香榧藻斑病病原的分離鑒定及防治藥劑篩選*

劉艾濤 葉碧歡 陳友吾 宋其巖 李海波 沈建軍 張 昕

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 杭州 311300； 2. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)所 杭州 310023）

藻斑病是一種世界范圍內(nèi)常見的木本植物葉部病害，在國外已報(bào)道可危害黑莓（Rubus fruticosus）（Browneet al.，2019）、榕樹（Ficus benghalensis）（Hanet al.，2011）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）（Pitalokaet al.，2015）、番石榴（Psidium guajava）（Sunpapaoet al.，2016a）和龍貢果（Lansium parasiticum）（Sunpapaoet al.，2016b），在我國主要發(fā)生于山茶（Camellia japonica）（何美仙等，2017）、肉桂（Cinnamomum cassia）（鄭寶榮等，2004）和夏橙（Valenciasp.）（王大平等，2005）等植物。藻斑病的病原為寄生藻，引起不同寄主植物藻斑病的病原藻有所不同，頭孢藻（Cephaleurossp.）、虛幻球藻（Apatococcus lobatus）、小球藻（Chlorellasp.）等藻類均被報(bào)道可引起藻斑病發(fā)生，這些藻在葉片上表面定殖，掠奪植物營養(yǎng)，導(dǎo)致寄主植株長勢衰弱（Chanthapatchotet al.，2019；Vasconceloset al.，2016）。

香榧（Torreya grandiscv. ‘Merrillii’）是我國特有的珍稀經(jīng)濟(jì)樹種，野生香榧主要分布于浙江省會(huì)稽山區(qū)一帶（戴文圣等，2006）。香榧具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值、較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值（王鴻等，2007），是浙江多地林業(yè)經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)，為此浙江省還提出“香榧南擴(kuò)”的發(fā)展戰(zhàn)略（吳連海等，2013）。隨著香榧產(chǎn)業(yè)化種植的不斷發(fā)展以及種植面積的逐漸擴(kuò)大，香榧病蟲害問題日益嚴(yán)峻，一些以往零星發(fā)生、危害較輕的病害，如香榧藻斑病，近年來在不同新老產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，且呈逐年加重趨勢，嚴(yán)重地區(qū)發(fā)病率達(dá)70%以上。病原藻主要侵染香榧葉片和嫩枝，在受害部位表面繁殖后產(chǎn)生粉末狀堆積的藻斑，發(fā)病重時(shí)藻斑連片，嚴(yán)重影響植株的光合作用和新芽的抽出，常造成香榧落花落果和減產(chǎn)，給榧農(nóng)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。徐志宏等（2005）對香榧藻斑病研究認(rèn)為，其病原為一種小球藻，但對病原藻的形態(tài)特征和鑒定未給出明確描述和數(shù)據(jù)。葉曉明等（2019）從浙江和安徽兩省的香榧藻斑病病葉中分離獲得病原藻，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)合藻株的18S rDNA 以及ITS 序列分析，將所得藻株鑒定為柵藻科（Scenedesmaceae）的Asterarcys quadricellulare。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，香榧藻斑病由多種藻混合發(fā)生引起，且病原藻形態(tài)與已有報(bào)道有所不同。本研究在浙江省香榧主產(chǎn)區(qū)廣泛采集病葉樣本，擬通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的手段探明引起香榧藻斑病的病原種類，了解其生物學(xué)特性，并進(jìn)行室內(nèi)和室外藥劑篩選研究，以期為香榧藻斑病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病葉采集 2021年4月—2022年11月，多次于浙江省遂昌三仁鄉(xiāng)、諸暨東白湖鎮(zhèn)和桐廬舊縣3個(gè)香榧主產(chǎn)區(qū)采集新鮮發(fā)病的香榧藻斑病病葉，帶回室內(nèi)用于病原藻分離。

1.1.2 主要試劑 用于藻類培養(yǎng)的藍(lán)綠藻培養(yǎng)基BG-11 購自青島海博生物技術(shù)有限公司，扎魯克培養(yǎng)基（Zarrouk）、SE 培養(yǎng)基（Selenite Enrichment）和BBM培養(yǎng)基（Bold’s Basal Medium）購自北京譜藍(lán)生物科技有限公司；供試農(nóng)藥分別為20%噻菌銅劑懸浮劑（浙江龍灣化工）、33.5%喹啉銅懸浮劑（浙江臺州順毅股份有限公司）、12%松脂酸銅懸浮劑（廣東植物龍生物技術(shù)有限公司）、80%波爾多液（通州正大農(nóng)藥化工）和45%石硫合劑（河北雙吉化工）；藻株DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit 購自北京天根生化科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原藻分離 按照說明書方法，稱取1.70 g BG-11 固體粉末溶于1 000 mL 無菌水中，混勻滅菌后制得BG-11 液體培養(yǎng)基。取新鮮發(fā)病的香榧藻斑病病葉，用無菌刮刀刮取適量葉面綠藻混合物置于含100 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。其間設(shè)置光照/黑暗光周期為12 h/12 h，光照強(qiáng)度6 000 lx。2 周后，取藻液利用平板劃線法在含瓊脂粉1.5%（m/v）的BG-11 固體培養(yǎng)基上分離藻株。通過肉眼與顯微鏡觀察相結(jié)合，對平板長出的藻的菌落進(jìn)行分類并用無菌接種環(huán)蘸取菌落邊緣的綠藻在新平板上進(jìn)行多次分離純化，直至獲得單一綠藻藻株。

1.2.2 致病性測定 取生長狀況相近的50 cm 高香榧盆栽幼苗，幼苗葉片表面用75%酒精消毒后，取上述獲得的、用無菌水配制成濃度為4×107～6×107個(gè)?mL?1的各藻懸液，采用噴霧法按每株60 mL 均勻噴灑至幼苗葉片，噴灑后香榧幼苗置于25 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其間保持相對濕度80%、光照/黑暗光周期為12/12 h、光照強(qiáng)度6 000 lx。試驗(yàn)持續(xù)30 天，其間觀察記錄葉片發(fā)病情況，并從發(fā)病葉片上重復(fù)藻種分離過程，驗(yàn)證其同一性。試驗(yàn)每藻種5 次重復(fù)，以噴霧無菌水的處理為對照。

1.2.3 藻株分子鑒定 刮取培養(yǎng)基表面純培養(yǎng)藻株采用TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒提取基因組DNA，以其為模板，采用藻通用引物對EAF3/055R(EAF3:TCGACAATCTGGTTGATCCTGCCAG;055R:CT CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG)擴(kuò)增香榧綠藻的SSU-ITS 片段（Marinet al.，2003），目標(biāo)片段經(jīng)測序后在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，選取相似度較高的序列利用MEGA 6.0 軟件采用鄰近法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。模型為K2P（Kimura 2 parameter），Bootstrap 置信值估算重復(fù)數(shù)設(shè)為1 000 次。本試驗(yàn)PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μL：模板DNA 3 μL（20 ng?L?1）， 2×TSINGK Master Mix 10 μL，10 μmol?L?1引物對各 1.5 μL，ddH2O 4 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min 后；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40 個(gè)循環(huán)；于72 ℃補(bǔ)平10 min，終止溫度4 ℃。

1.2.4 藻株培養(yǎng)特性 取對數(shù)期的各藻株藻液（OD680=0.2）100 μL 分別加入盛有10 mL BG-11 液體培養(yǎng)基的試管中，于不同初始pH（3.0、7.0 和11.0）、溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃）和光照（無光照、光照/黑暗=12 h/12 h 和光照24 h）條件下培養(yǎng)。每隔4 天測定680 nm 波長下藻液的吸光值（OD680）（Caiet al.，2012），比較不同藻株對環(huán)境的適應(yīng)性。采用同樣方法將藻液接入不同培養(yǎng)基（BG-11、Zarrouk、SE 和BBM），研究各藻株對營養(yǎng)基質(zhì)的需求差異。本試驗(yàn)其他培養(yǎng)條件同1.2.1，每處理3 次重復(fù)，以添加無菌水為對照。藻株的相對生長率[Y(%)]為：Y(%)=(ODt?ODCK)/ODCK×100，其中ODt表示t時(shí)間時(shí)藻液的吸光值，ODCK表示0 時(shí)間時(shí)藻液的吸光值。

1.2.5 病原離體抑制藥劑篩選 以無菌刮取的香榧葉片藻斑為試驗(yàn)對象，測定20%噻菌銅劑懸浮劑、33.5%喹啉銅懸浮劑、12%松脂酸銅懸浮劑、80%波爾多液和45%石硫合劑5 種化學(xué)藥劑對其生長的毒性效應(yīng)。具體步驟如下：將各供試藥劑與BG-11 配制成5 種不同體積分?jǐn)?shù)梯度（1∶26 667、1∶8 000、1∶2 667、1∶800 和1∶267）（V/V）的含藥培養(yǎng)液，每種藥劑每種梯度7 mL 分裝試管。向各處理試管中接種培養(yǎng)至OD680=0.2 的藻液3 mL 后將試管置于光照培養(yǎng)箱中同1.2.1 所述條件培養(yǎng)，16 天后測定680 nm波長下藻液的吸光值。試驗(yàn)分別設(shè)置添加等量無菌水替代藻液的陰性對照（CK1）和含有藻液但不含藥劑的陽性對照（CK2），每處理3 個(gè)平行。藥劑對病原藻的抑制率（%）=[ODCK2?（ODT?ODCK1）]/ODCK2×100，其中ODT表示藥劑處理組的吸光值，ODCK1表示陰性對照的吸光值，ODCK2表示陽性對照的吸光值。

1.2.6 林間防治試驗(yàn) 2021年10月，在浙江省諸暨東白湖鎮(zhèn)王坑村香榧林（120°26′32″E， 29°35′21″N）選取藻斑病發(fā)生較為嚴(yán)重的20～30年生香榧人工林開展林間防治試驗(yàn)。分別取室內(nèi)測定效果較好的12%松脂酸銅懸浮劑和33.5%喹啉銅懸浮劑1 000 倍液，采用噴霧法均勻噴灑病葉和枝條至藥液微微下滴為止。該試驗(yàn)每處理10 株香榧，3 次重復(fù)，以噴霧清水為對照（CK）。噴霧前和噴霧后30 天，每株香榧從東南西北4 個(gè)方向統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。藻斑病的發(fā)病情況分級如下：0 級，無癥狀；1 級，只有個(gè)別枝葉發(fā)??；3 級，發(fā)病枝葉數(shù)＜1/3；5 級，1/3≤發(fā)病枝葉片數(shù)＜1/2；7 級，1/2≤發(fā)病枝葉數(shù)＜2/3；9 級，發(fā)病枝葉數(shù)≥3/4。病害的防治效果計(jì)算公式如下：

式中：CK0表示空白對照區(qū)施藥前的病情指數(shù)；CK1表示空白對照區(qū)施藥后的病情指數(shù)；T0表示藥劑處理區(qū)施藥前的病情指數(shù)；T1表示藥劑處理區(qū)施藥后的病情指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 軟件整理數(shù)據(jù)；運(yùn)用SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、毒力回歸方程和有效中濃度（median effective concentration，EC50）計(jì)算；采用Origin 2016 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻株的分離和形態(tài)學(xué)觀察

分離香榧藻斑病病原時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病害由多種藻混合侵染引起。數(shù)十次分離中均可在同一病葉上獲得多種形態(tài)差異較大的藻株，選取能獲得純培養(yǎng)、外觀形態(tài)穩(wěn)定且有明顯差異的3 種類型藻株，編號后保存于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)所。從3 種藻群中分別選擇典型藻株XFLZ928.6、XFLZ928.8 和XFLZ928.15.1 用于后續(xù)試驗(yàn)。

形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，藻株XFLZ928.6 為單細(xì)胞，多以2 個(gè)或多個(gè)細(xì)胞整齊排列和聚集在同一平面，細(xì)胞壁表面平滑，胞體呈橢圓形，長5.35～6.51 μm，寬2.92～3.81 μm，胞體一端有時(shí)長有體刺，色素體周生（圖1A）。藻株XFLZ928.8 的單個(gè)細(xì)胞常首尾相接形成不分枝的絲狀體，其細(xì)胞圓柱狀，單細(xì)胞長9.54～13.50 μm，寬9.40 μm，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞內(nèi)可見清晰淀粉粒和色素體。色素體多沿細(xì)胞邊緣分布，常覆蓋整個(gè)細(xì)胞長度（圖1B）。藻株XFLZ928.15.1 為單細(xì)胞，常離散分布，細(xì)胞圓柱狀，兩端鈍圓，長4.87～7.13 μm，寬2.34～3.00 μm，長寬比1.87～2.88，色素體多聚于中間或一側(cè)，不充滿細(xì)胞（圖1C）。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察， 初步認(rèn)定藻株XFLZ928.6、 XFLZ928.8 和XFLZ928.15.1 分別屬于鏈帶藻屬（Desmodesmus）、克里藻屬 （Klebsormidium）和Tritostichococcus屬綠藻。

圖1 藻株XFLZ928.6（A）、XFLZ928.8（B）和XFLZ928.15.1（C）的形態(tài)Fig. 1 Morphology of algae XFLZ928.6（A）, XFLZ928.8（B） and XFLZ928.15.1（C）a：體刺 Spines ；b：色素體 Chloroplasts； c：淀粉粒 Starch granules

2.2 致病性

將上述所得綠藻分別制成藻懸液接種香榧后第14 天觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)3 個(gè)藻株處理的香榧幼苗葉片表面均開始出現(xiàn)零星、淺綠色藻點(diǎn)，后隨藻的繁殖，藻點(diǎn)面積逐漸擴(kuò)大并形成呈粉末狀堆積的不規(guī)則藻苔，至23 天時(shí)藻苔連接成片，幾乎覆蓋整個(gè)葉片表面（圖2B、圖2C、圖2D），與田間發(fā)病癥狀一致（圖2E）。而接種清水對照的幼苗生長正常，葉片上未有藻斑發(fā)生（圖2A）。對發(fā)病葉片再次分離純化和鏡檢發(fā)現(xiàn)，其形態(tài)與接種的病原藻形態(tài)相同，最終確定試驗(yàn)中分離獲得的3 種綠藻皆為香榧藻斑病的病原藻。

圖2 3 種藻類的致病性測定Fig. 2 Pathogenicity assay of three algae

2.3 藻株的系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步明確所獲3 種綠藻的系統(tǒng)發(fā)育地位，對藻株的SSU-ITS 區(qū)間序列進(jìn)行分析。綠藻XFLZ928.6、XFLZ928.8 和XFLZ928.15.1 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后均出現(xiàn)清晰的SSU-ITS 區(qū)間條帶（圖3），分別獲得2 288、2 491和1 546 bp 的序列片段（GenBank 登錄號分別為ON040656、ON040657 和ON040658）。經(jīng)Blast 比對發(fā)現(xiàn)，藻株XFLZ928.6 與鏈帶藻屬的同源性最高，與D. armatus的相似性大于97%，選取序列相似性較高的藻株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，本研究分離獲得的XFLZ928.6 與之聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，本研究將XFLZ928.6 最終鑒定為鏈帶藻（D. armatus）。藻株XFLZ928.8 與克里藻屬的綠藻有很高同源性，與軟克里藻（K. flaccidum）的相似性大于99%，系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示該綠藻與軟克里藻聚為一支，支持率為100%，結(jié)合形態(tài)特征，XFLZ928.8 最終被鑒定為軟克里藻。藻株XFLZ928.15.1 與共球藻綱（Trebouxiophyceae）的Tritostichococcussp.、 裂 絲 藻 屬 （Stichococcus）和Desmococcussp.均具有較高同源性，其中與T. corticulus的相似性最高，系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示二者聚為一支，支持率為100%，結(jié)合形態(tài)特征可判定XFLZ928.15.1 為T. corticulus（圖4）。

圖3 藻株XFLZ928.6、XFLZ928.8 和 XFLZ928.15.1 的SSU-ITS 電泳分析Fig. 3 Electrophoresis analysis of SSU-ITS of algae XFLZ928.6,XFLZ928.8 and XFLZ928.15.1

圖4 基于SSU-ITS 基因序列構(gòu)建的3 種綠藻系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of three green algae based on SSU-ITS gene sequence

2.4 病原藻的培養(yǎng)特性

2.4.1 光照對病原藻生長的影響 試驗(yàn)比較不同光照條件對3 種供試藻株的影響，結(jié)果見圖5。光照對藻的生長影響較大，且3 種藻株對光的響應(yīng)表現(xiàn)出一致性。在完全黑暗的情況下，藻不能夠正常生長，且隨著時(shí)間延長生長情況日益惡化。而全天候（24 h）的光照也非藻種最適的光照條件，本試驗(yàn)與自然條件類似的12 h 光照/12 h 黑暗光周期更適宜供試的藻株XFLZ928.6、XFLZ928.8 和XFLZ928.15.1生長。

圖5 不同光照條件對3 種香榧綠藻生長的影響Fig. 5 Effects of light on the growth of three green algae of T.grandis cv. ‘Merrillii’

2.4.2 pH 對病原藻生長的影響 由圖6 可知，3 種藻株在初始pH 為3 時(shí)生長受到嚴(yán)重抑制，在初始pH為11 的條件下生長狀況最優(yōu)，說明初始堿性環(huán)境比中性與酸性環(huán)境更適宜藻的生長。藻株XFLZ928.6和XFLZ928.8 在初始pH 為11 時(shí)，培養(yǎng)4～16 天增長較快，之后生長趨于平緩，而藻株XFLZ928.15.1 在初始pH 為11 時(shí)整個(gè)試驗(yàn)周期生長率一直穩(wěn)步增長。

圖6 不同pH 條件對3 種香榧綠藻生長的影響Fig. 6 Effects of different initial pH levels on the growth of three green algae of T.grandis cv. ‘Merrillii’

2.4.3 溫度對病原藻生長的影響 溫度是影響藻類生長的重要環(huán)境因素。由圖7 可知，整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，3 種株藻在20、25 和30 ℃條件下的生長趨勢相似，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，藻株生長率均先穩(wěn)步上升然后趨于平緩，其最適宜生長溫度為25 ℃，在該溫度條件下，各供試綠藻均表現(xiàn)出良好生長狀態(tài)，相同培養(yǎng)時(shí)間的相對增長率最高，其次為30℃，20 ℃條件下生長率最低。

圖7 不同溫度條件對3 種香榧綠藻生長的影響Fig. 7 Effects of temperature on the growth of three green algaes of T.grandis cv. ‘Merrillii’

2.4.4 不同培養(yǎng)基對病原藻生長的影響 將藻接入各供試培養(yǎng)基后測定藻的相對生長率發(fā)現(xiàn)，BBM 和Zarrouk 培養(yǎng)基不適合香榧綠藻生長，3 種藻株在BBM 和Zarrouk 培養(yǎng)基中均生長較差，藻株XFLZ 928.6 和XFLZ928.15.1 在培養(yǎng)16 天、藻株XFLZ928.8在培養(yǎng)12 天時(shí)出現(xiàn)峰值，隨后生長率逐漸下降。而在BG-11 培養(yǎng)基中，3 種藻株均良好生長，在試驗(yàn)期間生長率隨時(shí)間變化逐漸增加，在24 天時(shí)仍有增長趨勢，且藻的相對生長率始終處于最高位，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于位居第二的SE 培養(yǎng)基，該趨勢對于藻株XFLZ928.8尤其明顯（圖8）。

圖8 不同培養(yǎng)基對3 種香榧綠藻生長的影響Fig. 8 Effects of culture medium on the growth of three green algae of T.grandis cv. ‘Merrillii’

2.5 室內(nèi)藥劑篩選及林間防治

為防治香榧藻斑病，選取當(dāng)前市面上常用的5 種化學(xué)藥劑進(jìn)行室內(nèi)滅藻毒力測定試驗(yàn)，結(jié)果見表1。12%松脂酸銅懸浮劑的滅藻效果最佳，16 天時(shí)EC50最小，為8.33 mg·L?1，顯著低于其他4 種藥劑（P＜0.05），而45%石硫合劑的滅藻效果最差，EC50最大，為2 778.18 mg·L?1。33.5%喹啉銅懸浮劑的滅藻效果僅次于12%松脂酸銅懸浮劑，但優(yōu)于其余3 種藥劑，80%波爾多液與20%噻菌銅劑懸浮劑的滅藻效果相近，EC50差異不顯著。

表1 5 種化學(xué)藥劑的室內(nèi)毒力測定①Tab. 1 Laboratory evaluation of the toxicity of five algicides

將室內(nèi)毒力試驗(yàn)效果較好的12%松脂酸銅懸浮劑和33.5%喹啉銅懸浮劑用于香榧林間防治，結(jié)果（表2）表明，隨著時(shí)間推移，未進(jìn)行藥劑防治的對照林區(qū)藻斑病發(fā)生逐步加重，病害的病情指數(shù)由63.33升至67.20，而供試2 種藥劑的林區(qū)施藥30 天后均有較好防治效果（大于60%），其中12%松脂酸銅懸浮劑的防治效果最佳，為78.11%，高于33.5%喹啉銅懸浮劑的71.62%，說明前者的滅藻效果優(yōu)于后者，與室內(nèi)毒力測定結(jié)果一致。

表2 2 種不同藥劑的林間防治效果Tab. 2 Field control effect of two different algicides

3 討論

3.1 香榧藻斑病癥狀的特殊性

藻斑病是熱帶和亞熱帶地區(qū)木本闊葉植物上的多發(fā)病害，盡管已有報(bào)道中不同寄主其病原藻可能存在差異，但寄生藻在葉片內(nèi)部侵染造成植物組織壞死，導(dǎo)致染病葉片或莖稈表面形成近圓形、凸起的黃褐色或紅褐色、邊緣不整齊病斑（Sunpapaoet al.，2016a）為該病害的共有特征。本研究中香榧藻斑病的癥狀與之截然不同，由于香榧藻斑病的病原藻為氣生藻而非寄生藻，不能侵入植物細(xì)胞內(nèi)部，因此僅在香榧葉片和嫩枝的上表面形成淺綠色至灰綠色不規(guī)則堆積的粉末狀藻斑，病重時(shí)藻斑可覆蓋整個(gè)葉片，嚴(yán)重影響樹木的光合作用，導(dǎo)致香榧落花落果并最終減產(chǎn)。發(fā)病癥狀及病原致病機(jī)制不同，可能是香榧的病原藻與已有報(bào)道闊葉樹的寄生藻不同的原因之一。

3.2 3 種新香榧病原藻群

分離香榧藻斑病的病原發(fā)現(xiàn)，該病害由多種不同形態(tài)的藻群混合發(fā)生引起。葉曉明等（2019）通過形態(tài)學(xué)以及藻株的18S rDNA 和ITS 序列分析，將形態(tài)和大小有所不同的藻株A 和藻株B 均鑒定為A. quadricellulare。本研究從香榧藻斑病的感病葉片上獲得3 種形態(tài)差異較大的藻株類群，與葉曉明等（2019）描述的病原藻均有明顯不同。鑒于藻的形態(tài)受環(huán)境因素的影響較大，采用分子生物學(xué)手段可更客觀反映藻株的系統(tǒng)發(fā)育地位。Pr?schold 等（2020）在研究裂絲藻屬的SSU 及ITS 序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，SSU+ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析方法在藻類鑒定中的可靠性高于ITS 和rbcl 等的單獨(dú)分析鑒別。因此，本研究在形態(tài)鑒定基礎(chǔ)上，在分子層面通過SSU-ITS 測序?qū)? 種香榧綠藻進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，最終將3 種香榧綠藻類群分別確定為柵藻科的鏈帶藻以及絲藻科（Ulotrichaceae）的軟克里藻和T. corticulus。目前，國內(nèi)外對鏈帶藻屬藻類的研究主要集中在生物資源利用和環(huán)境修復(fù)方面（Liet al.，2015；Chandelet al.，2022；?ztürk，2019），迄今為止未見該屬藻類侵染植物的報(bào)道。本研究中，藻株XFLZ928.6 侵染香榧是鏈帶藻屬藻種引起植物病害屬首次發(fā)現(xiàn)。由于Tritostichococcus于2020年才被作為新屬劃分，且缺乏相關(guān)的基因序列數(shù)據(jù)，當(dāng)前國內(nèi)外缺乏關(guān)于Tritostichococcussp.引起植物病害的報(bào)道，本研究則證實(shí)T. corticulus對香榧的致病作用。軟克里藻是重要的生物土壤結(jié)皮微生物，對該屬藻的已有研究多集中在生態(tài)效應(yīng)和物種多樣性方面（Glaseret al.，2017；Karstenet al.，2016；Linet al.，2012；Ry?aneket al.，2016），除Lin 等（2012）首次從中國臺灣柏樹林的闊葉植物葉片上分離獲得軟克里藻外，未見其他相關(guān)研究證實(shí)克里藻屬的綠藻引起植物病害。本研究中，藻株XFLZ928.8 侵染香榧也是軟克里藻危害針葉樹的首次報(bào)道。

綜上，本研究從香榧藻斑病病葉上分離獲得的3種綠藻與已有報(bào)道皆不相同，其中，鏈帶藻和T.corticulus為侵染植物致病的首次報(bào)道，而軟克里藻為侵染針葉樹的首次發(fā)現(xiàn)。本研究不僅為探明香榧藻斑病的病原提供新的有效信息，同時(shí)也拓展了對植物藻斑病病原的認(rèn)知。

3.3 藻株的生長特性

本研究從光照、溫度、初始pH 和營養(yǎng)物質(zhì)需求角度對鏈帶藻、軟克里藻和T. corticulus 的生長特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，這3 種香榧綠藻具有類似的生態(tài)特性，相近的生態(tài)習(xí)性可能是3 種藻在香榧上引發(fā)混合侵染的主要原因。藻對環(huán)境的適應(yīng)性是長期進(jìn)化和選擇的結(jié)果，具有種屬的特異性。本研究中分離的3 種藻均在初始pH 為11 時(shí)生長良好，與葉曉明等（2019）發(fā)現(xiàn)香榧綠藻A. quadricellulare適合在堿性條件下生長的研究結(jié)果一致。然而就溫度適應(yīng)性而言，本研究3 種藻株與已報(bào)道的病原虛幻球藻（Apatococcus lobatus）（20～25 ℃）（王大平等， 2005）、銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）（33 ℃）（王霞等，2005）、小球藻（Chlorella marina）（37.5 ℃）（歐陽崢嶸等， 2010）、 漢斯冠盤藻（Stephanodiscus hantzschii）（3～15 ℃）、小環(huán)藻（Cyclotellasp.）（15 ℃）和斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）（30 ℃）（許珍，2017）均不相同，表明本研究所分離藻株與以上可能均不同。而香榧藻斑病在早春的5—7月發(fā)生最嚴(yán)重，除了梅雨季節(jié)的雨水因素外，藻株對最適生長溫度為25 ℃，也是病害在此時(shí)段發(fā)生較為嚴(yán)重的一個(gè)重要原因。

3.4 藻斑病的藥劑篩選

藻斑病的嚴(yán)重發(fā)生已成為困擾我國長江以南地區(qū)香榧等特色經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題，過去在生產(chǎn)實(shí)踐中常用的石硫合劑（呂軍美等，2015），可能是因長期施用導(dǎo)致其產(chǎn)生抗藥性，防治效果逐漸變差，因?yàn)樵鍖︺~離子具有較強(qiáng)的敏感性，銅制劑被當(dāng)作常用的除藻劑。本研究測定當(dāng)前市面上5 種藥劑對香榧藻斑病病原的毒力和林間防治效果，發(fā)現(xiàn)有機(jī)銅制劑12%松脂酸銅懸浮劑和33.5%喹啉銅懸浮劑的滅藻效果最佳，80%波爾多液次于前二者，效果與20%噻菌銅懸浮劑相近，而生產(chǎn)實(shí)踐中常用于防治藻斑病的石硫合劑效果最差。此外，與波爾多液等無機(jī)銅制劑混配性差、容易污染樹木葉片和果實(shí)、產(chǎn)生藥害的特性相比，松脂酸銅等有機(jī)銅制劑高效安全、不易產(chǎn)生藥害以及對環(huán)境友好的特點(diǎn)令其更具選擇優(yōu)勢。本研究所得試驗(yàn)結(jié)果為香榧藻斑病的高效防控提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在香榧病葉上新發(fā)現(xiàn)3 種混生的病原綠藻類群，經(jīng)鑒定分別屬于鏈帶藻、軟克里藻和T. corticulus，3 種類群的藻株具有類似的環(huán)境適應(yīng)性，均適宜在溫度25 ℃、初始pH11、12 h 光照/12 h 黑暗光周期的BG-11 培養(yǎng)基中生長。結(jié)合室內(nèi)離體抑制試驗(yàn)和林間實(shí)際防治效果，篩選出防治香榧藻斑病的優(yōu)良藥劑12%松脂酸銅和33.5%喹啉銅懸浮劑。研究結(jié)果拓寬了當(dāng)前對香榧藻斑病病原的認(rèn)知，也為病害的防治提供了理論依據(jù)和參考。