超寬范圍的電化學(xué)酶生物傳感器與檢測(cè)技術(shù)?

王興國(guó)，王曉榮?，張拯民，龐 軍，儲(chǔ)震宇

(1.南京工業(yè)大學(xué)電氣工程與控制科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816)

生物電化學(xué)傳感技術(shù)是依靠生物組分與傳感材料間發(fā)生的特異性反應(yīng)形成可被直接感知的電磁信號(hào)，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生化反應(yīng)中特定組分的濃度進(jìn)行快速、精確的傳感檢測(cè)[8－9]。生物傳感技術(shù)起源于1962 年，美國(guó)科學(xué)家Clark 和Lyons 首次提出酶電極的概念[10]。此后，生物傳感科技得到飛速的發(fā)展[11－12]，同時(shí)，一部分研究成果也成功地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化，如血糖儀等[12]。大部分的生物傳感集中于生命醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用，血液或體液中目標(biāo)待測(cè)含量較低且波動(dòng)范圍較窄，然而，發(fā)酵液中產(chǎn)物或底物濃度極高且波動(dòng)范圍可達(dá)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，多數(shù)生物傳感器在檢測(cè)發(fā)酵體系中的待測(cè)物質(zhì)前，需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋，增加了人工操作及檢測(cè)誤差率。部分學(xué)者嘗試建立在線軟測(cè)量模型，在特定的應(yīng)用中取得一定效果[13]?；诖爽F(xiàn)狀，近十年，越來越多的研究人員專注于發(fā)酵用生物傳感器的開發(fā)，極大地推進(jìn)了該領(lǐng)域的發(fā)展。實(shí)現(xiàn)“多組分”及“寬檢測(cè)范圍”的測(cè)量模式是發(fā)酵用生物傳感器的發(fā)展目標(biāo)[14]。

規(guī)整的納米結(jié)構(gòu)已被證明能顯著提升材料的傳感范圍。本研究組基于規(guī)整的納米結(jié)構(gòu)開發(fā)出多種高靈敏度、寬范圍的新型酶生物傳感器[15－21]。在發(fā)酵檢測(cè)中，酶生物傳感器存在傳感器鈍化、重復(fù)性和穩(wěn)定性等問題。較為成熟的解決辦法是傳感器與FIA(流動(dòng)注射系統(tǒng))相結(jié)合[22]。FIA 可以將反應(yīng)生成物及時(shí)帶走，保證傳感器表面的反應(yīng)長(zhǎng)期穩(wěn)定地進(jìn)行，傳感器因此可以多次使用，適用于連續(xù)測(cè)量與監(jiān)控。本研究組以普魯士藍(lán)修飾的石墨電極為核心傳感元件[23]，建立一種FIA 生物傳感器系統(tǒng)，采用三電極絲網(wǎng)印刷結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了該系統(tǒng)的小型化，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合寬范圍檢測(cè)技術(shù)，開發(fā)出離線葡萄糖生物檢測(cè)分析儀[24]。該分析儀檢測(cè)范圍為0.5 g/L～120 g/L，完全滿足發(fā)酵工業(yè)在線檢測(cè)要求，為我國(guó)發(fā)酵行業(yè)實(shí)現(xiàn)底物和濃度的在線檢測(cè)提供了理論指導(dǎo)及先進(jìn)技術(shù)支持。

1 酶生物傳感器及FIA 系統(tǒng)

1.1 葡萄糖酶生物傳感器

發(fā)酵體系中，葡萄糖是發(fā)酵所需的主要碳源，也是絕大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)品的起始物質(zhì)或原料，葡萄糖濃度的變化包含了產(chǎn)品品質(zhì)、過程控制所需的重要信息。自制備的葡萄糖電化學(xué)酶生物傳感器為三電極體系，三個(gè)電極分別為工作電極(Working Electrode，WE)、參比電極(Reference Electrode，RE)、對(duì)電極(Counter Electrode，CE)這三個(gè)電極構(gòu)成了葡萄糖傳感器，如圖1 所示。對(duì)電極與工作電極組成串聯(lián)回路，使電極上電流暢通，選用的材料是本身電阻小且不容易極化的碳漿料。參比電極材料選用容易處理、電位重現(xiàn)性好的AgCl。工作電極為反應(yīng)區(qū)，該電極上固定有電催化劑普魯士藍(lán)(Prussian Blue，PB)膜和葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOD)，如圖1 所示。

圖1 葡萄糖電化學(xué)酶生物傳感器

檢測(cè)時(shí)，在GOD 的作用下，緩沖液中的葡萄糖(C6H12O6)能夠與O2反應(yīng)生成葡萄糖酸(C6H12O7)和H2O2。H2O2是常見的氧化還原劑。反應(yīng)式(1)表示了酶促反應(yīng)的過程:

酶促反應(yīng)過程，需要O2參與，因此，檢測(cè)池中溶液為特制的含氧緩沖溶液，用于解決反應(yīng)時(shí)的“氧虧”問題。

酶促反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生中間副產(chǎn)物H2O2，而PB 對(duì)H2O2具有高電催化活性，有“H2O2酶”之稱。PB(氧化態(tài))在電極處發(fā)生得電子反應(yīng)產(chǎn)生PB(還原態(tài))，進(jìn)而PB(還原態(tài))與酶促反應(yīng)副產(chǎn)物H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生還原電流，還原電流與待測(cè)物葡萄糖存在當(dāng)量關(guān)系，可以計(jì)算出葡萄糖的濃度。其機(jī)理如反應(yīng)式(2)、式(3)所示:

3.6 綜合人才缺乏 目前國(guó)內(nèi)培養(yǎng)的假肢矯形器專業(yè)人才大部分偏重于假肢矯形器臨床裝配能力，計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)操作能力缺乏，而專門的計(jì)算機(jī)人才對(duì)假肢矯形器行業(yè)又知之甚少，因此很多假肢矯形器企業(yè)需要招聘計(jì)算機(jī)人才與原有的假肢矯形器裝配技術(shù)人員進(jìn)行配合，雙方磨合時(shí)間長(zhǎng)，效率低，因此，針對(duì)3D打印技術(shù)，培養(yǎng)假肢矯形器方面綜合的康復(fù)工程人才，是亟待解決的問題。

PB 膜由于優(yōu)異的導(dǎo)電性能，將工作電極上獲取的電子直接傳送到酶的活性中心，加快了檢測(cè)速率。PB 膜在陰極電位處和酸性體系中很穩(wěn)定，可以防止電極表面的損耗，降低了檢測(cè)電位，減少了共存物質(zhì)的氧化，排除了因氧化所帶來的干擾。

傳感器是從催化反應(yīng)有關(guān)物質(zhì)的電極反應(yīng)所得到的電流來確定反應(yīng)物質(zhì)濃度。在電化學(xué)中，Cottrell 方程描述了在受控電位實(shí)驗(yàn)中電流相對(duì)于時(shí)間的變化，如式(4)所示:

式中:t為時(shí)間，i為t時(shí)刻的瞬時(shí)電流，n為電子數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，A為電極的面積，c0j為分析物j的初始濃度，Dj為j的擴(kuò)散系數(shù)。

在反應(yīng)池持續(xù)攪拌的條件下，溶液中物質(zhì)的傳質(zhì)過程由擴(kuò)散傳質(zhì)轉(zhuǎn)為對(duì)流傳質(zhì)，活性物質(zhì)可以迅速從溶液本體傳送至電極表面，在電極/膜界面，其電流方程為:

式中:ks是異相速率常數(shù)，Cp是電催化劑濃度，該值可以用表面濃度Γ和膜厚Φ來表示:

由式(5)和式(6)得:

表面濃度Γ與待測(cè)物濃度成正比，與酶的活性正相關(guān)。因此，待測(cè)物濃度與電極上的電流在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。電極面積增大、減小PB 膜的厚度可增強(qiáng)響應(yīng)電流。

1.2 PB 膜

在實(shí)際檢測(cè)裝置中，因多種因素影響，電極面積受到限制。在電極面積一定的情況下，通過增大PB膜的比表面積可達(dá)到與增大電極面積同樣效果。

自組裝法是一種制備PB 修飾電極的常用方法，該方法易控制PB 的形貌和厚度而被廣泛推廣。項(xiàng)目組通過自組裝技術(shù)控制合成液K4[Fe(CN)6]和FeCL3的濃度和合成速度成功合成出規(guī)則的普魯士藍(lán)納米立方體(PBNCs)。規(guī)則形貌的PB 納米立方體傳感材料膜可顯著提高材料的比表面積，擴(kuò)大材料的催化位點(diǎn)，提升傳感器的檢測(cè)范圍和檢測(cè)靈敏度。PB 納米立方體顆粒電鏡圖如圖2 所示。

圖2 PB 納米立方顆粒電鏡圖

1.3 檢測(cè)電路

從原理來分類，電化學(xué)傳感器主要有3 種檢測(cè)方法:電流法、電位法和阻抗法。電流法是在電極上加上恒定電壓作為溶液中電活性成分進(jìn)行電子傳遞反應(yīng)的外加動(dòng)力，通過檢測(cè)電流大小來分析相應(yīng)被測(cè)物的濃度大小及變化。電位法是在零電流的條件下，利用電極電位和濃度間的關(guān)系將被測(cè)離子的活度轉(zhuǎn)換為電極電位進(jìn)行測(cè)定的一種電化學(xué)分析法。電位法在某種程度上可以看成電流法當(dāng)其工作電流趨向無窮小的一種極限情況。阻抗法是在兩個(gè)惰性電極上加上一定的交流電壓并測(cè)定電極上電流變化從而測(cè)得與溶液成分變化相關(guān)的阻抗變化。本研究組采用的是電流法，該方法操作簡(jiǎn)單，且配合酶?jìng)鞲衅鲗?duì)溶液中成分的響應(yīng)具有選擇性，線性度好，易于實(shí)現(xiàn)寬范圍檢測(cè)。

葡萄糖酶?jìng)鞲衅髦?，工作電極與參比電極之間的電勢(shì)，影響PB 能否實(shí)現(xiàn)可逆的氧化還原反應(yīng)。電勢(shì)過低，電子運(yùn)動(dòng)不明顯，影響PB(還原態(tài))產(chǎn)生速率；電勢(shì)過高，PB(氧化態(tài))無法生成PB(還原態(tài))。隨著反應(yīng)不斷進(jìn)行，工作電極中的電子不斷遷出，造成工作電極帶正電，改變了電極電勢(shì)，從而阻礙電極中的電子遷出，反應(yīng)進(jìn)程受阻，導(dǎo)致檢測(cè)失敗。因此，為保證反應(yīng)進(jìn)行，需借助恒電位電路，使參比電極與對(duì)電極電勢(shì)保持一致，工作電極對(duì)于參比電極呈負(fù)電性。圖3 為本研究組實(shí)現(xiàn)的葡萄糖酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)電路。

圖3 酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)電路

圖3 中，參比電極是非極化電極，具有恒定電位，不受溶液成分變化的影響，起著穩(wěn)定工作電極電勢(shì)的作用。參比電極和對(duì)電極之間使用運(yùn)放實(shí)現(xiàn)深度負(fù)反饋的恒電位電路，使對(duì)電極和參比電極的電勢(shì)始終保持一致。A 運(yùn)放和B 運(yùn)放需選用失調(diào)電壓和偏置電流較小的運(yùn)放。R14、R15、C14、C15組成低通濾波電路。參比電極需緊靠工作電極，以減小溶液電阻。工作電極與參考電極之間保持－50 mV 的恒定電勢(shì)，可使電極具有最好的氧化活性。B 運(yùn)放為跨阻放大器，工作電極通過跨阻放大器將nA 級(jí)電流轉(zhuǎn)換為可以測(cè)量的電壓信號(hào)。繪制PCB 板時(shí)，B運(yùn)放的負(fù)輸入端和負(fù)反饋部分需進(jìn)行開窗處理，以減少干擾。R9為傳感器輸出匹配電阻。R13為反饋電阻，需選用低溫漂精密電阻。C18為C0G 材質(zhì)的濾波電容，用于低通濾波。圖3 中C 放大器實(shí)現(xiàn)了有源2 階巴特沃斯低通濾波器。檢測(cè)時(shí)，工作電極不斷向特制的緩沖液提供電子，在R13上形成電流。通過檢測(cè)R13兩端的電壓，即可得到工作電極產(chǎn)生的反應(yīng)電流I的大小。

1.4 檢測(cè)方法和FIA 系統(tǒng)

酶?jìng)鞲衅鞯碾娏鳈z測(cè)法可以通過檢測(cè)電極上流過的電流大小來分析被測(cè)物的濃度。然而，在真實(shí)發(fā)酵體系中，會(huì)遇到很多問題:酶?jìng)鞲衅骶弥煤螅状问褂眯枰跀嚢璧木彌_液中進(jìn)行激活處理；酶的活性是一個(gè)不斷衰減的過程，該過程可導(dǎo)致零點(diǎn)漂移；發(fā)酵液中各種大分子物質(zhì)在電極表面吸附，如不能及時(shí)清除，沉積的反應(yīng)物會(huì)阻礙待測(cè)液體與傳感器的正常接觸，引起傳感器鈍化；緩沖液溫度變化導(dǎo)致零點(diǎn)漂移；超寬范圍檢測(cè)的線性度問題等。

為了解決以上問題，以葡萄糖為例，采用“酶?jìng)鞲衅鳎獸IA 系統(tǒng)”實(shí)現(xiàn)超寬范圍檢測(cè)，其結(jié)構(gòu)如圖4 所示。

圖4 酶?jìng)鞲衅鳎獸IA 系統(tǒng)

圖4 中，F(xiàn)IA 是下述幾點(diǎn)的組合:①檢測(cè)池溶液體積的精確控制；②待測(cè)樣和標(biāo)樣注入量的精確控制；③穩(wěn)定的攪拌系統(tǒng)；④校準(zhǔn)和檢測(cè)流程控制。

由式(7)可知，穩(wěn)態(tài)電流I與檢測(cè)池中葡萄糖濃度成正比，即與待測(cè)樣品注射量成正比，與檢測(cè)池中緩沖液體積成反比。因此，檢測(cè)池溶液體積和待測(cè)樣的注入量的準(zhǔn)確性直接影響測(cè)量精度?？刹捎貌竭M(jìn)電機(jī)精確控制緩沖液體積減小誤差，量程為100 μL，0.1%精度的注射泵精確控制注射量。

式(7)中表面濃度Γ與酶的活性呈正相關(guān)。酶活性是否穩(wěn)定將直接影響測(cè)量結(jié)果。而酶的活性長(zhǎng)時(shí)間是不斷衰減的過程，且受溫度、激活時(shí)長(zhǎng)等因素影響。因此，在真實(shí)發(fā)酵體系中，對(duì)葡萄糖酶?jìng)鞲衅鞯拈L(zhǎng)期穩(wěn)定性有著較高的要求。圖5 所示為將傳感器置于4 ℃的環(huán)境中冷藏，每隔5 d 進(jìn)行葡萄糖靈敏度測(cè)試實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖5 長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)試

為減小酶活、溫度等因素對(duì)測(cè)量精度的影響，可通過FIA 系統(tǒng)對(duì)校準(zhǔn)和檢測(cè)流程進(jìn)行控制。FIA 系統(tǒng)，一方面將反應(yīng)生成物及時(shí)帶走，避免傳感器鈍化，保證傳感器表面的反應(yīng)長(zhǎng)期穩(wěn)定進(jìn)行；另一方面通過定時(shí)校準(zhǔn)和注入量控制，將待測(cè)樣濃度轉(zhuǎn)換到校準(zhǔn)點(diǎn)附近，降低酶活變化的影響，提高測(cè)量精度以及系統(tǒng)的重復(fù)性、穩(wěn)定性和測(cè)量范圍。FIA 系統(tǒng)的校準(zhǔn)和檢測(cè)流程控制如圖6 所示。

圖6 校準(zhǔn)和檢測(cè)流程

發(fā)酵過程葡萄糖底物的濃度范圍較寬(2 g/L～100 g/L)。自制的葡萄糖酶?jìng)鞲衅髟诟邼舛热杂休^好的活性，但線性度較差。該問題，可通過變更注射體積，將檢測(cè)池緩沖液中的濃度調(diào)整到標(biāo)樣濃度附近加以解決。但待測(cè)樣注射體積小于2 μL 時(shí)，注射體積誤差難以滿足檢測(cè)精度要求，因此，注射體積最低為2 μL。

2 酶生物檢測(cè)儀與實(shí)驗(yàn)測(cè)試

2.1 酶生物檢測(cè)儀

在三電極的葡萄糖酶?jìng)鞲衅鞣治鲶w系基礎(chǔ)上，項(xiàng)目組成功研發(fā)超寬范圍檢測(cè)的離線生物分析儀，如圖7 所示。該分析儀可對(duì)真實(shí)發(fā)酵體系中的待測(cè)樣免稀釋直接進(jìn)行測(cè)量，簡(jiǎn)化了測(cè)量過程，為進(jìn)一步完成在線檢測(cè)儀開發(fā)打下很好基礎(chǔ)。

圖7 葡萄糖生物分析儀

2.3 實(shí)驗(yàn)測(cè)試

2.3.1 檢測(cè)精度測(cè)試

實(shí)驗(yàn)在自主研發(fā)的離線生物分析儀上進(jìn)行，對(duì)葡萄糖酶?jìng)鞲衅鬟M(jìn)行檢測(cè)精度測(cè)試。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，配制了0.1 g/L～400 g/L 不同濃度的葡萄糖樣品。實(shí)驗(yàn)中，所有測(cè)試均使用同一枚電極芯片。使用采樣針向檢測(cè)池中分別注入2 μL、5 μL、20 μL、50 μL 和100 μL 不同濃度的葡萄糖溶液，檢測(cè)綜合誤差如表1 所示。

表1 檢測(cè)誤差

通過實(shí)驗(yàn)室單次檢測(cè)結(jié)果可知:生物分析儀在0.5 g/L～320 g/L 的葡萄糖濃度范圍內(nèi)均可滿足±2%的檢測(cè)誤差要求。多次實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵企業(yè)返回的測(cè)試數(shù)據(jù)表明:該分析儀檢測(cè)范圍為:0.5 g/L～120 g/L。完全滿足發(fā)酵企業(yè)2 g/L～100 g/L 的寬范圍檢測(cè)需求。此外，分析儀每次測(cè)量時(shí)間約50 s，符合在線檢測(cè)要求。

2.3.2 抗干擾測(cè)試

真實(shí)發(fā)酵過程中，葡萄糖檢測(cè)最常見的干擾物質(zhì)為抗壞血酸(Ascorbic Acid，AA)和尿酸(Uric Acid，UA)以及同類型的還原性糖類。因?yàn)锳A，UA氧化電位比較低，其干擾的可能性更大。如圖8 所示，當(dāng)?shù)稳?.1 mmol/L 葡萄糖溶液后會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電流階躍信號(hào)，再滴入相同濃度的抗壞血酸時(shí)，電流沒有任何變化，重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作步驟，對(duì)尿酸也無任何電流響應(yīng)。測(cè)試表明，由于酶的專一性，酶?jìng)鞲衅骶哂泻芨叩目垢蓴_性能。

圖8 抗干擾測(cè)試

3 結(jié)論

針對(duì)發(fā)酵底物葡萄糖的檢測(cè)提出一種寬線性范圍酶?jìng)鞲衅?。該傳感器在滿足檢測(cè)精度、穩(wěn)定性、抗干擾等各項(xiàng)性能指標(biāo)要求的前提下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)0.5 g/L～120 g/L 范圍內(nèi)葡萄糖濃度的快速檢測(cè)，完全滿足真實(shí)工業(yè)發(fā)酵體系中對(duì)葡萄糖濃度的在線檢測(cè)要求，為我國(guó)發(fā)酵底物和產(chǎn)物的在線檢測(cè)提供了先進(jìn)技術(shù)支持。由于PB 材料能夠?qū)Σ煌拿阜磻?yīng)具有響應(yīng)，可通過在PB 上固定不同的氧化酶，實(shí)現(xiàn)多組分檢測(cè)。這項(xiàng)工作正在進(jìn)行中，目前部分組分存在信號(hào)強(qiáng)度、檢測(cè)線性范圍差異較大等問題。