花櫚木生物堿合成關(guān)鍵酶基因OhpLDC和OhpCAO1的克隆與分析

王佳琦 王欣 鄧小梅 吳藹民

王佳琦，王? 欣，鄧小梅，等. 花櫚木生物堿合成關(guān)鍵酶基因OhpLDC和OhpCAO1??? 的克隆與分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（8）：1646-1657.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.08.004

收稿日期：2022-10-27

基金項(xiàng)目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2017KJCX028）

作者簡(jiǎn)介：王佳琦（1998-），女，黑龍江大慶人，碩士研究生，主要從事花櫚木組學(xué)研究。（E-mail）wangjiaqi1990@163.com

通訊作者：吳藹民，（E-mail）wuaimin@scau.edu.cn

摘要：花櫚木是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，其代謝產(chǎn)物常用于治療跌打損傷，具有重要的藥用價(jià)值，然而目前人們對(duì)花櫚木的藥用化學(xué)成分如生物堿合成并不清楚。本研究對(duì)花櫚木不同組織進(jìn)行了代謝組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果表明花櫚木中含有的生物堿大部分屬于喹諾里西啶類生物堿（Quinolizidine Alkaloids，QA）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，QA生物合成的2個(gè)關(guān)鍵酶，賴氨酸脫羧酶（LDC） 和銅胺氧化酶（CAO） 在生物堿合成中起重要作用。結(jié)合花櫚木轉(zhuǎn)錄組結(jié)果對(duì)其編碼基因克隆，得到了1 290 bp、2 268 bp CDS序列，分別命名為OhpLDC和OhpCAO1。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，OhpLDC 和OhpCAO1??? 編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分別為4.63×104和8.44×104，均無(wú)跨膜區(qū)域和信號(hào)肽。OhpLDC編碼的氨基酸序列具有保守的底物結(jié)合位點(diǎn)Phe340，分析發(fā)現(xiàn)OhpLDC與豆科植物中的LDC基因在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系。??? OhpCAO1??? 編碼的氨基酸序列中具有保守結(jié)構(gòu)域“NY-Y”，以及3個(gè)組氨酸保守位點(diǎn)，與狹葉羽扇豆的??? CAO1??? 親緣關(guān)系最近。本研究結(jié)果為解析花櫚木QA的生物合成途徑提供了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花櫚木；喹諾里西啶類生物堿；賴氨酸脫羧酶；銅胺氧化酶；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S792.99????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????? 文章編號(hào)：1000-4440（2023）08-1646-12

Cloning and analysis of key enzyme genes OhpLDC and ????OhpCAO1??? ?for alkaloid synthesis in Ormosia henryi Prain

WANG Jia-qi WANG Xin DENG Xiao-mei WU Ai-min

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou 510000， China）

Abstract：Ormosia henryi Prain is a traditional Chinese medicine， and its metabolites are commonly used to treat injuries and have important medicinal value. However， the medicinal chemical components of Ormosia henryi Prain， such as alkaloid synthesis， are currently unclear. This study conducted metabolomic and transcriptomic analysis on different tissues of Ormosia henryi Prain， and the results showed that most of the alkaloids contained in Ormosia henryi Prain belonged to quinolizidine alkaloids （QA）. Further analysis revealed that the two key enzymes involved in QA biosynthesis， lysine decarboxylase （LDC） and copper amine oxidase （CAO）， played important roles in alkaloid synthesis. Based on the transcriptome results of Ormosia henryi Prain， the coding genes were cloned， and two CDS sequences of 1 290 bp and 2 268 bp were obtained， named OhpLDC and ????OhpCAO1??? ?respectively. The bioinformatics analysis results indicated that the relative molecular weights of the proteins encoded by OhpLDC and ????OhpCAO1??? ?were 4.63×104 and 8.44×104， and there were no transmembrane regions and signal peptides. The amino acid sequence encoded by OhpLDC had a conserved substrate binding site Phe340. Analysis revealed that OhpLDC had a close evolutionary relationship with LDC genes in leguminous plants. The amino acid sequence encoded by ????OhpCAO1??? ?had a conserved domain "NY-Y" and three histidine conserved sites. The amino acid sequence encoded by ????OhpCAO1??? ?had the closest genetic relationship with the ????CAO1??? ?of narrow-leaved lupin. The results of this study provide an important basis for analyzing the biosynthetic pathway of QA in Ormosia henryi Prain.

Key words：Ormosia henryi Prain；quinolizidine alkaloids；lysine decarboxylase；copper amine oxidase；bioinformatics

花櫚木（Ormosia henryi Prain）屬于豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionideae）紅豆屬（Ormosia Jacks.）常綠喬木，屬國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)樹(shù)種[1]。其種子、根、莖、皮和葉中都含有可入藥的化學(xué)成分，具有通經(jīng)活血的功效。《全國(guó)中草藥匯編》記述，花櫚木常以根、皮、莖及葉入藥，其性味歸經(jīng)為辛、溫、有毒，具有活血化瘀、祛風(fēng)、消腫之功[2]。多數(shù)紅豆屬樹(shù)木可入藥，古人常用于治療跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及無(wú)名腫痛等，但具有一定的毒性。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從紅豆屬植物中分離、鑒定出200多種化合物，包括生物堿類、黃酮類、其他類化合物以及揮發(fā)油成分等[3]。其中很多生物堿類化合物具有影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活性，例如Pouny等[4]發(fā)現(xiàn)從紅豆樹(shù)（Ormosia hosiei）分離得到的生物堿對(duì)神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿α4β2受體具有顯著親和力，表明紅豆屬生物堿在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[5-6]。

喹諾里西啶類生物堿（Quinolizidine alkaloids，QA）具有廣泛生物活性，是一類L-賴氨酸衍生的生物堿，具有170多種化學(xué)結(jié)構(gòu)[7]，存在于豆科植物槐族（Sophoreae）和染料木族（Genisteae）中[8]。QA具有抗腫瘤、抗病毒和降糖等多種功能[9-10]，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和化學(xué)中都有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但人們對(duì)QA的生物合成知之甚少[11]。QA的核心生物合成仍然是一個(gè)謎，迄今為止只已知賴氨酸脫羧酶（LDC）和銅胺氧化酶（CAO）參與了部分QA生物合成過(guò)程[12]。QA生物合成途徑的第一步，LDC參與賴氨酸脫羧生成中間產(chǎn)物尸胺（Cadaverine）[13]。而CAO參與了尸胺的脫氨反應(yīng)，產(chǎn)生所有QA合成的共同途徑的中間體哌啶（1-piperideine）[14]。接下來(lái)四環(huán)QA鷹爪豆堿（Sparteine）的生物合成一直是植物生物化學(xué)中未解決的問(wèn)題（圖1）。QA的研究基本集中在豆科植物羽扇豆屬的白羽扇豆（Lupinus albus）中，在豆科植物花櫚木中還未見(jiàn)有關(guān)QA生物合成的報(bào)道。

本研究利用代謝組測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)花櫚木中含有大量QA。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行WGCNA分析，發(fā)現(xiàn)與QA生物合成高度相關(guān)基因LDC和CAO的轉(zhuǎn)錄本。本研究對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行克隆，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析及其在各組織中表達(dá)情況分析。

LDC：賴氨酸脫羧酶；CAO：銅胺氧化酶。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為3年生花櫚木，種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)（中國(guó)廣州）苗圃中。分別采摘花櫚木的根、莖、樹(shù)皮、老葉和新葉，每個(gè)部位收集4份樣品用于重復(fù)試驗(yàn)。在苗圃采摘時(shí)，采下的樣品立即在液氮中冷凍保鮮。帶回實(shí)驗(yàn)室后，將樣品一部分在-80 ℃下保存用于RNA提取，另一部分在真空下冷凍干燥用于代謝物提取。

1.2? 花櫚木代謝組分析

凍干的樣品用研缽和研杵磨成粉末。每個(gè)樣品的粉末用80%的HPLC級(jí)甲醇提取過(guò)夜，其中以1 μmol的白楊素作為內(nèi)標(biāo)，每0.1 g樣品加入1 ml提取液，于4 ℃下12 000 g離心30 min，將上清液裝入樣品瓶中，進(jìn)行超高效液相色譜質(zhì)譜分析[15]。

1.3? 花櫚木轉(zhuǎn)錄組分析

將采自同一時(shí)期的4份花櫚木同一組織樣品等質(zhì)量混合，委托北京百邁客云科技有限公司提取RNA并構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，使用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組雙末端測(cè)序。經(jīng)過(guò)Trinity軟件組裝獲得Unigene，并進(jìn)一步使用HMMER軟件[16]與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)[17]比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息。

1.4? 花櫚木QA代謝途徑關(guān)鍵酶基因篩選

根據(jù)參考文獻(xiàn)中QA的生物合成代謝通路，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果，篩選出花櫚木轉(zhuǎn)錄組中與QA合成相關(guān)的Unigenes，以常用的基因表達(dá)水平估算方法中FPKM（Fragments per kilobase million）值進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，分析相關(guān)基因在花櫚木不同組織中的表達(dá)模式。

1.5? 總RNA提取及cDNA合成

將所有收集的樣品用液氮磨成粉末，然后用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]提取總RNA。使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢查RNA質(zhì)量，并使用NanoPhotometer分光光度計(jì)（美國(guó)IMPLEN公司產(chǎn)品）檢測(cè)RNA的純度和完整性。用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒[TaKaRa Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品]將檢測(cè)合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.6? 基因克隆與測(cè)序

根據(jù)前期花櫚木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的OhpLDC和OhpCAO1??? 基因序列，使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)特異引物（表1），以花櫚木總cDNA為模板，擴(kuò)增OhpLDC和OhpCAO1??? 基因全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性 30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃復(fù)性5 min；12 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用DNA回收純化試劑盒將目的條帶切膠回收，將其連接到TOPO-TA克隆載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，無(wú)誤后送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.7? 生物信息學(xué)分析

將OhpLDC和OhpCAO1??? ?2個(gè)基因測(cè)序獲得的序列結(jié)果，利用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找開(kāi)放閱讀框（ORF），及其編碼的氨基酸序列。利用在線工具Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)基因編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)；利用在線工具DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）和SignalP6.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-6.0）對(duì)OhpLDC和OhpCAO編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用Euk-mPLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。利用在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL網(wǎng)站（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。由CLUSTALW網(wǎng)站（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）軟件和ESPript 3（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，并利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法（Neighbor joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析[18]。

1.8? 表達(dá)模式分析

使用熒光定量PCR儀分析 OhpLDC和OhpCAO基因在花櫚木不同組織中的表達(dá)模式。利用Light Cycler 480設(shè)備進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)程序設(shè)置為95 ℃ 3 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。引物用Primer3Plus（https：//dev.primer3plus.com）設(shè)計(jì)（表2），內(nèi)參基因是??? c71500.graph_c0。每個(gè)樣品分別進(jìn)行3次重復(fù)，采用2-△Ct方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量[19]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 花櫚木的代謝組學(xué)分析

花櫚木是一種豆科木本植物，原產(chǎn)于東南亞和南美洲，具有巨大的藥用價(jià)值。為了更深入研究花櫚木，我們?cè)谌A南農(nóng)業(yè)大學(xué)的田間栽培了一些花櫚木，并收取了3年生植物的5個(gè)組織部位，即根（HR）、莖（HS）、老葉（HOL）、新葉（HNL）和樹(shù)皮（HB）。我們對(duì)其進(jìn)行了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的廣泛的目標(biāo)代謝組學(xué)分析。在所有樣本中有1 535個(gè)顯著代謝物被記錄下來(lái)，并通過(guò)與KEGG、HMDB和脂質(zhì)圖數(shù)據(jù)庫(kù)的映射，對(duì)代謝物進(jìn)行了功能注釋。在花櫚木中共檢測(cè)到6種生物堿（表3），其中白羽扇豆堿（Lupanine）、13-羥基羽扇豆堿（13a-Hydroxylupanin）、鷹爪豆堿（Sparteine）、金雀花堿（Cytisine）和乙酰金雀花堿（Acetylcytisine）屬于QA，所以本研究主要關(guān)注QA的生物合成，詳細(xì)的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖中0軸以上為數(shù)據(jù)庫(kù)中質(zhì)譜圖；0軸以下為花櫚木中檢測(cè)質(zhì)譜圖。

2.2? 花櫚木的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

利用Illumina Hiseq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，在去除低質(zhì)量和短的讀數(shù)后，總共獲得了1.9～2.4 Mb的干凈讀數(shù)，共獲得96 302個(gè)Unigenes。與NR、eggNOG、TrEMBL、Pfam、SwissProt、KEGG、COG、KOG及GO等9個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定CDS有47 809條，并對(duì)其進(jìn)行功能注釋。利用R包DESeq2對(duì)花櫚木5個(gè)部位的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行差異基因分析，共建立了10個(gè)比較組，分別為HR與HS比較組、HR與HB比較組、HR與HNL比較組、HR與HOL比較組、HB與HOL比較組、HNL與HOL比較組、HS與HOL比較組、HS與HNL比較組、HS與HB比較組和HB與HNL比較組。以FDR≤0.01且FC≥2為篩選條件，10個(gè)比較組差異基因數(shù)量分別為5 374、5 631、8 727、9 243、7 631、8 895、9 164、8 333、5 234和6 314（圖3），一共得到13 840個(gè)差異顯著基因（Differential gene expression，DEG）。

HR：根；HS：莖；HB：樹(shù)皮；HOL：老葉；HNL：新葉。

為了研究花櫚木中與生物堿合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，將所有DEG和生物堿進(jìn)行了WGCNA分析，DEG共被分為10個(gè)模塊，發(fā)現(xiàn)其中棕色模塊基因與喹諾里西啶類生物堿基因（QA）相關(guān)性最高，與5種QA的相關(guān)性都高于0.9（圖4A）。通過(guò)KEGG分析，發(fā)現(xiàn)棕色模塊基因主要富集在代謝過(guò)程中，包含一些基礎(chǔ)代謝途徑淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism，編碼ID：ko00500）、碳代謝（Carbon metabolism，編碼ID：ko01200），還富集到賴氨酸降解（Lysine degradation，編碼ID：ko00310）、賴氨酸合成（Lysine biosynthesis，編碼ID：ko00300）和吲哚生物堿的生物合成（Indole alkaloid biosynthesis，編碼ID：ko00901）等代謝通路（圖4B）。分析結(jié)果表明花櫚木中不同次級(jí)代謝物的生物合成可能具有關(guān)聯(lián)性。

一直以來(lái)QA生物合成的前兩步是由LDC和CAO催化（圖1）。在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)1個(gè)LDC和2個(gè)CAO的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其基因分別命名為OhpLDC、OhpCAO1??? 和OhpCAO2。根據(jù)WGCNA分析發(fā)現(xiàn)只有OhpLDC和OhpCAO1??? 這2個(gè)基因在與QA高度相關(guān)的棕色模塊中，所以本研究鑒定了QA生物合成途徑中的2個(gè)酶基因OhpLDC和OhpCAO1。OhpLDC和OhpCAO1??? 在花櫚木中不同組織的表達(dá)情況有明顯差異，都在根中表達(dá)量較高（圖5A、圖5B）。

HR：根；HS：莖；HB：樹(shù)皮；HOL：老葉；HNL：新葉。

2.3? OhpLDC 和 OhpCAO1??? ?基因克隆與序列分析

依據(jù)花櫚木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得OhpLDC和OhpCAO1??? ?cDNA序列，并利用ORF Finder在線軟件對(duì)OhpLDC 和 OhpCAO1??? ?cDNA序列分析，預(yù)測(cè)OhpLDC含1 290 bp完整的開(kāi)放閱讀框?? OhpCAO1??? 含2 268 bp完整的開(kāi)放閱讀框，分別編碼429、755個(gè)氨基酸。通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得目的基因片段（圖6）。將PCR產(chǎn)物回收純化并重組到TOPO載體中，挑選陽(yáng)性菌落PCR檢測(cè)并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。將2個(gè)基因提交到NCBI上利用BLASTP進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示OhpLDC基因序列與豆科植物Echinosophora koreensis中EkDC（GenBank登錄號(hào)：AB561139.1）序列高度相似，相似度為87.2%?? OhpCAO1??? 基因序列與相思子中ApCAO（GenBank登錄號(hào)：XM_027491129.1）序列高度相似，相似度為92%。

M：Marker；1：OhpLDC；2：OhpCAO。

2.4? 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用Protparam在線軟件對(duì)OhpLDC和OhpCAO1??? 基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)OhpLDC蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為4.63×104，分子式為C2 069H3 256N544O618S21，理論等電點(diǎn)（PI）為6.98；OhpCAO1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為8.44×104，分子式為C3 781H5 835N1 053O1 083S34，理論等電點(diǎn)（PI）為6.51。OhpLDC蛋白帶負(fù)電殘基（Asp+Glu）數(shù)為42，帶正電殘基（Arg+Lys）數(shù)為42，不穩(wěn)定系數(shù)為41.06。OhpCAO1蛋白帶負(fù)電殘基（Asp+Glu）數(shù)為91，帶正電殘基（Arg+Lys）數(shù)為85，不穩(wěn)定系數(shù)為43.63。OhpLDC和OhpCAO1均屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

利用DeepTMHMM和SignalP6.0在線軟件對(duì)OhpLDC 和OhpCAO1蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明其氨基酸序列中均無(wú)跨膜區(qū)域和信號(hào)肽序列。利用Euk-mPLoc 2.0在線軟件分析，初步判斷OhpLDC蛋白定位于線粒體，OhpCAO1蛋白定位于細(xì)胞外間質(zhì)中。

2.5? 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用SOPMA和PredictProtein在線工具預(yù)測(cè)OhpLDC和OhpCAO1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示OhpLDC和OhpCAO1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)都由α-螺旋（Alpha helix）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）、延伸鏈（Extended strand） 和無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）組成，均無(wú)二硫鍵。其中OhpLDC的α-螺旋為34.50%、β-轉(zhuǎn)角為6.99%、延伸鏈為18.18%、無(wú)規(guī)則卷曲為40.33%；OhpCAO1的α-螺旋為17.75%、β-轉(zhuǎn)角為7.15%、延伸鏈 23.71%、無(wú)規(guī)則卷曲為51.35%。利用SWISS-MODEL同源建模系統(tǒng)對(duì)OhpLDC和OhpCAO1進(jìn)行同源建模，得到了2個(gè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，如圖7所示。

A：預(yù)測(cè)的OhpLDC蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；B：預(yù)測(cè)的OhpCAO1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.6? 氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用NCBI中Blast分析，結(jié)果表明花櫚木中OhpLDC基因與多個(gè)物種的LDC基因高度相似，相似度較高的基因有苦參（Sophora flavescens，GenBank登錄號(hào)：MW961009.1）、野決明（Thermopsis fabacea，GenBank登錄號(hào)：AB915698.1）、霍州油菜（Thermopsis chinensis，GenBank登錄號(hào)：AB647178.1）、藍(lán)花贗靛（Baptisia australis，GenBank登錄號(hào)：AB647177.1）、落花生（Arachis hypogaea，GenBank登錄號(hào)：XM_025756574.2）等的賴氨酸/鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因，序列一致性分別為86.51%、84.96%、84.84%、84.24%、77.80%。此外??? OhpCAO1??? 基因與大豆（Glycine soja，GenBank登錄號(hào)：XM_028389736.1）??? CAO1??? 基因的相似度最高，達(dá)93.46 %；與相思子（Abrus precatorius，GenBank登錄號(hào)：XM_027491129.1）、赤豆（Vigna angularis，GenBank登錄號(hào)：XM_017581226）、熊貓豆（Vigna umbellate，GenBank登錄號(hào)：XM_047296193.1）、狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius，GenBank登錄號(hào)：XM_019583671）等的??? CAO1??? 基因也具有較高同源性，序列一致性分別為92.09%、92.24%、93.07%、92.90%。該結(jié)果表明OhpLDC和OhpCAO1??? 是花櫚木中賴氨酸脫羧酶和銅胺氧化酶的編碼基因。

將OhpLDC氨基酸序列與blast結(jié)果高度相似的其他植物的賴氨酸脫羧酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明OhpLDC蛋白氨基酸序列中第86到第372位氨基酸與其他植物的賴氨酸脫羧酶具有高度相似性，屬于PLP依賴性超家族酶的N端高度保守的PLP結(jié)合域和QA植物中保守的C端底物結(jié)合位點(diǎn)Phe340（圖8）。OhpCAO1氨基酸序列與blast結(jié)果同源性較高的幾個(gè)物種的CAO氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與豆科植物的CAO1氨基酸序列第62到第763位氨基酸的相似性非常高，與其他物種的CAO氨基酸序列也相似，發(fā)現(xiàn)1個(gè)CAO的保守結(jié)構(gòu)“NY-Y”，以及3個(gè)組氨酸保守位點(diǎn)（圖9）。

為了分析花櫚木中OhpLDC和OhpCAO1??? 與其他物種相關(guān)基因的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA 11.0將OhpLDC與多個(gè)物種的LDC基因一起構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并將??? OhpCAO1??? ?與多個(gè)物種的??? CAO1??? 基因一起構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OhpLDC與豆科類植物中的LDC基因親緣關(guān)系較近，表明編碼這些賴氨酸脫羧酶的基因在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系。并發(fā)現(xiàn)??? OhpCAO1??? 與狹葉羽扇豆的??? CAO1??? 基因親緣關(guān)系最近（圖10）。

3? 討? 論

QA通常出現(xiàn)在豆科中[20]，但也在藜科（Chenopodiaceae）、小檗科（Berberidaceae）、毛茛科 （Ranunculaceae）和茄科（Solanaceae）中被發(fā)現(xiàn)[7]?；澳緦儆诙箍频位▉喛浦参?，對(duì)花櫚木代謝組進(jìn)行分析，結(jié)果表明花櫚木也生成QA，并檢測(cè)到了白羽扇豆堿、13-羥基羽扇豆堿、鷹爪豆堿、金雀花堿和乙酰金雀花堿5個(gè)QA。QA是植物生物堿的一個(gè)重要家族，但核心生物合成途徑一直未被闡明，目前人們只發(fā)現(xiàn)了2個(gè)QA生物合成的關(guān)鍵催化酶，賴氨酸脫羧酶（LDC）和銅胺氧化酶（CAO）[21]，通過(guò)對(duì)花櫚木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了這2個(gè)關(guān)鍵酶的存在，并成功克隆了花櫚木的編碼賴氨酸脫羧酶和銅胺氧化酶基因，分別命名為OhpLDC、OhpCAO1。對(duì)OhpLDC、OhpCAO1??? 編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)OhpLDC屬于PLP依賴性超家族酶，含有高度保守的PLP結(jié)合域和植物中QA保守的底物結(jié)合位點(diǎn)Phe340。Bunsupa等[22]研究結(jié)果表明，不同物種LDC蛋白氨基酸序列中的His340到Phe344是LDC與底物結(jié)合催化的關(guān)鍵位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，OhpLDC與大豆、苦參和狹葉羽扇豆等豆科植物的LDC基因聚為一類，表明花櫚木中OhpLDC基因與這些植物中LDC基因具有共同的起源，也表明LDC具有催化賴氨酸脫羧生成尸胺的酶活性[23]，為后續(xù)QA的合成提供尸胺。

此外本研究發(fā)現(xiàn)?? OhpCAO1??? 在產(chǎn)生QA的植物中進(jìn)化是比較保守的，含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)“NY-Y”，以及3個(gè)組氨酸保守位點(diǎn)，是一種活性酶[24]。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中發(fā)現(xiàn)，花櫚木與狹葉羽扇豆親緣關(guān)系最近，表明花櫚木的銅胺氧化酶與狹葉羽扇豆的銅胺氧化酶有相似的特性[25]。Yang等[21]發(fā)現(xiàn)LaCAO對(duì)尸胺具有較高的親和力，可以將尸胺氧化為1-哌啶，推測(cè)??? OhpCAO1??? 也可能催化花櫚木中QA生物合成的第二步，為后續(xù)QA的合成提供1-哌啶。

本試驗(yàn)克隆了花櫚木中QA代謝中相關(guān)的2個(gè)酶基因OhpLDC、OhpCAO1??? ，它們具有組織特異性，在根中表達(dá)量較高。與之相對(duì)應(yīng)，通過(guò)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)部分QA是在根中含量較高，表明OhpLDC、OhpCAO1??? 可能是花櫚木根中參與QA生物合成的2個(gè)重要基因，QA在根中可能發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。因此，花櫚木的編碼賴氨酸脫羧酶和銅胺氧化酶基因的克隆和分析對(duì)QA生物合成的分子調(diào)控具有重要意義，為進(jìn)一步研究花櫚木QA合成與代謝提供了基礎(chǔ)，對(duì)豆科植物中的木本物種的研究具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）