印度梨形孢與杜鵑共生體系建立及提高抗旱性效應(yīng)*

樊 玥 羅培潤 王 威 謝 倩 陳清西

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院 福州 350002）

杜鵑，別名山石榴、映山紅、山躑躅等，泛指杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）植物。杜鵑花屬植物是我國種子植物最大的屬，分布非常廣泛，根據(jù)表型和來源可分為春鵑、西鵑、東鵑、夏鵑4 類，其中春鵑（又稱毛鵑）主要包括錦繡杜鵑（R.pulchrum）、白花杜鵑（R. mucronatum）及其變種和雜種（沈蔭椿，2016； 張長芹，2003），錦繡杜鵑因喜濕耐蔭、適宜片植、花量大、花色豐富，成為我國造園常用觀花灌木（徐忠等，2014）。根據(jù)中華人民共和國住房和城鄉(xiāng)建設(shè)部發(fā)布的《城市綠地分類標(biāo)準(zhǔn)》（CJJ/T 85—2017），城市園林綠地主要分為公園綠地、防護綠地、廣場綠地、附屬綠地4 類，杜鵑在我國城市園林綠化的應(yīng)用集中在公園綠地和防護綠地（Guoet al.，2022；李婧等， 2020；林振顯，2021；沈蔭椿，2016；宋明波等， 2022；葉菁等，2020；張長芹，2003）。長江以南各地的園林綠地多應(yīng)用春鵑，常以叢、群、片、塊狀種植，江浙一帶普遍以2～3年生的低矮春鵑作地被植物，在路邊、廣場、居住區(qū)、公共綠地、公園、風(fēng)景區(qū)等作為綠籬廣泛種植（李婧等，2020；劉影等，2015；宋明波等，2022；徐忠等，2014；葉菁等， 2020；張長芹，2003）。

聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會（IPCC）第六次評估報告顯示，未來全球絕大部分有人口居住的地方將出現(xiàn)更多、更強、更持久的極端高溫，當(dāng)全球氣候變暖達(dá)4 ℃時，人類居住區(qū)域大約一半將受到農(nóng)業(yè)生態(tài)干旱加重的影響（Lynnet al.，2021）。杜鵑野生自然種大多分布在山區(qū)陰坡或半陰坡灌木叢間，適應(yīng)林木蔽蔭又有云霧濕氣滋潤的環(huán)境；而馴化野生種和園藝雜交品種因受地區(qū)栽培環(huán)境影響，常畏高溫，抗旱性較差（張長芹，2003）。杜鵑在城市園林綠地中應(yīng)用廣泛，隨著近年來全球氣候變暖，干旱等災(zāi)害性天氣頻發(fā)，在夏季高溫或干旱少雨的月份，園林綠地栽培的杜鵑常出現(xiàn)不同程度的萎蔫乃至死亡。鄭穎（2018）調(diào)查福州公園與主干道路的杜鵑養(yǎng)護情況后發(fā)現(xiàn)，夏秋季節(jié)常出現(xiàn)的持續(xù)性高溫干旱天氣導(dǎo)致杜鵑長勢不佳，易出現(xiàn)萎蔫干枯。因此夏秋季節(jié)，園林綠地杜鵑在日常栽培養(yǎng)護過程中均需消耗大量水資源和人力資源，極端氣候條件下的粗放管理常導(dǎo)致杜鵑長勢差且易死亡，需經(jīng)常補植帶來養(yǎng)護成本日益升高，這些都與綠色節(jié)水型園林發(fā)展要求背道而馳。

抗旱能力強的植物在干旱條件下不僅能生存，而且能維持或接近正常的代謝水平及維持正常生長發(fā)育進程，在干旱脅迫解除后可迅速恢復(fù)正常生產(chǎn)、發(fā)育和繁殖（Blum，201；Fanget al.，2015； Zhanget al.，2022；魏志剛等，2015）。菌根真菌能夠提高植物抗旱性，原因在于菌根真菌在土壤中擁有龐大的菌絲網(wǎng)，可增大植物的吸收面積，降低土壤與植物間的液流阻力，促進根系對水分的吸收，菌套還可減少根系內(nèi)水分喪失，改善寄主植物水分狀況，減緩植物體內(nèi)水分缺失加劇（Bonfanteet al.，2009；唐明作， 2021）?，F(xiàn)有針對菌根真菌的研究，叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungus，AMF）占很大一部分，印度梨形孢（Piriformospora indica）作為一種與AMF 相似的類菌根真菌，同樣可以提高寄主的抗逆性和抗病性，幫助寄主吸收養(yǎng)分以及促進生長等（Vermaet al.，1998），不同之處是AMF 無法在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，也無法在十字花科（Cruciferae）植物上定殖（Bidartondoet al.，2002），而印度梨形孢可在多種人工培養(yǎng)基生長，能大量培養(yǎng)及產(chǎn)孢的特點使其成為潛在的生物菌劑（Oelmülleret al.， 2009），同時印度梨形孢也能定殖一些十字花科的植物，如小白菜（Brassica campestrisssp.chinensis）（蒲堯，2021）、油菜（Brassica campestris）（劉曉曦， 2015；韋巧，2017），這使得其應(yīng)用范圍與AMF相比更廣泛。干旱脅迫下，植物水分含量降低，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）造成氧化傷害從而影響植物生理，阻礙礦物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)移和分布，光合效率降低（王寶山，2010；魏志剛等， 2015）。現(xiàn)有研究中，定殖印度梨形孢后的植物具有較發(fā)達(dá)的根系，根系上有菌絲纏繞，吸收水分能力顯著提高，減少ROS 產(chǎn)生，植物不會因干旱導(dǎo)致對細(xì)胞分裂和擴展的抑制；此外，印度梨形孢可以提高植物的抗氧化系統(tǒng)，主要是提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）等多種抗氧化酶活性（Caoet al.，2023；Poojaet al.，2021；Tsaiet al.，2020；Varmaet al.，2017）。Hosseini 等（2017）研究發(fā)現(xiàn)印度梨形孢定殖后植物會積累更多的脯氨酸（proline, Pro），Pro 作為一種關(guān)鍵性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于改善水分狀況，降低ROS的毒性作用（Diagneet al.，2020；Hosseiniet al.，2018）。細(xì)胞膜脂過氧化會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量丙二醛（malondialdehyde，MDA），印度梨形孢可降低寄主植物中MDA 含量（Ghaffariet al.，2019；Kayaet al.，2019）。印度梨形孢還會通過各種機制減少干旱脅迫對光合作用的不利影響，如增加葉面積與葉片數(shù)量、增強CO2的凈同化作用、保護光合色素不被分解（Ghabooliet al.，2020；Hosseiniet al.，2017；Hussinet al.，2017）。現(xiàn)階段有關(guān)印度梨形孢提高植物抗逆性的研究，大多集中在水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticumaestivum）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、大豆（Glycine max）等作物上，在觀賞植物中的研究較少。

本研究采用國內(nèi)園林綠地常用錦繡杜鵑品種‘紫蝴蝶’為試驗材料，建立印度梨形孢與杜鵑共生體系，探究印度梨形孢定殖的杜鵑植株形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，通過自然失水的模擬干旱脅迫分析印度梨形孢對杜鵑抗旱性的作用及部分相關(guān)生理生化指標(biāo)變化，以期為提高現(xiàn)有園林綠化杜鵑的抗旱性提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試材料錦繡杜鵑‘紫蝴蝶’采自福建農(nóng)林大學(xué)校內(nèi)。2021年6月上旬從整體長勢良好、無病蟲害的植株上端剪取當(dāng)年生半木質(zhì)化且芽眼飽滿的枝條10～12 cm 作為插穗，剪去基部葉片留頂部3～4 葉，剩余葉片剪去2/3，下端斜切。扦插于50 孔標(biāo)準(zhǔn)穴盤中，生根后移栽至上口徑15.7 cm、下口徑12.5 cm、高16.5 cm 的圓形花盆內(nèi)（栽培基質(zhì)質(zhì)量1 kg），每盆1 株，定植180 天后用于后續(xù)試驗。所有栽培基質(zhì)均為泥炭土∶蛭石=2∶1（V/V），試驗在人工氣候室中完成，光照強度312 μmol·m?2s?1，光照12 h/黑暗12 h，溫度20 ℃，濕度60%。

1.1.2 菌液制備 印度梨形孢菌株為福建農(nóng)林大學(xué)陳發(fā)興研究員惠贈。切取φ=0.5 cm 的印度梨形孢菌塊，倒置放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基平板中，28 ℃黑暗培養(yǎng)，待菌絲長至φ=8 cm 沿菌絲邊緣切取菌塊（φ=0.5 cm）置于裝有馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，28 ℃恒溫?fù)u床（200 r·min–1）中振蕩培養(yǎng)3～5 天后得到含有大量印度梨形孢孢子的菌原液，將菌原液在6 000 r·min–1下常溫離心5 min，收集下層沉淀，攪碎后用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為40 g·L?1的菌液。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 印度梨形孢-杜鵑共生體系建立 選擇長勢一致的植株，取最終配制的菌液澆灌在根系周圍土壤中，每株50 mL（每1 kg 栽培基質(zhì)50 mL），每5 天澆灌1 次，記為Pi 組，以清水澆灌為對照組CK，每處理15 株，重復(fù)3 次。每次澆灌菌液后，從Pi 組中隨機選取5 株，重復(fù)3 次，共15 株，隨機取根尖部分進行定殖鑒定并統(tǒng)計定殖率。以開始澆灌當(dāng)天記為0 天，待定殖率≥待定殖時記為定殖成功。

1.2.2 干旱脅迫處理 選取已定殖印度梨形孢的植株，于上午9—10 時充分澆淋，使用土壤記錄儀（VMS-3002-TRREC-N01，建大仁科）測定每盆土壤相對含水率，達(dá)80%后停止?jié)补?，待各處理土壤平均相對含水率降?0%時記為干旱脅迫0 天（GB/T 32136—2015），脅迫20 天后復(fù)水，以鑒別和統(tǒng)計植株死亡率。以未定殖印度梨形孢的植株為CK，進行相同處理，每處理15 株，重復(fù)3 次。

在干旱脅迫后的第0、5、10、15 和20 天上午9—10 時，每處理隨機選取5 株，重復(fù)3 次，共15 株，采集枝條頂端生長點以下第5～10 片功能葉去除主脈后共2 g，剪碎混樣，取0.3 g 鮮樣進行相對電導(dǎo)率測定，其余樣品迅速置于液氮中，?80 ℃冰箱儲存，待進行Pro、MDA 和SOD 測定。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 定殖鑒定 隨機采用臺盼藍(lán)染色法（王慧俐，2015）、掃描電鏡觀察法（孫超，2010）和印度梨形孢延伸因子TEF420 的PCR 檢測法（史清英，2015），鑒定印度梨形孢是否定殖杜鵑根，并統(tǒng)計定殖根數(shù)量。

匯總后統(tǒng)計定殖根數(shù)量，計算定殖率：

式中：CR 為定殖率（colonization rate）；NCR 為定殖根數(shù)量（number of colonized roots）；TNOR 為觀察根總數(shù)（total number of observed roots）。

1.3.2 葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)與根系超微結(jié)構(gòu)觀察與測定從CK 組、Pi 組中隨機選取10 株，重復(fù)3 次，在定殖成功當(dāng)天與定殖成功30 天后采集枝條頂端生長點以下第5～8 片功能葉共30 片，洗凈擦干后，用于葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察。隨機采集每株根系的根尖部分，用于根系超微結(jié)構(gòu)觀察。

將采集葉片置于掃描儀（Scanjet G4050，HP）下掃描成像后，從中任選10 片測定葉片鮮質(zhì)量（leaf fresh weight，LFW）（g）、干質(zhì)量（leaf dry weight， LDW）（g），其余葉片任選5 片于葉片中部垂直葉脈橫切，取1 cm×1 cm 無主脈葉片組織制作石蠟切片，并置于10×40 倍的光學(xué)顯微鏡（DMI8，Leica）下觀察，采集切片圖像。取每株根系的根尖部分2 mm 左右小段，處理并制片后置于透射電鏡（HT7800，HITACHI）下觀察根尖中柱細(xì)胞并采集圖像。

利用Image J 分析軟件分別測量葉片外部形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)、葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)和根系超微結(jié)構(gòu)指標(biāo)。葉片外部形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)包括葉面積（leaf area，LA）（cm2）、葉長（leaf length，LL）（cm）、葉寬（leaf width,LW）（cm）、葉形指數(shù)（leaf index, LI）（cm/cm）=LL/LW，其中LL 為葉基（不含葉柄）到葉尖的距離，LW 為葉片上與主脈垂直方向上的最寬處。葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)包括葉片厚度（leaf thickness，LT）（μm）、上表皮厚度（upper epidermis thickness，UET）（μm）、下表皮厚度（lower epidermis thickness，LET）（μm）、柵欄組織厚度（palisade parenchyma thickness，PT）（μm）、海綿組織厚度（spongy parenchyma thickness， ST）（μm）、 柵海比PT/ST （μm/μm）。每處理制作5 個樣片，每個葉片選取6 個視野，所有測量數(shù)據(jù)均為30 個視野下的平均值。根系超微結(jié)構(gòu)指標(biāo)包括細(xì)胞壁厚度（cell wall thickness， CWT）（μm）、 細(xì)胞截面積（cell area， CA）（μm2），上述視野加速電壓均為80 kV，放大倍率2 500 倍。每處理測量3 株根系，每株根系選取10 個視野，所有測量數(shù)據(jù)均為30 個視野下的平均值。

1.3.3 干旱脅迫下杜鵑植株葉片形態(tài)等級的劃分干旱脅迫處理時，每5 天統(tǒng)計所有植株葉片形態(tài)等級，觀察植株枝條頂端生長點以下第5～15 片葉，統(tǒng)計萎蔫、下垂、皺縮葉片比例，然后按表1 所示標(biāo)準(zhǔn)（高曉寧等，2017）劃分等級。

表1 干旱脅迫下杜鵑葉片形態(tài)等級標(biāo)準(zhǔn)Tab. 1 Leaf morphological grade standard of Rhododendron under drought stress

1.3.4 干旱脅迫下葉片質(zhì)膜透性與半致死時間的確定 葉片質(zhì)膜透性測定采用電導(dǎo)儀法。半致死時間計算參照陳樹鋼等（2011）方法。采用SPSS 26.0 將不同干旱脅迫處理時間下未接菌CK 組與接菌Pi 組葉片的相對電導(dǎo)率進行一元線性回歸分析后與Logistic 方程y=k/(1+ae?bt)擬合，式中：y為不同干旱脅迫時間下的相對電導(dǎo)率（%），t為干旱脅迫處理時間（d），k為y的最大極限值，a、b為方程參數(shù)。將Logistic方程作線性轉(zhuǎn)化處理得ln[(k-y)/y]=lna-bt， 令y1=ln[(k?y)/y]，則轉(zhuǎn)化為相對電導(dǎo)率y1（%）與干旱脅迫時間t（d）的線性方程，線性轉(zhuǎn)化后半致死時間LT50（d）=lna/b。

1.3.5 Pro、MDA、SOD 的測定 用Pro 測試盒（A107-1-1，南京建成）測定Pro 含量；用硫代巴比妥酸顯色法（王學(xué)奎等，2015）測定MDA 含量；用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定SOD 活性（王學(xué)奎等， 2015）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2016 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 26.0 進行數(shù)據(jù)分析，Adobe Photoshop 2021、Image J、GraphPad Prism 8.0.2 進行圖像處理、測定與繪制；采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯新復(fù)極差多重比較檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢的定殖情況

由圖1 可知，澆灌4 次印度梨形孢菌液（20 天）后，印度梨形孢在根系開始逐步定殖，定殖率達(dá)18.33%，澆灌5 次（25 天）后定殖率達(dá)91.67%，5 次澆灌后定殖率增加73.34%，上升速率最快。澆灌6 次（30 天）后定殖率達(dá)100%。

圖1 印度梨形孢定殖情況Fig. 1 The colonization of P. indica

2.2 印度梨形孢對葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

處理60 天后，Pi 組葉片鮮質(zhì)量和干質(zhì)量極顯著增加（P＜0.01），分別較同時期CK 組增加56.21%、79.07%（圖2）。Pi 組較CK 組葉面積增大58.62%，差異極顯著，但葉形指數(shù)無顯著性差異。處理60 天后Pi 組葉片上、下表皮厚度較CK 組顯著降低（P＜0.05），Pi 組柵欄組織厚度與柵海比較CK 組極顯著增加，分別增加25.01%、25.81%，葉片結(jié)構(gòu)更加緊密。

圖2 定殖印度梨形孢后葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化Fig. 2 Changes of leaf morphological structure after P. indica colonization

2.3 印度梨形孢對杜鵑根系超微結(jié)構(gòu)的影響

無論是否定殖印度梨形孢，根尖的中柱細(xì)胞結(jié)構(gòu)相同，呈梯形或近長方形，細(xì)胞整體完整，細(xì)胞膜清晰且緊貼細(xì)胞壁（圖3）。細(xì)胞中心為液泡，占整個細(xì)胞的90%左右，原生質(zhì)體中存在各種細(xì)胞器。處理60 天后，2 組細(xì)胞器均呈正常狀態(tài)（圖3D、E），Pi組的細(xì)胞面積較CK 組增大44.49%，差異極顯著，細(xì)胞壁厚度變化不大（圖3B、C）。

2.4 干旱脅迫下植株受害情況等級

由圖4A 可知，CK 組葉片在脅迫第0 天、Pi 組葉片在脅迫第5 天出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。隨著干旱脅迫時間延長，CK 組葉片萎蔫更嚴(yán)重；脅迫15 天時，CK 組中3 級和4 級植株總數(shù)占整組的51.33%，20 天時占64%。Pi 組30 天時處于3 級和4 級的植株總和占整組的20%。CK 組受干旱脅迫更重。

圖4 定殖印度梨形孢對植株抗干旱能力的影響Fig. 4 Effects of colonizing P. indica on plant drought resistance

由圖4B 可知，隨著干旱脅迫時間延長，CK 組與Pi 組的相對電導(dǎo)率均呈上升趨勢。CK 組上升速率較Pi 組快，脅迫20 天同比0 天上升260.11%，差異顯著；10～15 天之間上升幅度最大，上升量占20 天總上升量的32.91%。脅迫20 天時CK 組的相對電導(dǎo)率是Pi 組的2.57 倍。復(fù)水10 天后CK 組的相對電導(dǎo)率仍呈上升趨勢，復(fù)水10 天后較脅迫20 天上升26.09%，差異顯著。Pi 組復(fù)水前后差異不顯著。未定殖印度梨形孢的植株細(xì)胞膜破壞更嚴(yán)重，受脅迫程度更深。

由圖4C 可知，復(fù)水10 天后，Pi 組植株死亡率為6.67%，CK 組植株死亡率為52.33%，Pi 組植株死亡率降低45.66%，差異極顯著。

綜上，結(jié)合植株外部形態(tài)特征、葉片細(xì)胞膜情況以及復(fù)水后植株死亡情況，經(jīng)印度梨形孢定殖的杜鵑植株抗旱性顯著增強。

2.5 半致死時間（LT50）

由表2 可知，CK 組和Pi 組杜鵑在不同干旱脅迫時間t（d）下的相對電導(dǎo)率y1（%）變化趨于線性關(guān)系且均達(dá)極顯著水平，確定系數(shù)（R2）分別為0.913 和0.803，結(jié)果可靠。一般情況下，LT50越長，說明干旱脅迫對細(xì)胞膜的傷害程度越小，抗旱性越強，反之抗旱性越差。CK 組和Pi 組的LT50分別為8.49 天和41.32 天，相差32.83 天，說明定殖印度梨形孢植株的抗旱性顯著增強。

表2 干旱脅迫下相對電導(dǎo)率回歸方程及干旱半致死時間Tab. 2 Logistic equation of relative conductivity and drought half lethal time（LT50）under drought stress

2.6 干旱脅迫對Pro、MDA 含量與SOD 活性的影響

由圖5A 可知，隨著干旱脅迫時間延長，CK 組Pro 含量逐漸積累，脅迫20 天較0 天時上升160.51%；但Pi 組整體差異不顯著，未出現(xiàn)Pro 積累現(xiàn)象。

圖5 干旱脅迫下脯氨酸、丙二醛含量與超氧化物歧化酶活性的變化Fig. 5 Changes of proline, MDA content and SOD activity under drought stress

由圖5B 可知，隨著干旱脅迫時間延長，CK 組MDA 含量呈先升后降趨勢，Pi 組整體無顯著變化。干旱脅迫后10 天時，CK 組MDA 含量達(dá)到最高，2 組差異極顯著，Pi 組較CK 組降低38.85%。整體來看，Pi 組MDA 含量在不同脅迫時間下均低于CK 組，說明印度梨形孢可能通過減輕植株膜脂過氧化程度來提高其抗旱性。

由圖5C 可知，隨著干旱脅迫時間延長，CK 組SOD 活性呈下降趨勢，脅迫20 天同比0 天時下降60.54%，15～20 天內(nèi)下降量占總下降量的63.68%，但Pi 組在不同脅迫時間的差異不顯著。在20 天時，CK組與Pi 組的SOD 活性呈極顯著差異，Pi 組較CK 組高101.44%。

3 討論

3.1 印度梨形孢能與杜鵑形成互利共生關(guān)系

本試驗共澆灌印度梨形孢菌液6 次，第4 次澆灌后，即澆灌15 天觀察到印度梨形孢定殖。澆灌印度梨形孢5 次后定殖率達(dá)91.67%，較澆灌4 次提高73.34%，此時已基本全部定殖。澆灌6 次后不論哪種定殖鑒定方法均可確定印度梨形孢已完全定殖于杜鵑根系，定殖率達(dá)100%，說明澆灌5 次即滿足高定殖率的要求。印度梨形孢可提高寄主植物吸收營養(yǎng)的能力，促進植物生長發(fā)育（Caoet al.，2023; Ghaffarietal.，2019；Vermaet al.，1998）。現(xiàn)有研究中印度梨形孢能夠增加根系體積、枝條長度與植株干質(zhì)量，此外，還會增加不同寄主植物的葉面積和葉片數(shù)（Ghaffariet al.，2019；Vermaet al.，1998；王慧俐，2015）。本研究印度梨形孢定殖30 天后的杜鵑葉片鮮質(zhì)量和干質(zhì)量增加、葉面積更大，說明印度梨形孢定殖對杜鵑葉片具有促生作用。葉片橫截面內(nèi)部構(gòu)造發(fā)生變化，上、下表皮厚度減小，柵欄組織厚度增大，柵海比增大，葉片結(jié)構(gòu)更緊密。柵欄組織具有儲水功能，其細(xì)胞中存在體積較大的液泡，這種結(jié)構(gòu)對植物抗旱有重要意義，柵欄組織厚度增大還可提高葉綠體對光照和CO2的吸收面積，不但利于植物光合作用，而且在水分供應(yīng)適宜情況下可增加植物蒸騰效率（Vogelmannet al.， 1993）。

植物根系狀態(tài)影響植物生長發(fā)育進程?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，寄主植物根系與印度梨形孢共生后，根系生長發(fā)育被顯著促進，尤其側(cè)根數(shù)量增多（Hosseiniet al.，2017；Hussinet al.，2017；Vermaet al.，1998； Zhanget al.，2018）。 Sahay 等（1999）研究印度梨形孢促進天竺葵（Pelargonium hortorum）與一品紅（Euphorbia pulcherrima）扦插生根時發(fā)現(xiàn)，定殖后插條的生根能力顯著提高，其不定根長度、數(shù)量較未定殖顯著增加。本研究經(jīng)印度梨形孢定殖后的苗木須根數(shù)量顯著增多，根細(xì)胞面積顯著增大，細(xì)胞質(zhì)含量增多。

3.2 印度梨形孢能提高杜鵑的抗旱性

植物受干旱脅迫時，通常直觀表現(xiàn)為葉片萎蔫。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫時間延長，CK 組葉片逐漸出現(xiàn)萎蔫、下垂、干枯乃至脫落現(xiàn)象，而Pi 組脅迫程度整體較輕，當(dāng)脅迫20 天后終止試驗，CK 組的死亡率顯著高于Pi 組。

不論是葉片萎蔫情況還是植株死亡率，均直觀反映出印度梨形孢定殖杜鵑的抗旱能力提高，但植物所有表觀變化均是一系列復(fù)雜生理生化反應(yīng)內(nèi)在變化的結(jié)果。細(xì)胞膜對外界干旱脅迫反應(yīng)較敏感，細(xì)胞膜上的受體蛋白與脅迫信號感知結(jié)合后通過磷酸化反應(yīng)、第二信使等將信號在細(xì)胞中擴大、傳遞傳導(dǎo)，之后啟動相對響應(yīng)因子以及相關(guān)抗性基因，協(xié)調(diào)植物抗性（Mahajanet al.，2005）。干旱脅迫直接導(dǎo)致細(xì)胞膜透性變大，穩(wěn)定性降低，大量電解質(zhì)與某些小分子有機物外滲，細(xì)胞的物質(zhì)交換平衡被破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷（王寶山，2010）。本研究中，干旱脅迫使CK 組葉片相對電導(dǎo)率較Pi 組大幅上升，脅迫10～20 天內(nèi)極顯著升高，復(fù)水10 天后仍極顯著高于Pi 組，說明干旱脅迫給細(xì)胞膜帶來不可逆的傷害，且這種傷害可能存在滯后性。干旱脅迫會加深植株膜脂過氧化程度，導(dǎo)致MDA 積累，現(xiàn)有研究認(rèn)為，與印度梨形孢共生會降低寄主植物中的MDA 含量，緩解這種積累現(xiàn)象（Caoet al.，2023； Sunet al.，2010），本研究中Pi 組無MDA 積累現(xiàn)象出現(xiàn)，整體較平穩(wěn)，而CK 組MDA 含量則呈先升后降趨勢，于脅迫10 天時達(dá)到峰值。以上情況均說明干旱脅迫對未定殖印度梨形孢的杜鵑細(xì)胞膜產(chǎn)生了不可逆的損傷。

干旱脅迫會打破植物體內(nèi)ROS 產(chǎn)生與清除之間的平衡，導(dǎo)致其受到活性氧威脅（Fathiet al.， 2016）。干旱脅迫發(fā)生時，過高的ROS 會損害細(xì)胞膜、酶、葉綠體色素，使細(xì)胞器功能失調(diào)、光合作用等多種生理過程失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡、植株損傷乃至死亡（Hussainet al.，2019）。植物體內(nèi)存在抗氧化防護系統(tǒng)，抗氧化酶類可減少ROS 產(chǎn)生，清除已生成的ROS，以減輕植物傷害，其中SOD 作為清除ROS 系統(tǒng)的第一道防線，主要功能為清除O2?，將O2?歧化成H2O2，在保護酶系統(tǒng)中處于核心（Hussainet al.，2019；Scandalios，1993）。一般認(rèn)為，干旱脅迫下的SOD 活性與植物抗氧化能力呈正相關(guān)（Scandalios， 1993），在短期或輕度干旱脅迫下其活性呈上升趨勢，但在長期或重度脅迫下呈下降趨勢（王建華等，1989）。本研究中CK 組SOD 活性隨脅迫程度加深逐漸降低，在脅迫20 天時達(dá)到最低，而Pi 組整體變化不大。

干旱脅迫時，植物會積累各種有機、無機物質(zhì)提高細(xì)胞液濃度，以降低細(xì)胞滲透勢，增強其保水能力（魏志剛等，2015）。Pro 作為一種代表性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量高低與植物抗旱能力有著復(fù)雜關(guān)系。部分研究認(rèn)為，Pro 應(yīng)作為脅迫敏感型指標(biāo)，對干旱較敏感的植株更容易積累大量Pro（湯章城，1984）；亦有研究認(rèn)為抗旱性越強的植株積累的Pro 越多（Patelet al.，1985）。本研究中，隨干旱脅迫加深，CK 組逐漸積累大量Pro，Pi 組則未出現(xiàn)這種現(xiàn)象。本研究認(rèn)為，植物體內(nèi)Pro 含量在一定程度上說明植物體內(nèi)水分情況，輕度干旱脅迫下Pro 積累具有滲透調(diào)節(jié)作用，但隨著脅迫程度加深與脅迫時間延長，超出植物自身的可調(diào)節(jié)范圍，Pro 含量可能是受脅迫程度大小的指標(biāo)。

此外，本研究將2 組不同脅迫時間下的相對電導(dǎo)率進行一元線性回歸分析后與Logistic 方程擬合，得到半致死時間（LT50），結(jié)果表明Pi 組LT50較CK 組延長32.83 天，差異極顯著?，F(xiàn)有研究中，半致死這一概念常用于植物抗寒和耐熱評價，在抗旱研究中還不常見，對現(xiàn)實中預(yù)測干旱脅迫的臨界值的精度可能還不夠，但仍能在一定程度上反映其抗旱性高低，后續(xù)將對本研究得出的半致死時間進行反向驗證。

4 結(jié)論

本研究表明，印度梨形孢能與杜鵑形成互利共生關(guān)系，并可能通過以下途徑提高杜鵑抗旱性：定殖印度梨形孢的杜鵑植株擁有較大根量，能夠提高植株吸水能力，改善植株水分狀況，減少ROS 生成；此外，印度梨形孢通過保證較高的SOD 酶活性，以清除過多的ROS，減少植株膜脂過氧化程度，降低MDA積累，維持細(xì)胞膜透性。結(jié)合以上2 點，印度梨形孢定殖會減輕干旱脅迫給杜鵑植株帶來的氧化損傷，延長杜鵑半致死時間，提高杜鵑抗旱性，故認(rèn)為印度梨形孢可作為一種菌劑用于提高作為園林綠化植物的杜鵑的抗旱性。