Wnt/β-catenin 信號通路在心肌纖維化中的作用研究進(jìn)展

高雅婷 邱對鑫 高 磊 石開虎

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（江蘇南京 210028）

2 南京中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（江蘇南京 210023）

1 Wnt/β-catenin 信號通路

1.1 概述

Wnt基因最初來源于小鼠乳腺癌中的整合酶-1和果蠅的無翅基因，由于這兩個基因和功能蛋白相似，研究者將其合并為Wnt基因［1］。Wnt信號通路包括非經(jīng)典通路和經(jīng)典通路，Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號通路中的經(jīng)典通路，Wnt/β-catenin信號通路是一種進(jìn)化上高度保守的信號通路，對胚胎發(fā)育、器官和神經(jīng)發(fā)育、損傷修復(fù)及組織穩(wěn)態(tài)等至關(guān)重要［2-3］。Wnt分泌的糖蛋白充當(dāng)配體并調(diào)節(jié)下游效應(yīng)β-catenin蛋白［4］。Wnt/β-catenin信號通路包括四個部分：細(xì)胞外信號、細(xì)胞膜段、細(xì)胞質(zhì)段和細(xì)胞核段。細(xì)胞外信號主要由Wnt蛋白介導(dǎo)，包括Wnt3a、Wnt1、Wnt5a等。細(xì)胞膜片段主要含有Wnt受體Frizzled（特異性卷曲跨膜受體Frizzled蛋白）和共同受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5 and 6，LRP 5/6）。細(xì)胞質(zhì)段主要包括β-catenin、細(xì)胞質(zhì)折疊蛋白（dishevelled，DVL）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）、軸蛋白（axis inhibition protein 2，Axin）、腺瘤性結(jié)腸息肉蛋白（adenomatous polyposis coli protein，APC）和酪蛋白激酶I（casein kinase 1，CK1）。細(xì)胞核段主要包括移位到細(xì)胞核的β-catenin、T細(xì)胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴細(xì)胞增強因子（lymphoid enhancing factor，LEF）家族成員和β-catenin蛋白下游靶基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和細(xì)胞-骨髓細(xì)胞瘤病病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）等［3］。一般情況下β-catenin蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子的TCF/LEF相互作用來激活靶基因從而控制細(xì)胞增殖［5］。Wnt信號通路在人體組織中通常為沉默，但在損傷后重新激活。Wnt信號通路沉默時，分泌的卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled-related protein，SFRP）與Wnt結(jié)合，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin 被 Axin、CK1、APC、GSK-3β組成的復(fù)合物不斷降解。當(dāng)組織受到損傷時，Wnt信號通路被激活，Wnt與卷曲跨膜受體Frizzled及其共同受體 LRP5/6 結(jié)合，使這種復(fù)合物的下游蛋白DVL被磷酸化，抑制GSK-3β和CK1的活性，并固定Axin，破壞復(fù)合物的形成，從而抑制β-catenin降解，β-catenin就可以穩(wěn)定化聚集并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與TCF/LEF相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。見圖1。

圖1 Wnt/β-catenin 通路示意圖

1.2 Wnt/β-catenin與多種纖維化疾病相關(guān)

近年來的研究表明，Wnt/β-catenin的信息通路在各類纖維化病變，如肺纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、腎纖維化以及心肌纖維化的發(fā)病過程與病程進(jìn)展中起著主要作用［6-7］。如肺纖維化，有研究者通過讓小鼠吸入聚苯乙烯微塑料激活氧化應(yīng)激和Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)小鼠肺纖維化［8］。Lei等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin激動劑SKL2001降低脂肪酸結(jié)合蛋白5（fatty acid binding protein 5，F(xiàn)ABP5）敲低在轉(zhuǎn)移生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激下對肺外源成纖維細(xì)胞的抗纖維化作用。在急性腎損傷中，短暫被激活的Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)修復(fù)和再生，而持續(xù)（不受控制）激活的Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)與慢性腎臟病相關(guān)的腎臟纖維化、足細(xì)胞損傷和礦物質(zhì)骨病［10］。此外，Wnt/β-catenin信號通路在皮膚纖維化中也有重要作用，Jussila等［11］證明了跨膜二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）是一種Wnt/β-catenin響應(yīng)基因和纖維化轉(zhuǎn)化的功能介質(zhì)，此研究將Wnt/DPP4軸確定為細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)和真皮脂肪減少的關(guān)鍵驅(qū)動因素，為減輕組織纖維化的發(fā)生和逆轉(zhuǎn)提供了作用途徑。其中尤為重要的是其對心肌纖維化的作用。

2 心肌纖維化在心血管疾病中的作用

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是影響全球死亡率的首要因素。在中國，CVD一直是導(dǎo)致中國城鄉(xiāng)居民死亡的最主要因素，但近年來由于老齡化問題加重，CVD相關(guān)死亡率也持續(xù)升高，已嚴(yán)重威脅民眾的生命安全。據(jù)研究顯示，2019年農(nóng)村和城市CVD死亡人數(shù)分別占總死亡人數(shù)的46.74%和44.26%，每5例死亡者中就有2例死于CVD［12］。在CVD中，明確其病理機制，研究疾病靶點并開發(fā)新型治療藥物尤為重要。大多數(shù)CVD與心肌纖維化相關(guān)，它幾乎代表了所有類型心臟損傷的最終病理表現(xiàn)［13］。心肌纖維化的特征在于細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積和心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）的積聚。CFs是成人心臟中的主要細(xì)胞類型，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要生產(chǎn)者，并且顯著促進(jìn)心肌纖維化［14］。在心臟受到損傷后，CFs 被激活并隨后分化為肌成纖維細(xì)胞，后者是病理性重構(gòu)的主要作用細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞具有增殖和分泌特性，有助于細(xì)胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)和膠原沉積［15］。

3 Wnt/β-catenin 在心肌纖維化相關(guān)CVD 中的作用

大量研究結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號通路與心肌梗死、心房顫動、心力衰竭等多種CVD相關(guān)，異常的Wnt/β-catenin信號通路激活會導(dǎo)致心功能不全的發(fā)生和進(jìn)展，在各種CVD中Wnt/β-catenin信號通路與心肌纖維化的關(guān)系最為密切。

3.1 心肌梗死

急性心肌梗死通常由血栓阻塞動脈或旁路移植物引起，其特征是流向心肌的血流突然減少，最終導(dǎo)致心力衰竭和死亡［16］。Wnt/β-catenin信號通路參與心肌梗死后細(xì)胞凋亡、心肌纖維化和毛細(xì)血管增生的病理過程，影響心肌梗死患者的預(yù)后［17］。Liu等［18］通過體內(nèi)實驗證明了沙庫巴曲/纈沙坦通過抑制Wnt/β-catenin通路減輕CFs中的膠原沉積從而減輕心肌梗死后小鼠的心肌纖維化并改善心功能。Zhang等［19］發(fā)現(xiàn)，富含脯氨酸/精氨酸的末端富含亮氨酸的重復(fù)蛋白（proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein，PRELP）的過度表達(dá)增加了梗死的大小和間質(zhì)纖維化面積，位于PRELP下游的Wnt/β-catenin通路分子的表達(dá)在PRELP過表達(dá)組中比在心肌梗死組中增加更多。最近的一項研究也同樣發(fā)現(xiàn)，心肌梗死與Wnt/β-catenin通路密切相關(guān)，并證實XAV93（一種 Wnt/β-catenin信號通路阻滯劑）可以通過促進(jìn)β-catenin的降解，成功阻斷心肌梗死后心肌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin通路激活［20］。近期一項研究將急性心肌梗死 PCI患者分為兩組，研究組術(shù)中使用替羅非班，對照組不使用替羅非班，通過對比觀察到治療后兩組Wnt/β-catenin表達(dá)水平較治療前均明顯降低，研究組Wnt/β-catenin表達(dá)水平顯著低于對照組，這表明了替羅非班對急性心肌梗死的治療作用可能是通過對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用［21］。Hind等［22］采用GSK-3β全身性基因敲除小鼠模型，在心肌梗死后GSK-3β全身性基因敲除的小鼠心臟中纖維化反應(yīng)增多，GSK-3β通過直接調(diào)節(jié)經(jīng)典TGF-β1-SMAD-3信號通路發(fā)揮在梗死心臟中心肌纖維化重塑的核心作用。這些數(shù)據(jù)表明，GSK-3β是受損心臟中心肌纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，維持GSK-3β處于活性狀態(tài)，尤其是在心肌梗死后的重塑階段，是抑制纖維化的一種治療選擇，從而限制不良的心肌重塑。目前在臨床上，已經(jīng)提出了靶向GSK-3β家族的藥理學(xué)抑制劑，可用于特定的疾病，但需警惕此類抑制劑引起的不良纖維化重塑，特別是在心肌梗死后長期使用的情況下。

3.2 心房顫動

心房顫動是臨床疾病中常見的心律失常之一。心房纖維化是心房顫動發(fā)展和維持的重要病理生理機制。Lv等［23］通過構(gòu)建大鼠心房顫動模型，miR-27b-3p過表達(dá)組心房顫動的發(fā)生率明顯降低，持續(xù)時間縮短，心房纖維化的程度也隨之減輕，心房縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達(dá)增加，降低通路相關(guān)蛋白Wnt3a以及磷酸化的β-catenin的表達(dá)，同時也降低了纖維狀膠原蛋白I（collagen I，COL-I）、纖維狀膠原蛋白III（collagen III，COL-III）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而證實在心房顫動心肌纖維化過程中，miR-27b-3p可以通過靶向Wnt3a調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路來減輕心肌纖維化。Zhu 等［24］通過體外熒光素酶測定證實，Axin1是miR-124-3p的靶點，在miR-124-3p過表達(dá)的CFs中，Axin1的表達(dá)減少，而β-catenin、COL-I和α-SMA的表達(dá)增加，這些結(jié)果表明，miR-124-3p通過Axin1調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化和增殖，從而減輕心房顫動心肌纖維化。Yang等［25］證實了三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，TMAO還通過激活β-catenin途徑促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化、遷移和膠原分泌，外源性Wnt3a和TMAO協(xié)同促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞中β-catenin途徑的活化和表型轉(zhuǎn)化。

3.3 心力衰竭和心臟肥大

心力衰竭綜合征是由于心臟結(jié)構(gòu)、功能、節(jié)律或傳導(dǎo)異常引起的，其中病理性的心臟肥大與心肌細(xì)胞死亡增加和纖維化重塑有關(guān)，其特征是收縮和舒張功能降低，常進(jìn)展為心力衰竭。Yang等［26］采用橫主動脈收縮（transverse aortic coarctation，TAC）誘導(dǎo)心力衰竭的小鼠模型，通過檢測發(fā)現(xiàn)心臟組織中的Wnt1、Wnt3a、活性β-catenin和總β-catenin蛋白的表達(dá)升高，并且出現(xiàn)小鼠心臟纖維化，說明Wnt/β-catenin在TAC后的小鼠心臟中被激活，用ICG-001（Wnt通路抑制劑）治療后降低了TAC誘導(dǎo)的心臟中心肌纖維化及Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，在原代心肌細(xì)胞和CFs的體外模型中也同樣觀察到這種變化，因此證明了阻斷Wnt/β-catenin信號通路能夠預(yù)防心力衰竭，減輕心肌纖維化，改善心臟損傷。Methatham等［27］同樣使用TAC小鼠模型，Masson染色顯示TAC小鼠心臟組織中的間質(zhì)纖維化增加，ICG001處理后明顯減少，心臟中β-catenin在TAC小鼠中表達(dá)增加，但在ICG001處理的TAC小鼠中被顯著抑制，這些實驗結(jié)果表明，ICG001可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路減少心肌纖維化來預(yù)防和改善心臟肥大和心力衰竭。Ahn等［28］發(fā)現(xiàn)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7（protein arginine methyltransferase 7，PRMT7）基因敲除小鼠會引起心臟肥大和心肌纖維化，而PRMT7缺失的心臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，與Wnt信號通路相關(guān)的基因表達(dá)譜發(fā)生了改變，通過機制研究表明，PRMT7通過精氨酸殘基93處β-catenin的甲基化來抑制Wnt信號通路，這對于調(diào)節(jié)β-catenin的活性控制心臟肥大和心肌纖維化至關(guān)重要。

3.4 其他心肌纖維化及相關(guān)CVD

炎癥性擴張型心肌病是一種獨特的疾病，在被定義為心肌炎癥所導(dǎo)致的心功能障礙。心肌纖維化是擴張型心肌病心功能不全的重要原因，纖維化導(dǎo)致心壁順應(yīng)性降低，為了維持心功能，心臟不斷擴大，CFs對細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度沉積在擴張型心肌病的病理過程中起著關(guān)鍵作用［29］。國外學(xué)者用分泌的sFRP2沉默細(xì)胞外Wnt表達(dá)或用Wnt-C59抑制Wnt分泌，阻止TGF-β介導(dǎo)的炎性前體和CFs向致病性肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；用ICG-001抑制TCF/β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或β-catenin的遺傳缺失也可以阻止TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞形成；還發(fā)現(xiàn)了阻斷Smad非依賴性TGF-β激活激酶1（TCF-β-activated kinase 1，TAK1）通路可以完全消除TGF-β誘導(dǎo)的Wnt分泌，同樣阻止了CFs的形成；最后在心肌炎患者的心臟標(biāo)本中Wnt-1/Wnt-5a的水平升高也證實了Wnt軸對于心肌纖維化的關(guān)鍵作用［30］。這表明抑制Wnt分泌或TCF/β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可以減輕心肌炎后心肌纖維化的程度，在組織重塑期間Wnt分泌確實對心肌纖維化的發(fā)展有著至關(guān)重要的作用，由TAK 1介導(dǎo)的Wnt蛋白快速分泌是人和小鼠心肌炎中TGF-β介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化和心肌纖維化進(jìn)展的一種新的下游關(guān)鍵機制。這些結(jié)果都充分說明了細(xì)胞外Wnt或Wnt/β-catenin的藥理學(xué)靶向可能是一種有效的治療方法，可以防止病理性肌成纖維細(xì)胞的積聚，使心肌纖維化減輕，這種抗纖維化治療能防止炎癥性心肌病患者的疾病進(jìn)展。Edyta等［31］使用人CFs模型闡明了TGF-β、Wnt/β-catenin和IL-11之間的相互作用，并提出了一種控制心肌纖維化的新機制，表明Wnt/β-catenin通路的特異性激活促進(jìn)了TGF-β誘導(dǎo)的CFs到肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間的Wnt依賴性相互作用在心臟損傷和修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用。表達(dá)Wnt1的心外膜細(xì)胞在心臟受到損傷后以β-catenin依賴的方式發(fā)生上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）以適應(yīng)成纖維細(xì)胞的分化結(jié)局［32］。在人類心臟中，心臟內(nèi)源性抗衰老物質(zhì)Klotho的丟失，包括調(diào)節(jié)礦物質(zhì)代謝在內(nèi)的多效性作用，促進(jìn)TGF-β1信號傳導(dǎo)，并通過上調(diào)Wnt信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致明顯的心肌纖維化［33］。小鼠TAC導(dǎo)致的心臟壓力超負(fù)荷會激活導(dǎo)致CFs中的Wnt/β-catenin信號通路，導(dǎo)致心肌纖維化，β-catenin是心臟損傷后CFs中ECM基因表達(dá)所必需的。在TAC后β-catenin缺失的CFs中，間質(zhì)纖維化顯著減少，保護(hù)了心臟功能［34］。在缺乏DVL-1的小鼠中，阻斷Wnt信號可以減輕壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大和間質(zhì)纖維化的發(fā)生［35］?？傊?，這些研究說明Wnt/β-catenin信號通路通過從心外膜和內(nèi)皮細(xì)胞的分化過渡到間質(zhì)狀態(tài)來響應(yīng)損傷，從而促進(jìn)心肌纖維化。Nayakanti等［36］發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路分子在肺動脈高壓患者的右心室和右心室超負(fù)荷動物模型中表達(dá)上調(diào)，Wnt/β-catenin信號通路是通過激活FOS樣抗原1（FOS-like antigen1，F(xiàn)OSL1）和FOS樣抗原2（FOS-like antigen 2，F(xiàn)OSL2）基因的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致右心室的重構(gòu)，抑制β-catenin、FOSL1/2或WNT3a會使右心室成纖維細(xì)胞顯著降低膠原合成和其他重塑基因，研究中使用LGKK-974抑制Wnt信號，減輕了纖維化和心肌肥厚，從而改善了肺動脈高壓和右心室功能。經(jīng)歷EMT的內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展，CD146是一種在細(xì)胞外基質(zhì)中高度表達(dá)的黏附分子，Zhang等發(fā)現(xiàn)［37］CD146敲低上調(diào)了Wnt通路相關(guān)基因，并增加了β-catenin的蛋白質(zhì)水平和核易位，由此證明了CD146的上調(diào)可能對內(nèi)皮細(xì)胞EMT和心肌纖維化起到保護(hù)作用。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，抑制Wnt/β-catenin信號通路能夠減少心肌纖維化，Wnt/β-catenin信號通路在心肌纖維化中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。雖然迄今為止專注于Wnt/β-catenin靶向治療的臨床研究大多局限于癌癥方面，但目前的實驗研究也能夠證明Wnt/β-catenin信號通路在CVD，尤其是心肌纖維化中具有重要作用，因此值得在未來進(jìn)一步開發(fā)Wnt/β-catenin信號通路的靶向藥物。希望后續(xù)的研究者能夠?qū)⒉煌瑒游锬Ｐ椭械亩嗉?xì)胞水平實驗策略與更高層次的系統(tǒng)分析相結(jié)合，將基礎(chǔ)研究的結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，最終研究出Wnt依賴性的靶向藥物治療人類CVD。