外周血循環(huán)腫瘤細胞的表型及TOP2A表達與膀胱癌復發(fā)轉移及預后的關系

鐘蛟 劉浩然 汪道琦 劉建和

膀胱癌是泌尿外科最常見的腫瘤之一，其遠處轉移是導致膀胱癌患者死亡的主要原因[1]。影像學技術難以發(fā)現(xiàn)早期微小轉移灶，約50%的肌層浸潤性膀胱癌(muscular invasive bladder cancer, MIBC)確診時已有微轉移灶[2]。外周血循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTC)是指能逃避自身免疫監(jiān)視進入外周血中的腫瘤細胞[3]。研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者外周血中CTC的存在與疾病轉歸不良有關[3-4]。目前從單個CTC水平研究膀胱癌預后的文章較少，本文對45例膀胱癌患者的單個CTC上上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型和拓撲異構酶Ⅱα(topoisomerase-II alpha, TOP2A)表達進行檢測分析，研究其對膀胱癌進展及預后的影響。

對象和方法

一、一般資料

收集從2013年9月至2016年8月在我院行根治性膀胱全切或經(jīng)尿道膀胱電切術，且病理確診為膀胱癌行CTC檢測的45例患者。年齡35～84歲，平均60.93歲，男40例，女5例，腫瘤pTNM分期：T1期17例、T2期14例、T3期8例、T4期6例、N1期6例，腫瘤組織病理分級(根據(jù)WHO 2004年分級標準)：高級別31例、低級別14例。本研究經(jīng)我院倫理審查委員會同意。

二、方法

采用CanPatrolTM二代多重RNA原位檢測膀胱癌手術前外周血CTC計數(shù)、分型及TOP2A的表達。用8號采血針管和EDTA抗凝采血管采集2管(5 ml/管)外周血樣本，轉移至樣本保存管中，進行預處理。經(jīng)預處理后的樣本抽濾至過濾器中，用特異捕獲探針與目標mRNA進行雜交，擴增探針與捕獲探針進行雜交，為雜交信號的擴大做準備。用標記有熒光基因的標記探針與擴增探針進行雜交，產(chǎn)生熒光信號，利用自動識別系統(tǒng)閱讀熒光信號，自動判斷檢測結果。CTC分為上皮型、混合型和間質型，依據(jù)TOP2A表達量分為高、中、低和無表達。電話隨訪患者手術后腫瘤復發(fā)時間及生存狀況。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件進行描述性統(tǒng)計分析。分類變量報告為計數(shù)和百分比，連續(xù)變量報告為平均值和標準差，計數(shù)型資料采用χ2或Fisher精確檢驗。采用Kaplan-Meier法中的Log-rank法進行生存分析來計算影響患者生存時間及生存狀態(tài)的因素，并繪制生存函數(shù)圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、外周血CTC陽性率及CTC中EMT表型和TOP2A的表達

45例患者中有35例(77.8%)外周血中檢出CTC，共檢出CTC 160個，每個樣本CTC檢出范圍0～17個，平均3.56個，中位數(shù)3個，其中上皮型40個(25.0%)、間質型53個(33.1%)、混合型67個(41.9%)。單個CTC水平的TOP2A高/中表達共108個(67.5%)，TOP2A低表達/無表達共52個(32.5%)。CTC中不同EMT表型間TOP2A表達量差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.375，P<0.05)，見表1。

表1 CTC上EMT 表型與TOP2A的表達[個(%)]

二、外周血CTC陽性率、數(shù)量、TOP2A表達及TOP2A高/中表達的EMT表型與腫瘤分期、病理分級的關系

卡方檢驗結果顯示，非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscular invasive bladder cancer, NMIBC)與MIBC兩組患者外周血CTC的陽性率、數(shù)量、TOP2A高/中表達、TOP2A高/中表達上皮型和TOP2A高/中表達間質型比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；但對兩組患者CTC上TOP2A高/中表達混合型檢出情況進行比較時，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。不同臨床分期、病理分級膀胱癌患者外周血CTC的TOP2A高/中表達存在差異(χ2=11.24，P<0.05),T2～4G3患者檢測到TOP2A高/中表達的CTC更多；但在不同臨床分期、病理分級膀胱癌患者外周血CTC的陽性率、CTC檢出數(shù)量、TOP2A高/中表達上皮型、TOP2A高/中表達混合型和TOP2A高/中表達間質型比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表3。研究結果顯示，膀胱癌是否淋巴結轉移與CTC檢出、不同EMT表型、TOP2A表達及TOP2A高/中表達的EMT表型之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 外周血CTC檢測數(shù)據(jù)與膀胱腫瘤浸潤程度的關系[例(%)]

表3 外周血CTC檢測數(shù)據(jù)與膀胱腫瘤不同臨床分期及病理分級的關系[例(%)]

三、外周血CTC檢出、數(shù)量、TOP2A表達與NMIBC及MIBC的無病生存期(disease-free survival time, DFS)和總生存期(overall survival, OS)的關系

45例患者中，41例隨訪2～74個月，失訪4例，中位隨訪時間32個月，無病生存25例，死亡14例。在17例NMIBC患者中，失訪2例，死亡0例，復發(fā)1例，而在28例MIBC患者中，失訪2例，死亡14例，復發(fā)19例。通過KM法對17例NMIBC患者的隨訪結果進行生存分析，結果顯示，未發(fā)現(xiàn)外周血CTC檢出、數(shù)量、EMT表型及TOP2A表達與DFS及OS存在差異(P>0.05)。通過KM法對28例MIBC患者的隨訪結果進行生存分析，結果顯示，DFS與CTC的檢測陽性、TOP2A高/中表達及TOP2A高/中表達的間質型存在相關性(P<0.05)，未觀察到DFS與CTC的數(shù)量及TOP2A高/中表達的混合型和上皮型存在相關性(P>0.05)。同時研究結果顯示，OS與CTC的陽性及TOP2A高/中表達顯著相關(P<0.05)，未觀察到OS與CTC的數(shù)量及TOP2A高/中表達的不同EMT表型存在顯著差異(P>0.05)。圖1、圖2分別為MIBC各組DFS和OS的KM曲線及P值。分別對圖1中的各圖分組進行差異性比較，因樣本量(n=28，<40)較小,Fisher檢驗結果顯示，MIBC復發(fā)轉移與否與CTC陽性(P=0.007)、TOP2A高/中表達(P=0.003)及TOP2A高/中表達的間質型(P=0.013)之間差異有統(tǒng)計學意義；同樣對圖2中的各圖分組進行差異性比較，F(xiàn)isher檢驗結果顯示，MIBC死亡與CTC陽性(P=0.04)及TOP2A高/中表達(P=0.021)之間差異有統(tǒng)計學意義。

A：CTC檢測陽性vs CTC檢測陰性；B：低CTC計數(shù) vs 高CTC計數(shù)；C：TOP2A高/中表達vs TOP2A低/無表達；D：TOP2A高/中表達間質型 vs 非TOP2A高/中表達間質型；E：TOP2A高/中表達混合型 vs 非TOP2A高/中表達混合型；F：TOP2A高/中表達上皮型 vs 非TOP2A高/中表達上皮型圖1 CTC上TOP2A和EMT表型與DFS的KM曲線

A：CTC檢測陽性vs CTC檢測陰性；B：低CTC計數(shù) vs 高CTC計數(shù)；C：TOP2A高/中表達vs TOP2A低/無表達；D：TOP2A高/中表達間質型 vs 非TOP2A高/中表達間質型；E：TOP2A高/中表達混合型 vs 非TOP2A高/中表達混合型；F：TOP2A高/中表達上皮型 vs 非TOP2A高/中表達上皮型圖2 CTC上TOP2A和EMT表型與OS的KM曲線

討 論

CTC被認為是腫瘤轉移性擴散的源頭，CTC成為惡性腫瘤危險分層和治療檢測的重要工具[5-6]。盡管體內(nèi)CTC的存在與膀胱癌預后不良有關[7-8]， 但許多患者即便體內(nèi)存在CTC，也不一定會出現(xiàn)腫瘤的轉移和復發(fā)，使得從單細胞水平上對CTC的表型特征及基因表達進一步研究變得尤為重要，可能發(fā)現(xiàn)更多與腫瘤轉移及預后相關的信息。腫瘤細胞轉移是一緩慢、低效而致命的過程，而研究認為EMT是大多數(shù)腫瘤生長和轉移的必然過程[2，9-10]，CTC主要分為上皮型、混合型和間質型，其中間質型的惡性程度高，預后差，可能因間質型CTC是經(jīng)EMT轉換而來，使自身形態(tài)發(fā)生了改變，黏附能力降低，可塑性強，與更容易發(fā)生脫落轉移有關。TOP2A是有絲分裂的重要核酶，研究已證實TOP2A的高表達與膀胱癌復發(fā)和預后不良密切相關[11-13]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在MIBC中CTC陽性率較NMIBC更高，CTC與腫瘤浸潤程度的關系與既往研究結論一致[3-5]；同時，T2～4G3和T2～4G1～2患者CTC陽性率較T1G3和T1G1～2更高，提示膀胱癌的T分期、病理分級越高，則外周血中檢測出CTC的幾率就越高；本研究中不同T分期和病理分級之間CTC陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.069)，可能與病例數(shù)少有關。此外，研究證實CTC數(shù)量越多，膀胱癌患者的預后越差[3,10，14-15]，本研究中CTC數(shù)量與DFS、OS無統(tǒng)計學差異，可能與病例數(shù)少以及CTC個數(shù)的多少定義為臨界值有關。

本研究中，雖然大多數(shù)CTC陽性的患者檢測到TOP2A表達，但TOP2A的表達模式在不同表型中不同。Turley等[16]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中TOP2A表達水平較正常細胞更高。研究發(fā)現(xiàn)尿路上皮癌中TOP2A的高表達可能預示著腫瘤的侵襲性更高、預后更差[11，17-18]。我們研究發(fā)現(xiàn)MIBC和高級別膀胱癌患者的TOP2A水平均高于NMIBC和低級別膀胱癌，而且TOP2A高/中表達MIBC患者的DFS和OS明顯低于TOP2A低/無表達患者，結果與既往研究一致[12,18]，即TOP2A的表達水平反映了腫瘤的侵襲性；但我們在NMIBC患者的隨訪檢測中，未發(fā)現(xiàn)CTC中TOP2A高表達與腫瘤復發(fā)和生存之間存在差異，這可能與本研究病例數(shù)太少有關，增大樣本量可能會產(chǎn)生有意義的結果。

腫瘤侵襲性與EMT密切相關，CTC可分為上皮型、混合型和間質型。張瑞赟等[19]研究表明，間質型和混合型在MIBC中檢出率明顯高于NMIBC，上皮型卻無差異；金一等[20]研究發(fā)現(xiàn)，間質型是膀胱癌復發(fā)轉移的獨立危險因素；本研究未發(fā)現(xiàn)CTC表型與膀胱癌臨床分期、病理分級存在統(tǒng)計學意義，但間質型在MIBC 17/28(60.7%)中的檢出率較NMIBC 6/17(35.3%)多，統(tǒng)計學無意義可能是由于樣本量太小，需進一步擴大樣本量進行驗證。在單個CTC水平上研究EMT表型和TOP2A共同表達發(fā)現(xiàn)，在MIBC中TOP2A高/中表達間質型的檢出率更高，且TOP2A高/中表達間質型與DFS之間存在統(tǒng)計學意義，與OS之間差異無統(tǒng)計學意義，但其間質型中位OS明顯短于混合型和上皮型，這可能與隨訪時間短或病例數(shù)少相關，故我們推測，當MIBC患者間質型CTC上TOP2A基因高表達時，出現(xiàn)療效差、復發(fā)轉移快的可能大。然而，我們在17例NMIBC患者的隨訪研究中，除2例失訪，1例復發(fā)，其余患者均存活，未發(fā)現(xiàn)單個CTC上TOP2A和間質型共同表達與DFS、OS之間存在相關性，但二者共表達的中位DFS和OS均短于其他表型，可能與術后化療、隨訪時間短及病例少等相關，尚需動態(tài)檢測CTC、擴大樣本量及延長隨訪時間等研究來進一步驗證。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移與CTC檢出、TOP2A表達及EMT表型的相關性，可能與腫瘤淋巴結轉移機制與血性轉移機制不同，無法通過CTC評估淋巴結轉移情況[19]。

綜上所述，不同EMT表型和TOP2A標記物在CTC中有著不同的表達模式，CTC上不同標記物在NIMBC和MIBC之間也存在差異，在MIBC患者中更常檢測到TOP2A高/中表達和TOP2A高/中表達間質型的CTC，提示這些細胞可能在腫瘤侵襲和疾病進展過程中發(fā)揮一定作用，是腫瘤分期晚、預后差的原因，值得進一步研究來驗證。