木本果樹組織培養(yǎng)主要難點(diǎn)及對(duì)策分析

羅一然 李雄軍

（大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南大理 671003）

植物的組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)源于20世紀(jì)，經(jīng)過(guò)100年的發(fā)展，已經(jīng)成為生物技術(shù)的基礎(chǔ)，不僅運(yùn)用于科學(xué)領(lǐng)域，也廣泛運(yùn)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)的生產(chǎn)實(shí)踐。組織培養(yǎng)技術(shù)在草本植物特別是花卉種苗繁殖生產(chǎn)中已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用，但木本植物理化性質(zhì)復(fù)雜，組織培養(yǎng)的難度更大且需要更多的時(shí)間摸索，即便培養(yǎng)成功，在推廣應(yīng)用時(shí)也要考慮生產(chǎn)成本，從而導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用難度大。目前，木本植物組織培養(yǎng)過(guò)程中往往伴隨著滅菌難、褐化、生根難等問(wèn)題，且大多木本植物組培技術(shù)之間還未找到可普遍遵循的規(guī)律[1]。隨著木本果樹需求量的迅速增加，其組織培養(yǎng)和快速繁育技術(shù)研究越來(lái)越受重視?，F(xiàn)代生物技術(shù)還能以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)，結(jié)合細(xì)胞融合及基因工程技術(shù)對(duì)優(yōu)良樹種進(jìn)行轉(zhuǎn)基因[2]。因此，有必要對(duì)木本果樹植物組織培養(yǎng)中存在的難點(diǎn)進(jìn)行概括和分析，為木本果樹植物組織培養(yǎng)研究提供理論參考。

1 外植體消毒

1.1 外植體選擇

木本植物選擇合適的外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)可以有效的控制污染。選擇幼嫩、木質(zhì)化較低的莖段、腋芽或者在種子外皮包裹下的胚、子葉等材料作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，可以提高組織培養(yǎng)脫毒的機(jī)率。馮金玲等[3]以錐栗的胚、腋芽、韌皮部、葉子和莖段作為外植體，研究不同外植體和消毒方法對(duì)組織培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，胚為污染率最低且成活率最高的外植體。汪靈丹等[4]比較了大葉櫸的頂芽、腋芽、莖段、葉片等外植體，得出在每年3月采集的頂芽是理想的外植體，能獲得比較好的消毒效果且萌芽率在95%以上，選擇適宜植物生長(zhǎng)的季節(jié)以及晴朗干燥的日子，可以減少污染。陳澤雄和婁娟[5]在酷熱干燥的盛夏午后以半木質(zhì)化的柑桔帶芽莖段為外植體，顯著降低了污染率，最終將污染率控制在10%之內(nèi)。

1.2 木本植物外植體消毒方式

對(duì)于大多數(shù)草本植物來(lái)說(shuō)，只需進(jìn)行表面消毒即可，通過(guò)試驗(yàn)篩選出一個(gè)合適的消毒時(shí)間就能達(dá)到較好的滅菌效果。而木本植物本身攜帶許多內(nèi)生菌，加之外植體材料木質(zhì)化，在表面消毒的同時(shí)往往還需要進(jìn)行其他處理。常用于植物組織培養(yǎng)的消毒劑有許多（表1），針對(duì)不同植物不同部位的外植體，選擇一種恰當(dāng)?shù)南痉椒?，才能達(dá)到滅菌效果。

表1 不同消毒劑效果比較

木本植物外植體攜帶的內(nèi)生菌往往比表面細(xì)菌更多且更復(fù)雜，僅僅使用一種消毒劑消毒難以達(dá)到滅菌效果。所以木本植物消毒時(shí)，要采用消毒劑組合的方式來(lái)消毒，常見(jiàn)的組合消毒方式為酒精+升汞、酒精+次氯酸鈉。張學(xué)英等[6]在研究白樺組織培養(yǎng)時(shí)，先將外植體沖洗20 min，然后在超凈工作臺(tái)上，用75%酒精浸泡30 s，再用0.15%的升汞浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗5次，達(dá)到了較為理想的消毒效果。陳雪蓮等[7]對(duì)黃連木莖段進(jìn)行消毒時(shí)，采用70%乙醇滅菌5 s，再用0.1%的氯化汞滅菌8～12 min，效果最好，污染率和褐變率都最低。但有些木本植物的外植體，使用組合消毒劑消毒也很難根除細(xì)菌，如酚類分泌量比較大的漆樹、阿月渾子等。針對(duì)這一類植物外植體，消毒前要增加一步結(jié)合消毒劑的沖洗操作，以漆樹為例，用加入潔爾滅的流水沖洗2 h，再進(jìn)行組合式消毒，可以取得較好的殺菌效果。

2 褐化的發(fā)生與抑制措施

2.1 外植體選擇

與草本植物相比，木本植物更容易發(fā)生褐變，因?yàn)樗鼈兡举|(zhì)素和單寧含量較高，這兩種物質(zhì)是酚類糖苷化合物合成的前體，在離體培養(yǎng)過(guò)程中容易發(fā)生褐變。鞠志國(guó)[8]對(duì)果實(shí)成分進(jìn)行提取檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)果實(shí)內(nèi)總酚含量與褐變有直接關(guān)系。陳正華[9]在以多種基因型的香蕉花藥為對(duì)象培養(yǎng)時(shí)觀察到，木質(zhì)化低的歐洲栗外植材料褐變較輕，木質(zhì)化較高的外植體褐變現(xiàn)象較為普遍且較重，其內(nèi)部酚類物質(zhì)隨外植體的木質(zhì)化程度升高而增加。如1月的歐洲栗芽較幼嫩，培養(yǎng)時(shí)酚類物質(zhì)形成少，5-6月份，芽逐漸木質(zhì)化，酚類物質(zhì)增多。由此可見(jiàn)，外植體材料的基因型或者材料的年齡差異，導(dǎo)致褐變水平也有很大差異。

2.2 合理選擇抑制劑

在培養(yǎng)基制作過(guò)程中混合一定量的抗氧化劑和其他抑制劑，可有效減輕外植體在離體培養(yǎng)中的褐化程度。維生素C的還原性還可以使多酚氧化酶失活，阻礙酚類物質(zhì)進(jìn)行氧化反應(yīng)。黃霞等[10]發(fā)現(xiàn)香蕉莖尖培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中加入適量活性炭與維生素C，可有效防止外植體的褐變，這是因?yàn)榫S生素C在酶的催化下會(huì)吸收掉培養(yǎng)基中的部分氧，使酚類有害物質(zhì)因缺氧減弱氧化。另外，水解酪蛋白、PVP、半胱氨酸、硫脲、氰化鉀、部分氨基酸等物質(zhì)都可作為抑制劑來(lái)控制褐變率[11]。

活性炭(AC)是一種高效的天然吸附劑，可以有效吸附植物分泌到培養(yǎng)基中的酚、醌等促褐變物質(zhì)，從而提高外植體成活率[12]。但其吸附能力強(qiáng)，在吸附有害成份的同時(shí)也會(huì)吸附培養(yǎng)基中的外源激素和營(yíng)養(yǎng)成份，使培養(yǎng)基效力降低，影響外植體的正常發(fā)育。因此，活性炭的用量要適度，同時(shí)調(diào)整激素配比，在防止褐變的同時(shí)，確保外植體正常發(fā)育。

2.3 其他抑制褐變方式

對(duì)于易褐變的外植體材料，可以在組培時(shí)持續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶操作，改變外植體與培養(yǎng)基的接觸面，或者更換新的培養(yǎng)基來(lái)消弱酚類物質(zhì)的毒害。所以定期地將外植體轉(zhuǎn)移一次新培養(yǎng)基，是一種有效抑制褐變的手段。

對(duì)外植體材料預(yù)處理也可以有效減輕醌類物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的毒害作用。許多外植體經(jīng)過(guò)低溫處理后再接入培養(yǎng)基，可以有效降低褐化率。也可以使用液體培養(yǎng)基對(duì)外植體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，待組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)液中后，再將外植體取出，接入到固體培養(yǎng)基中，也能有效抑制褐化現(xiàn)象[13]。

通過(guò)總結(jié)前人研究經(jīng)驗(yàn)，可以把組織培養(yǎng)褐變歸結(jié)為是酚類物質(zhì)被氧化的結(jié)果。褐變的引發(fā)是由多種因素協(xié)同作用影響的，從外植體材料內(nèi)部來(lái)看，其生理狀態(tài)、基因型、培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)狀況和年齡均會(huì)影響褐變的產(chǎn)生，培養(yǎng)基成分、外源激素含量及比例、培育環(huán)境條件等也會(huì)影響褐變的產(chǎn)生，所以褐變并不是單純由某個(gè)因素促成，它的發(fā)生需要考慮多個(gè)環(huán)節(jié)，從關(guān)鍵環(huán)節(jié)阻斷褐變?cè)?，才是控制褐變的有效手段?/p>

3 木本植物生根誘導(dǎo)

木本植物再生植株生根較困難[9]，生根問(wèn)題仍然是目前組織培養(yǎng)完整體系建立和高效快繁的瓶頸。為解決木本植物生根困難的問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者均對(duì)不同植物開展了大量的研究工作。

3.1 合理的激素配比

適當(dāng)?shù)耐庠醇に啬軌虼龠M(jìn)生根，主要的作用機(jī)理是能有效刺激細(xì)胞分裂，打破細(xì)胞休眠，加快分裂進(jìn)程。NAA與IBA常被用在植物組織培養(yǎng)的生根環(huán)節(jié)，裴東等[14]以幾種不同基因型的核桃嫩莖為外植體進(jìn)行生根誘導(dǎo)研究，在培養(yǎng)基中加入適量濃度的IBA，顯著提高了組培苗的生根率。董社琴等[15]以紫龍角的不同器官為外植體材料，添加不同濃度的NAA，篩選出了最佳生根培養(yǎng)基1/2MS + NAA 2.5 mg/L。郝愛(ài)麗等[16]在對(duì)青榨槭組培時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入適量NAA、IBA和GA3后均能提高青榨槭的生根效率，并且獲得根系發(fā)達(dá)的完整植株。

3.2 微嫁接

微嫁接是一種建立在組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上的嫁接技術(shù)，在試管內(nèi)將砧木與接穗進(jìn)行嫁接，主要針對(duì)目前生根難的木本植物品種。先以實(shí)生種子培養(yǎng)砧木，通過(guò)微嫁接的方式，嫁接組培苗，最后獲得微嫁接苗，提高成活率。在蘋果上，先利用種子在培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，然后切去主芽，保留根段作為砧木，將較難生根的蘋果品種組培苗嫁接于該根段上，克服了生根難、成活率低的難題[9]。同樣的技術(shù)在柑橘組培研究中也有類似文獻(xiàn)報(bào)道[17]。

3.3 光照強(qiáng)度對(duì)生根的影響

謝耀堅(jiān)[18]發(fā)現(xiàn)桉樹愈傷組織在光照周期為12 h/d條件下，容易誘導(dǎo)出不定根，在無(wú)光照條件下卻不能誘導(dǎo)出根系。而James[19]等人則認(rèn)為，暗培養(yǎng)是部分木本植物不定根發(fā)生的前提，避光培養(yǎng)不僅可以改善根系弱小的問(wèn)題，也能促使植株長(zhǎng)出更多須根、側(cè)根，這大概與暗培養(yǎng)使得植株的內(nèi)部生理狀態(tài)的發(fā)生改變有關(guān)。

3.4 合理的基本培養(yǎng)基選擇

合理的培養(yǎng)基選擇，是促進(jìn)木本植物生根的關(guān)鍵，除了基本營(yíng)養(yǎng)元素的添加外，還應(yīng)該注意培養(yǎng)基的物理性質(zhì)。國(guó)外學(xué)者Chaum[20]將澳洲堅(jiān)果不定芽接入以蛭石代替瓊脂為基質(zhì)的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，這種培養(yǎng)基通氣性良好，成功誘導(dǎo)出了生根苗。

在組織培養(yǎng)生根時(shí)，一般使用1/2甚至1/4無(wú)機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基，姚瑞玲等[21]在對(duì)松樹進(jìn)行不定根誘導(dǎo)時(shí)以1/2量的WPM、改良的MS和DCR等不同基本培養(yǎng)基開展試驗(yàn)，最后篩選出1/2改良的MS培養(yǎng)基作為試驗(yàn)的生根培養(yǎng)基。尹麗莎等[22]發(fā)現(xiàn)北美紅杉組培苗生根誘導(dǎo)時(shí)，不同量的MS培養(yǎng)基生根率從高到低依次為：1/4MS＞1/2MS＞MS，而且1/4MS培養(yǎng)基中北美紅杉根系發(fā)達(dá)且生長(zhǎng)良好。

在土壤中低磷素環(huán)境下，山龍眼科植物的根系為了增加磷素吸收而伸長(zhǎng)發(fā)育。杜建斌[23]在對(duì)山龍眼科植物根發(fā)育生理效應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，在高磷土壤中，山龍眼根很少發(fā)育。筆者在對(duì)山龍眼科植物澳洲堅(jiān)果進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，曾選用更適合木本植物的組織培養(yǎng)的WPM培養(yǎng)基，但其磷素水平與MS培養(yǎng)基一樣（170 mg/L），生根效果不佳，后改用1/2MS培養(yǎng)基，獲得了良好的生根效果，這也驗(yàn)證了前人的結(jié)論。在誘導(dǎo)木本植物組培苗生根時(shí)，要從植物生理因素、培養(yǎng)基理化因素等多個(gè)方面進(jìn)行分析，在綜合條件共同作用下誘導(dǎo)生根是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前木本果樹植物組織培養(yǎng)研究工作的重點(diǎn)是建立起和草本果樹植物一樣高效的再生體系，這樣更有利于全面研究木本植物植株離體再生機(jī)制，深入了解植物的遺傳變異。同時(shí)還要摸索更多木本植物再生的其他方式，多角度分析影響木本植物組織培養(yǎng)的問(wèn)題，靈活尋找解決辦法。筆者相信，合理利用各種科學(xué)技術(shù)，發(fā)揮組織培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)，木本植物組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)工廠化繁育只是時(shí)間問(wèn)題。