基于 γ-干擾素釋放試驗(yàn)的麻風(fēng)分枝桿菌感染篩查診斷

李艷艷 王 川 孫樂樂 潘 晴 王 娜 周桂芝 劉 紅 張福仁

1山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院,山東濟(jì)南,250022;2山東省皮膚病性病防治研究所,山東濟(jì)南,250022

麻風(fēng)是一種由麻風(fēng)分枝桿菌感染易感人群導(dǎo)致的慢性肉芽腫性疾病,主要侵犯皮膚和周圍神經(jīng),嚴(yán)重者可通過血液或淋巴系統(tǒng)播散[1］。根據(jù)機(jī)體對(duì)麻風(fēng)菌免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱,麻風(fēng)可大致分為五個(gè)類型,LL型：特異性Th1型細(xì)胞免疫弱或缺失,細(xì)菌指數(shù)高;TT型：特異性Th1型細(xì)胞免疫強(qiáng),高IFN-γ分泌,低細(xì)菌指數(shù);BT、BL、BB型為免疫不穩(wěn)定型。根據(jù)皮損數(shù)目可將患者分為皮損少于5個(gè)的少菌型(PB,包括TT和BT型)和多于5個(gè)的多菌型(MB,包括LL、BL和BB型)。麻風(fēng)仍是我國(guó)和WHO傳染病防控的重點(diǎn),對(duì)麻風(fēng)患者進(jìn)行早期篩查已成為防治麻風(fēng)、消除麻風(fēng)危害的重要手段[2］。

某些分枝桿菌在生長(zhǎng)早中期分泌到胞外的一些蛋白,具有高度免疫原性和特異性,常作為分枝桿菌感染診斷和預(yù)防研究的重要靶抗原。6 kD早期分泌抗原(ESAT-6)和早期濾液蛋白-10(CFP-10)是來源于結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白,其能誘發(fā)特異性Th1應(yīng)答,與細(xì)菌的毒力密切相關(guān),可提供抗結(jié)核桿菌感染的保護(hù)性[3］?；贓SAT-6/CFP-10建立的兩種商業(yè)化的檢測(cè)技術(shù)T-SPOT.TB和QuantiFERON-Gold已在臨床上廣泛應(yīng)用,通過γ-干擾素釋放試驗(yàn)(Interferon-γ release assay,IGRA)對(duì)結(jié)核感染者進(jìn)行有效診斷,且不受BCG預(yù)防接種的影響[4］。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6和CFP-10與麻風(fēng)分枝桿菌同源物之間有一定的同源性[5,6］。將結(jié)核分枝桿菌ESAT-6/CFP-10作為刺激性抗原,在麻風(fēng)患者外周血及其單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)桿菌來源的兩種蛋白與結(jié)核分枝桿菌同源物之間存在完全免疫交叉反應(yīng)。目前該研究缺乏多樣本的數(shù)據(jù)支持,其性能還有待評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 患者招募與病理組織樣本的收集 對(duì)2019年1月至2022年10月期間在山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病與性病防治研究所)診斷為麻風(fēng)的病例進(jìn)行篩選納入,共獲得29份臨床標(biāo)本(包括血液和皮損組織),所有患者均根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、皮膚涂片和組織學(xué)檢查確定診斷,并對(duì)每例患者進(jìn)行嚴(yán)格的Ridley-Jopling(R-J)分級(jí)(LL、BL、BB、BT和TT)(Kundu, 1979)。20份健康獻(xiàn)血者的血液樣本作為本研究的對(duì)照。所有患者均按照WHO指南進(jìn)行聯(lián)合化療方案(MDT)的治療。

1.2 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)抗原刺激后釋放IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞 采用I-SPOT-TB試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。將PBMCs解凍、洗滌并在培養(yǎng)箱(37℃, 5% CO2)中孵育過夜。將96孔微孔板上依次設(shè)置空白對(duì)照組、PHA對(duì)照組和測(cè)定組,培養(yǎng)液中分別加入50 μL AIM-V、50 μL PHA和50 μL抗原試劑,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每孔加入100 μL含3.0×106cells/mL的PBMCs,置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃, 5%CO2)中孵育16～20 h。洗板后,加入標(biāo)記抗體,于2℃～8℃孵育60 min。重復(fù)洗板操作,加入50 μL顯色底物溶液,暗室室溫下反應(yīng)7 min,加入去離子水終止反應(yīng),使用放大鏡進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

1.3 qPCR方法 qPCR引物由NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì),并在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//genome.ucsc.edu/)中進(jìn)行驗(yàn)證。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermo Fisher, USA)上使用Taqman探針方法完成qPCR反應(yīng)。總反應(yīng)體系為20 μL,包括引物探針混合物、去離子水、正反向引物和DNA。qPCR擴(kuò)增條件：50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。完成40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后,對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析：(1)Ct值≥37為陰性;(2)Ct值<37判定為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9軟件(GraphPad Software Inc, CA, SanDiego, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè),P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 倫理聲明 本研究經(jīng)山東省皮膚病性病防治研究所審查和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在采集血液和組織之前獲得了所有患者和健康志愿者的知情同意。

2 結(jié)果

2.1 MB和PB患者IFN-γ激活程度的比較分析 使用結(jié)核分枝桿菌的重組蛋白rESAT6-CFP10作為刺激性抗原,在29例麻風(fēng)患者和20名正常對(duì)照的PBMCs中應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè)釋放IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞頻數(shù)(圖1a)。MB和PB患者IFN-γ的激活程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1b)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況,包括1例麻風(fēng)患者和2例正常對(duì)照存在高IFN-γ分泌情況,1例麻風(fēng)患者細(xì)胞失活,故從本研究中剔除。

N：空白對(duì)照孔;P：植物血凝素孔;T：測(cè)試培養(yǎng)孔IGRA檢測(cè)患者PBMCs中IFN-γ的激活程度

MB和PB患者IGRA陽(yáng)性率的比較分析 根據(jù)試劑盒給定的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),確定各組的陽(yáng)性患者,16例MB患者中6例陽(yáng)性,IGRA的檢出率為 37.5%;11例PB患者中5例陽(yáng)性,檢出率為45.45%。比較兩組IGRA陽(yáng)性率,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 27例麻風(fēng)患者的IGRA檢測(cè)結(jié)果

IGRA聯(lián)合qPCR對(duì)PB患者的診斷價(jià)值 12例MB患者進(jìn)行了qPCR檢測(cè),陽(yáng)性率為100%。8例PB患者進(jìn)行了qPCR檢測(cè),陽(yáng)性率為25%。聯(lián)合IGRA結(jié)果進(jìn)行分析,37.5%(3/8)的PB患者qPCR陰性,IGRA陽(yáng)性;12.5%(1/8)的PB患者IGRA陰性,qPCR陽(yáng)性;IGRA陽(yáng)性或qPCR陽(yáng)性患者達(dá)75%(6/8)。見表2。兩種篩查方法的結(jié)合可能有利于臨床表現(xiàn)不典型的PB患者的診斷。

表2 IGRA與qPCR在27例麻風(fēng)患者中診斷效能的比較分析 例(%)

3 討論

麻風(fēng)是由麻風(fēng)分枝桿菌引起的一種慢性傳染病,主要影響皮膚和周圍神經(jīng)。雖然聯(lián)合化療藥物治療降低了全球麻風(fēng)的患病率,但麻風(fēng)仍然是一個(gè)公共衛(wèi)生問題[7］。該病的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)檢查。然而,由于麻風(fēng)的臨床特征和組織病理學(xué)復(fù)雜,且PB患者以單純神經(jīng)瘤和少數(shù)皮膚病變?yōu)橹?涂片較難檢出麻風(fēng)分枝桿菌,使得該類患者的診斷和鑒別診斷具有挑戰(zhàn)性,尤其在發(fā)病早期[8］。因此,有必要采用更靈敏、可靠、準(zhǔn)確的方法來診斷PB病例。研究證實(shí),麻風(fēng)分枝桿菌抗原刺激誘導(dǎo)的IFN-γ分泌在PB患者中獲得了比MB患者更高的陽(yáng)性反應(yīng)率[9］。多項(xiàng)研究評(píng)估了麻風(fēng)分枝桿菌不同抗原組合的檢測(cè)價(jià)值,如麻風(fēng)分枝桿菌重組蛋白(rML),包括46f+LID-1、ML0276+LID-1、ML2055+ML1632+ML2044、ML0276+46f、ML2055+LID-1等[10］,通過測(cè)定感染患者外周血上清液中IFN-γ水平來探索以重組蛋白為刺激性抗原的免疫應(yīng)答,但這種方法識(shí)別PB患者的潛力有限[11］。

既往研究中,基于結(jié)核分枝桿菌ESAT-6、CFP-10蛋白和麻風(fēng)分枝桿菌同源物之間的同源性關(guān)系,以結(jié)核分枝桿菌rESAT6-CFP10蛋白為刺激性抗原進(jìn)行全血的IGRA試驗(yàn)中,50%(5/10)的PB患者呈陽(yáng)性,40例MB患者均為陰性[12］。在麻風(fēng)患者PBMCs中進(jìn)行的研究同樣證實(shí)了麻風(fēng)桿菌的兩種蛋白與結(jié)核桿菌同源物之間存在免疫交叉反應(yīng)。以CFP-10為刺激抗原,在3例麻風(fēng)患者中特異性T細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)為36(164)、42(76)、54(280)[13］;以ESAT-6為刺激抗原,在4例麻風(fēng)患者中斑點(diǎn)數(shù)為88(164)、68(76)、220(280)、252(184)[5］。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)IGRA的診斷價(jià)值,補(bǔ)充麻風(fēng)的篩查手段,我們開展了該研究。本研究發(fā)現(xiàn)使用結(jié)核分枝桿菌rESAT6-CFP10刺激麻風(fēng)患者的PBMCs后,MB患者的檢出率為37.5%(6/16),PB患者的檢出率為45.45%(5/11),結(jié)果大致符合該蛋白在結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌間的同源性關(guān)系。PB患者的IFN-γ激活程度及陽(yáng)性率略高于MB患者,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MB患者常存在免疫功能低下,細(xì)胞免疫反應(yīng)弱,表現(xiàn)為IFN-γ分泌水平低,皮膚涂片中麻風(fēng)桿菌數(shù)量多,即IGRA敏感性低的原因。在結(jié)核患者中也發(fā)現(xiàn),免疫功能正常的患者相比免疫功能低下者對(duì)IGRA檢測(cè)的敏感性更高。由于實(shí)驗(yàn)操作方法及人為因素的異質(zhì)性,MB患者的IFN-γ水平在各項(xiàng)研究中不全一致,與其他研究相比,本研究中的數(shù)據(jù)(陽(yáng)性率37.5%)偏高,不排除受實(shí)驗(yàn)操作因素及樣本量的影響。

分子檢測(cè),如qPCR,已被證明是診斷PB麻風(fēng)的強(qiáng)大診斷工具,該技術(shù)靈敏度高,對(duì)于鏡檢陰性患者的早期診斷或組織病理學(xué)不確定病變的鑒別診斷非常重要。在皮膚活檢中,80%以上的MB患者和30%～40% PB患者的皮膚組織樣本能檢出麻風(fēng)桿菌DNA。在一系列可能的基因靶點(diǎn)中,麻風(fēng)桿菌特異元件RLEP、16srRNA、folP、gyrA和rpoB被確定為最適合用于診斷[14］,結(jié)合這些基因開發(fā)麻風(fēng)桿菌試驗(yàn)可以加強(qiáng)早期麻風(fēng)病例的診斷。本研究以RLEP為靶基因進(jìn)行皮損組織的qPCR檢測(cè),MB患者中的陽(yáng)性率為100%(12/12),PB患者中為25%(2/8)。MB患者中,皮損組織qPCR的陽(yáng)性率明顯高于血液IGRA的陽(yáng)性率;PB患者的qPCR陽(yáng)性率則低于血液IGRA。將qPCR與IGRA聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),37.5%(3/8)的PB患者qPCR陰性,IGRA陽(yáng)性;12.5%(1/8)的PB患者IGRA陰性,qPCR陽(yáng)性;IGRA陽(yáng)性或qPCR陽(yáng)性的PB患者達(dá)75%(6/8),兩種檢測(cè)手段在一定程度上能夠相互補(bǔ)充,可能是早期發(fā)現(xiàn)PB患者的有效聯(lián)合檢測(cè)手段。

綜合既往研究和本研究的結(jié)果,可認(rèn)為IGRA在PB患者中的敏感性尚可,在MB患者中異質(zhì)性較大。特異性不高,使用該方法不能將麻風(fēng)與結(jié)核分枝桿菌等基因組攜帶RD-1區(qū)的分枝桿菌引起的疾病相鑒別。針對(duì)麻風(fēng)分枝桿菌特異性抗原的IGRA能提高該檢測(cè)的特異性,更好地將麻風(fēng)與其他分枝桿菌疾病鑒別開來。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)IGRA對(duì)麻風(fēng)分枝桿菌感染的診斷價(jià)值值得商榷,但為該感染的診斷提供了思路,陽(yáng)性結(jié)果提示麻風(fēng)桿菌感染的可能性,具體應(yīng)結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、接觸史或其他實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行綜合診斷。IGRA聯(lián)合qPCR可能是早期發(fā)現(xiàn)和篩查麻風(fēng)桿菌的輔助檢測(cè)方法?；讦?干擾素釋放試驗(yàn)的應(yīng)用,IFN-γ在預(yù)測(cè)早期麻風(fēng)、結(jié)節(jié)性紅斑反應(yīng)和監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)中的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。此外,本研究的樣本量較小,可能會(huì)造成一定的誤差,未來需要加大樣本量進(jìn)一步研究。