基于表型性狀構(gòu)建禾初級核心種質(zhì)

毛名義 楊文薈 管艷偉 潘宗東 周麗潔* 余顯權(quán)*

（1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；2 貴州大學(xué)水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，貴陽 550025；3 黔東南州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，貴州 凱里 556000；第一作者：244745381@qq.com；*通信作者：zhoulijie2006@163.com；yxqgy@126.com）

貴州獨(dú)特的地形地貌和生態(tài)環(huán)境孕育了豐富的稻種資源。“禾”是貴州省黔東南山區(qū)侗族等少數(shù)民族生活的獨(dú)特生態(tài)環(huán)境下經(jīng)長期自然演變和人工選擇所形成的一類地方性水稻品種，具有地域性強(qiáng)、耐冷、耐陰、耐貧瘠環(huán)境和耐爛銹田等特點(diǎn)[1]。在禾類資源中具有濃郁芳香氣味、質(zhì)佳味美的香禾糯是黔東南侗族等少數(shù)民族糯食文化的載體，素有“一家蒸飯滿寨飄香”的美譽(yù)。禾在品質(zhì)和抗性等方面的優(yōu)良特性及蘊(yùn)含的大量優(yōu)異基因是當(dāng)前水稻遺傳改良中亟需的基因源，具有重要的利用價值。種質(zhì)資源是品種遺傳改良的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，大量收集和保存種質(zhì)資源是挖掘和利用特異新種質(zhì)的基礎(chǔ)[2]。然而，數(shù)量龐大的資源群體也給種質(zhì)保存與研究利用帶來一定困難，構(gòu)建核心種質(zhì)不僅可以降低資源保存和管理工作的投入和費(fèi)用，也能提高特異種質(zhì)篩選和利用的效率。

1984 年，F(xiàn)RANKEL[3]率先提出“核心種質(zhì)”概念，之后相關(guān)的研究報道逐年增多。核心種質(zhì)是指以最少的資源數(shù)量和遺傳重復(fù)，最大程度代表整個遺傳資源的多樣性，核心種質(zhì)的建立在保證遺傳多樣性的同時又減少資源數(shù)量，避免了因不必要的保存而對資源造成的浪費(fèi)[4]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者基于農(nóng)藝性狀或分子標(biāo)記成功構(gòu)建了水稻[5-8]、玉米[9]、小麥[10]、高粱[11]、甘薯[12]、番茄[13]、馬鈴薯[14]等作物的核心種質(zhì)。禾作為一類特殊的氣候生態(tài)類型水稻，其獨(dú)特的民族文化內(nèi)涵、遺傳多樣性和優(yōu)良品質(zhì)引起了學(xué)者們的關(guān)注[15-17]。劉春暉等[18]在基因組層面揭示禾的遺傳演化規(guī)律和基因組印記，并與社會科學(xué)交叉融合，研究表明，禾起源于福建、廣東、廣西和江西，隨侗族祖先的遷徙傳入黔東南。多樣化的地理起源和黔東南山區(qū)復(fù)雜的自然環(huán)境蘊(yùn)育了豐富的禾資源，而對禾核心種質(zhì)構(gòu)建的研究鮮有報道。本研究以來源于黔東南地區(qū)黎平、從江、榕江三地和廣西三江縣的402 份禾種質(zhì)資源為材料，探究禾核心種質(zhì)構(gòu)建的最佳取樣策略，并對構(gòu)建的禾初級核心種質(zhì)進(jìn)行評價，以期為禾種質(zhì)資源的保存、特異資源挖掘和高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料種植

402 份禾品種資源材料由貴州省黔東南州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，來源地如下：貴州省黔東南州黎平縣228份、從江縣158 份、榕江縣11 份，廣西三江縣5 份。供試材料于2022 年在黔東南州從江縣高增鄉(xiāng)高增村種植，4 月28 日播種，6 月7 日移栽，每份材料種植15 行，每行10 株，行距30 cm，株距10 cm，田間肥水管理及病蟲害防治均按當(dāng)?shù)睾谭N植習(xí)慣進(jìn)行。

1.2 表型統(tǒng)計及賦值

參照韓龍植[19]《水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》對9 個質(zhì)量性狀（穗枝集散度、穗型、倒伏性、谷粒形狀、芒色、種皮顏色、熟期性、穎尖色、穎色）按表1 進(jìn)行統(tǒng)計與賦值；17 個數(shù)量性狀（株高、穗長、每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、結(jié)實率、一次枝梗數(shù)、谷粒長、谷粒寬、谷粒長寬比、千粒重、劍葉長、劍葉寬、倒2 葉長、倒2葉寬、單株穗數(shù)、芒長、產(chǎn)量）按平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（δ）分為10 級，1 級＜X-2δ，10 級≥X+2δ，中間每級相差0.5δ。

表1 禾9 個質(zhì)量性狀分級與賦值

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建策略

1.3.1 表型分組及聚類分析

基于禾穎尖顏色差異，將402 份禾種質(zhì)材料分為5 組（表2），對26 個表型數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后采用歐式距離結(jié)合離差平方和法以組為單位利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行聚類分析。根據(jù)聚類圖結(jié)果，從遺傳距離最小的一組中選擇具有特殊表型性狀的一份材料進(jìn)入下一輪聚類，在剔除其余材料后并對入選材料再次聚類，直至剩余材料達(dá)到需要的取樣量。

1.3.2 取樣策略分析

在分組及逐步聚類基礎(chǔ)上，利用變異系數(shù)變化率、極差符合率、表型保留比例和多樣性指數(shù)4 個參數(shù)檢驗以4 種組內(nèi)取樣比例（簡單比例法、對數(shù)比例法、平方根比例法和多樣性比例法）結(jié)合6 種總體取樣規(guī)模（5%、10%、15%、20%、25%和30%）形成的24 種取樣策略（表3），篩選最佳取樣策略。

表3 候選核心種質(zhì)評價參數(shù)

1.3.3 核心種質(zhì)評價

篩選出最佳取樣策略后，基于原始種質(zhì)與核心種質(zhì)的26 個表型性狀，利用最大值、最小值、均值、變異系數(shù)和多樣性指數(shù)5 個特征值檢驗在最佳策略下構(gòu)建的核心種質(zhì)變異范圍及均勻度。采用均值差異百分率、方差差異百分率、極差符合率、變異系數(shù)變化率和表型保留比例5 個參數(shù)評價核心種質(zhì)的代表性。當(dāng)核心種質(zhì)的均值差異百分率小于20%且極差符合率大于80%說明構(gòu)建的核心種質(zhì)具有代表性，同時變異系數(shù)變化率、方差差異百分率和表型保留比例等參數(shù)值越大越能代表原始群體遺傳多樣性[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體取樣規(guī)模和組內(nèi)取樣比例分析

基于禾穎尖顏色差異，將402 份禾種質(zhì)資源分為5 組（褐色Ⅰ、黃色Ⅱ、稈黃色Ⅲ、黑色Ⅳ、紫色Ⅴ）在6種（5%、10%、15%、20%、25%和30%）總體取樣規(guī)模下，以4 種組內(nèi)取樣比例方法（簡單比例、平方根比例、對數(shù)比例和多樣性比例）分別計算24 種策略下每組取樣數(shù)量（表2）。由表2 可知，禾穎尖顏色中褐色在原始種質(zhì)中數(shù)量最多（190 份），然后依次為黃色（138 份）、稈黃色（30 份）、黑色（23 份）和紫色（21 份）。褐色在簡單比例法中取樣率高達(dá)47.26%，在對數(shù)比例、平方根比例和多樣性比例中取樣率分別為26.56%、34.13%和28.73%。紫色穎尖在簡單比例法取樣率最低為5.22%，但在另外3 種比例法下取樣率均有所提高，其中對數(shù)比例法（15.41%）＞多樣性比例法（12.51%）＞平方根比例法（11.35%）。綜上可知，對數(shù)比例與多樣性比例二者能增加稀有穎尖色的取樣份數(shù)，讓各組的取樣數(shù)量更加均勻，對禾資源中稀有穎尖色（黑色、紫色）有一定的校正效果。

為獲得最佳總體取樣規(guī)模及組內(nèi)取樣比例方法，選取變異系數(shù)變化率、極差符合率、表型保留比例和多樣性指數(shù)4 個參數(shù)進(jìn)行綜合分析比較，結(jié)果（表3）表明，4 種組內(nèi)取樣比例法中，簡單比例法、平方根比例法和多樣性比例法在25%和30%取樣規(guī)模下變異系數(shù)變化率小于100%，而對數(shù)比例法在6 種取樣規(guī)模變異系數(shù)變化率均大于100%。極差符合率隨取樣規(guī)模增加而變大，簡單比例、平方根比例、多樣性比例和對數(shù)比例在5%的取樣規(guī)模下分別為73.26%、71.26%、78.12%和80.10%，僅對數(shù)比例的極差符合率大于80%。在10%的取樣規(guī)模下對數(shù)比例極差符合率大于簡單比例，其余兩種比例法均小于80%。平方根比例與多樣性比例在15%的取樣規(guī)模下才達(dá)到80%。簡單比例法、對數(shù)比例法和多樣性比例法其多樣性指數(shù)在10%的取樣規(guī)模下達(dá)到最大，而平方根比例在15%取樣規(guī)模時才達(dá)到最大，多樣性指數(shù)隨著取樣規(guī)模的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。表型保留比例隨著取樣規(guī)模的增加而增加，當(dāng)取樣規(guī)模＞10%后，其增幅不大，但多樣性指數(shù)卻在逐步降低，說明過度的篩選反而會讓核心樣本各性狀的變異量下降，在剔除原始種質(zhì)中冗余的樣品時應(yīng)適度。綜上所述，表明4 種組內(nèi)取樣比例法中對數(shù)比例法最好，6 種取樣規(guī)模中10%的取樣規(guī)模也最適宜。

2.2 組內(nèi)取樣方法的確定

為進(jìn)一步明確組內(nèi)取樣方法中聚類和隨機(jī)取樣的效果，按對數(shù)比例法下10%和15%的取樣規(guī)模進(jìn)行分析比較。結(jié)果（表4）顯示，在10%和15%的取樣規(guī)模下，以聚類法進(jìn)行組內(nèi)取樣時，其變異系數(shù)變化率、極差符合率、表型保留比例和多樣性指數(shù)4 個檢驗參數(shù)均較隨機(jī)取樣大，說明組內(nèi)取樣方法中聚類法能提升核心種質(zhì)變異的均勻度與豐富度。

表4 組內(nèi)不同取樣方法的比較

2.3 核心種質(zhì)評價

2.3.1 原始種質(zhì)和核心種質(zhì)各性狀特征值比較

為明確所構(gòu)建的核心種質(zhì)與原始種質(zhì)各性狀特征值之間的差異，統(tǒng)計了核心種質(zhì)與原始種質(zhì)2 個樣本26 個農(nóng)藝性狀的最大值、最小值、均值、變異系數(shù)和多樣性指數(shù)。由表5 可知，調(diào)查的9 個質(zhì)量性狀（穗枝集散、穗型、倒伏性、芒色、種皮顏色、粒型、熟期性、穎尖色和穎色）原始種質(zhì)與核心種質(zhì)的最大值與最小值一致。穗長、倒2 葉長、單株穗數(shù)、結(jié)實率、一次枝梗數(shù)、谷粒長、谷粒長寬比、倒伏性、穗型、粒型和穗枝集散等性狀原始種質(zhì)與核心種質(zhì)的均值差異不大，原始種質(zhì)與核心種質(zhì)的變異系數(shù)差異較小，二者的多樣性指數(shù)也相對一致。綜上，原始種質(zhì)與核心種質(zhì)大部分特征值相等或者差異不大，說明構(gòu)建的核心種質(zhì)能較好的代表原始種質(zhì)。

表5 原始種質(zhì)與核心種質(zhì)特征值的比較

2.3.2 核心種質(zhì)評價參數(shù)分析

由表6 可知，本研究構(gòu)建的核心種質(zhì)的均值差異百分率為12.70%，極差符合率為88.31%，符合均值差異百分率小于20%且極差符合率大于80%這一核心種質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)，表明構(gòu)建的核心種質(zhì)具有代表性，其變異系數(shù)變化率為106.41%，表型保留比例為95.77%和方差差異百分率為23.50%。核心種質(zhì)26 個性狀中，20 個性狀極差符合率大于80%，5 個性狀接近80%，只有倒2 葉長較?。?6.48%）未達(dá)到預(yù)期效果。核心種質(zhì)變異系數(shù)變化率中有21 個性狀大于100%。株高、穗長、劍葉長等19 個性狀的表型保留比例均為100%，其余7個性狀均大于90%。綜上所述，構(gòu)建的核心種質(zhì)具有代表性，能較好代表原始種質(zhì)。

表6 核心種質(zhì)與原始種質(zhì)26 個性狀評價參數(shù)和t 檢驗及F 檢驗

2.3.3 26 個性狀均值的t檢驗和F檢驗

對構(gòu)建的初級核心種質(zhì)與原始種質(zhì)各性狀均值進(jìn)行t檢驗，由表6 可知，26 個表型性狀有3 個性狀具有顯著性差異，分別為芒色、穎色和穎尖色，這是由于按穎尖色分組后，對數(shù)比例法取樣的修正作用在一定程度上提高了稀有穎尖色的取樣數(shù)量，使核心種質(zhì)豐富度得以提高。F檢驗結(jié)果表明，倒2 葉寬、穗型、芒色、穎尖色和穎色5 個性狀具有顯著差異，說明核心種質(zhì)中這些性狀保留了更多的遺傳變異且分布較均勻，遺傳冗余度較小。

3 討論與結(jié)論

隨著高產(chǎn)雜交水稻大面積推廣以及人們對禾種質(zhì)資源保護(hù)意識淡薄等原因，導(dǎo)致黔東南地區(qū)禾種植面積減少，禾種質(zhì)資源流失嚴(yán)重。地方水稻品種是我國水稻種質(zhì)資源的重要組成部分，較選育品種具有更豐富的遺傳多樣性。禾作為黔東南山區(qū)一類特殊生態(tài)型地方水稻品種，在抗逆方面表現(xiàn)突出，并具有糯性強(qiáng)、香味濃等特性，是當(dāng)前水稻遺傳改良中選擇特異性基因材料的重要來源。種質(zhì)資源承載著作物的優(yōu)良基因，是育種的前提與物質(zhì)基礎(chǔ)。大量研究表明，在水稻遺傳改良過程中選育出的某些突破性水稻品種或優(yōu)良雙親類型都與種質(zhì)資源密不可分，其也是評判一個國家農(nóng)業(yè)綜合實力的標(biāo)準(zhǔn)之一[22-23]。如何快速準(zhǔn)確的從種質(zhì)資源中挖掘出可以為水稻遺傳改良服務(wù)的優(yōu)異基因是育種工作中急需解決的現(xiàn)實問題，而基于表型性狀構(gòu)建核心種質(zhì)成為種質(zhì)資源開發(fā)及種質(zhì)創(chuàng)新中一種高效且實用的方法。

選擇合適的分組方法對核心種質(zhì)構(gòu)建尤為重要，常見分組方法有單一性狀、來源地、遺傳標(biāo)記與育種體系等。李國強(qiáng)等[24]在構(gòu)建大白菜核心種質(zhì)研究中，以白菜表型性狀中的結(jié)球變種進(jìn)行分組。胡建斌等[25]與徐寧等[26]在構(gòu)建1 200 份甜瓜與4 877 份小豆核心種質(zhì)時均按材料來源地進(jìn)行分組。李自超等[27]在構(gòu)建云南地方稻初級核心種質(zhì)過程中提出了水稻分組體系，發(fā)現(xiàn)丁穎分類體系＞省+秈粳體系＞單一性狀分組＞稻作區(qū)分組＞不分組。本研究在借鑒前人分組方法上基于禾穎尖顏色的不同分為5 組，用穎尖色分組較用其他性狀分組的組間數(shù)量差異小，能提高禾資源中那些稀有穎尖色的取樣數(shù)量，使取樣更加均衡。

不同的組內(nèi)取樣比例方法也對核心種質(zhì)代表性產(chǎn)生影響。李嘉偉等[28]在基于表型構(gòu)建傳統(tǒng)菊花核心種質(zhì)中，比較了4 種組內(nèi)取樣比例法的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)對數(shù)比例法＞多樣性比例法＞平方根比例法＞簡單比例法。李慧峰等[29]基于4 種比例法構(gòu)建甘薯核心種質(zhì)，結(jié)果表明，在對數(shù)比例法下構(gòu)建的核心種質(zhì)其效果最佳，平方根比例法最差。李自超等[30]在研究云南地方稻種資源取樣策略中發(fā)現(xiàn)，組內(nèi)取樣比例中對數(shù)比例法和平方根比例法效果最好，多樣性比例法次之，簡單比例法最差，因為對數(shù)比例法和平方根比例法對那些數(shù)量基數(shù)較小的組別可相對提高其取樣數(shù)量，一定程度上提高了某些小組別的遺傳重復(fù)。

前人在構(gòu)建不同作物核心種質(zhì)時發(fā)現(xiàn)，核心種質(zhì)的數(shù)量大約占原始種質(zhì)的5%～30%，且大多集中于10%左右。BROWN[31]認(rèn)為，以原始種質(zhì)數(shù)量的5%～10%比例下構(gòu)建的核心種質(zhì)就能保留住原始種質(zhì)70%以上的遺傳變異。李自超等[27]認(rèn)為，原始種質(zhì)樣本數(shù)量的多少可用于判定核心種質(zhì)占原始種質(zhì)的比例，一般來說，原始種質(zhì)樣本數(shù)量大的其核心種質(zhì)所占的比例偏小，原始種質(zhì)樣本數(shù)量小的其核心種質(zhì)所占的比例偏大。李秀詩等[32]以248 份薏仁原始種質(zhì)構(gòu)建核心種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)最佳取樣比例為25%。胡建斌等[25]基于1 200 份甜瓜種質(zhì)材料構(gòu)建核心種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，在15%的取樣比例，其各個檢驗指標(biāo)均達(dá)到最佳水平。WANG 等[33]以2 794 份大豆為材料構(gòu)建核心種質(zhì)，其取樣比例僅為2%。同時，李國強(qiáng)等[24]認(rèn)為，考察農(nóng)藝性狀的多少也能決定取樣比例的大小，若考察的農(nóng)藝性狀偏少，各種遺傳變異不能得到充分體現(xiàn)，為避免丟失重要變異類型，在構(gòu)建核心種質(zhì)過程中應(yīng)該適當(dāng)增加表型性狀的調(diào)查數(shù)目，不同作物考察表型性狀數(shù)量也不同，一般來說在10～30個。本研究中所考察的26 個表型性狀是基于前人對粳稻、野生稻或地方稻等核心種質(zhì)構(gòu)建結(jié)果，該數(shù)量表型性狀能較好反映禾表型變異的同時對表型數(shù)據(jù)有效性進(jìn)行保證。本研究較前人基于表型構(gòu)建核心種質(zhì)的原始材料數(shù)量上相對偏少，為保證取樣科學(xué)性與合理性，設(shè)置5%、10%、15%、20%、25%和30%6 種總體取樣規(guī)模，經(jīng)分析對比后，10%取樣規(guī)模下所構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳多樣性指數(shù)最大，4 種組內(nèi)取樣比例法其表型保留比例都大于90%，其中對數(shù)比例法表型保留比例為95.77%，說明能充分代表禾原始種質(zhì)的遺傳多樣性。對比分析在10%和15%的總體取樣規(guī)模下以隨機(jī)和系統(tǒng)聚類兩種取樣方式的效果，均以聚類取樣為宜，與前人的研究結(jié)果相似[27-28]?；诓煌魑锔餍誀钭儺惤Y(jié)構(gòu)分布不均衡情況，采用隨機(jī)取樣可能會丟失某些重要種質(zhì)資源，故在構(gòu)建核心種質(zhì)過程中大多采用系統(tǒng)聚類取樣來降低偏差。

核心種質(zhì)的代表性是檢驗核心種質(zhì)構(gòu)建成敗的重要環(huán)節(jié)，評價其代表性應(yīng)根據(jù)不同作物屬性選擇合適的評價參數(shù)[34]。檢驗核心種質(zhì)代表性僅以單一參數(shù)進(jìn)行評價，其反饋結(jié)果具有局限性，應(yīng)綜合多個參數(shù)對核心種質(zhì)代表性進(jìn)行考量。本研究借鑒均值差異百分率、方差差異百分率、極差符合率、變異系數(shù)變化率和表型保留比例5 個前人高頻使用的評價參數(shù)對構(gòu)建的核心種質(zhì)進(jìn)行評價，結(jié)果表明，構(gòu)建的47 份禾核心種質(zhì)均值差異百分率和極差符合率分別為12.70%和88.31%，說明構(gòu)建的核心種質(zhì)具有代表性。變異系數(shù)變化率、方差差異百分率和表型保留比例作為評價核心種質(zhì)的重要參數(shù)，值越大越能代表原始種質(zhì)的遺傳信息，47 份禾核心種質(zhì)的3 個評價參數(shù)分別為106.41%、23.50%、95.77%，與前人研究結(jié)果中3 個參數(shù)變化范圍一致[35-37]，能較好代表原始種質(zhì)遺傳信息。本研究構(gòu)建的核心種質(zhì)的表型保留比例為95.77%，出現(xiàn)丟失部分原始種質(zhì)表型的情況，因此，保存原始種質(zhì)中扣除核心種質(zhì)外的那部分種質(zhì)資源可作為核心種質(zhì)補(bǔ)充來源，同時也要不斷搜集新的優(yōu)異種質(zhì)為核心種質(zhì)更新?lián)Q代作鋪墊。綜上，本研究構(gòu)建的核心種質(zhì)在表型水平上具有較好代表性，遺傳冗余度較小，種質(zhì)規(guī)模適宜，其作為原始種質(zhì)的“精華”可優(yōu)先加以利用。

本研究以收集402 份禾種質(zhì)資源為材料，依據(jù)禾穎尖色差異將原始種質(zhì)劃分為5 組，通過比較分析不同的取樣策略，結(jié)果顯示，10%為最適總體取樣規(guī)模，組內(nèi)取樣比例法以對數(shù)比例法最優(yōu)，聚類取樣法是組內(nèi)最佳取樣方法。在最優(yōu)方案下構(gòu)建了47 份禾核心種質(zhì)，占原始材料11.69%。5 個評價參數(shù)均值差異百分率、極差符合率、變異系數(shù)變化率、方差差異百分率和表型保留比例分別為12.70%、88.31%、106.41%、23.50%和95.77%。結(jié)果表明，構(gòu)建的核心種質(zhì)具有較好的豐度和均度，能較好代表原始種質(zhì)。