于花與葉片中。因此,本文選擇葉片部位、開(kāi)花初期進(jìn)行試驗(yàn)是最優(yōu)選擇。在對(duì)植物活性物質(zhì)類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行研究提取時(shí),應(yīng)優(yōu)先考慮葉片部位。

4 結(jié)果

本研究以蒙早苦荬菜葉片為原料,結(jié)合超聲波輔助提取法,利用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定了甾醇類(lèi)物質(zhì)最佳提取工藝為提取時(shí)間20 min,溫度60℃,頻率80 KHz,料液比1∶30 g·mL-1。在此工藝條件下,甾醇類(lèi)物質(zhì)的含量達(dá)到最高,為12.08 mg·g-1。各因素對(duì)苦荬菜中β-谷甾醇提取量的影響大小順序?yàn)?料液比>時(shí)間>頻率>溫度。β-谷甾醇提取量最高的生育時(shí)期為開(kāi)花初期,此時(shí)高達(dá)13.22 mg·g-1。