HPLC 法測定金錢草中紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素

吳凡，黃昌晶，李潔，程丹，張偉，徐步斌，周斌

江西科技師范大學 藥學院，江西 南昌 330013

金錢草為報春花科植物過路黃LysimachiachristinaeHance 的干燥全草，具有利濕退黃、利尿通淋、解毒消腫等功效[1]。金錢草中主要化學成分有黃酮、多糖等[2-5]。藥理研究表明，金錢草具有抗炎鎮(zhèn)痛、利尿排石等作用[6-9]。目前對金錢草中化學成分分離、提取物的藥理作用研究較多，對藥材中多種活性成分檢測報道較少[10-11]。本實驗建立HPLC-UV 法測定金錢草中5 種黃酮類成分紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素，為金錢草藥材的質(zhì)量控制和進一步開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

TU-1950 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；1100 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；CP225D 分析天平，天津市泰斯特儀器有限公司；XMTD203 恒溫水浴鍋，江蘇中大儀器科技有限公司；JC101 電熱鼓風干燥箱，上海成順儀器儀表有限公司；KQ-200VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

金錢草藥材采集于四川省，批號S1～S4，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學鄧可眾教授鑒定為報春花科植物過路黃Lysimachia christinaeHance 的干燥全草，標本存放于江西科技師范大學藥學院。紫云英苷對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號AZ2111353，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號AF21092904，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；槲皮素對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號SQ8030，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；山柰酚對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號SK8030，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；異鼠李素對照品（成都植標化純生物技術有限公司，批號Z20105，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；甲醇（批號B2106011，色譜純）、磷酸（批號100106，分析純）、鹽酸（批號1908051，分析純）均購自西隴化工股份有限公司；娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），流動相為甲醇（A）-0.4%磷酸水（B），梯度洗脫（0～5 min，30%～45% A；5～15 min，45%～60% A；15～20 min，60%～60.1% A；20～25 min，60.1%～80% A；25～30 min，80%～30% A），檢測波長360 nm，體積流量0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取金錢草粉末（過100 目篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，精密加入鹽酸5 mL，置90 ℃水浴中加熱水解1 h，取岀，迅速冷卻，轉移至50 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取適量紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素對照品，制備質(zhì)量濃度分別為0.215、1.060、0.870、0.640、0.240 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別吸取適量混合對照品、金錢草供試品溶液，進樣測定，色譜圖見圖1。在此色譜條件下，紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素與其相鄰各組分色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均符合要求，供試品中紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素與混合對照品保留時間一致。

圖1 混合對照品（A）和金錢草（B）的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substances (A) and Lysimachia christinae (B)

2.5 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液（含紫云英苷176.80、132.60、88.40、44.20、22.10 μg/mL，山柰酚-3-O-蕓香糖苷169.12、126.84、84.56、42.28、21.14 μg/mL，槲皮素174.00、130.50、87.00、43.50、17.40 μg/mL，山柰酚408.96、306.72、204.48、102.24、51.12 μg/mL，異鼠李素186.40、139.80、93.20、46.60、23.30 μg/mL）。分別進樣測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，并以S/N＝3 和S/N＝10 計算檢測限（LOD）和定量限（LOQ），結果見表1。

表1 線性關系考察結果Table 1 Results of linear relationship investigation

2.6 精密度試驗

精密吸取適量的混合對照品溶液，按以上色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，計算得紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積的RSD 值分別為0.25%、0.20%、0.13%、0.16%、0.14%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取金錢草（S1）供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12、24 h 進樣測定，計算得紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素峰面積的RSD 值分別為0.58%、1.05%、0.33%、0.15%，1.26%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取金錢草（S1）粉末2.0 g，共6 份，制備供試品溶液，進樣測定，計算得紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素質(zhì)量分數(shù)的RSD 值分別為1.55%、1.24%、0.83%、1.39%、2.06%。

2.9 回收率試驗

取金錢草（S1）粉末約1.0 g，精密稱定，共6份，分別精密加入0.215 mg/mL 紫云英苷、0.265 mg/mL 山柰酚-3-O-蕓香糖苷、0.870 mg/mL 槲皮素、0.640 mg/mL 山柰酚和0.240 mg/mL 異鼠李素對照品溶液0.6、0.9、0.7、1.6、0.5 mL，制備供試品溶液，進樣測定峰面積，計算加樣回收率，結果紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的平均加樣回收率分別為99.50%、100.39%、99.93%、105.58%、98.96%，RSD 值分別為1.07%、1.44%、0.57%、0.24%、0.65%。

2.10 樣品測定

稱取金錢草粉末約2.0 g，精密稱定，各3 份，制備供試品溶液，進樣測定，按外標法計算金錢草中紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的質(zhì)量分數(shù)，見表2。

表2 金錢草中紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素測定結果（n＝3）Table 2 Determination of astragalin,kaemperfol-3-O-rutinoside,quercetin,kaempferol,and isorhamnetin in Lysimachia christinae (n＝3)

3 討論

因金錢草中黃酮類化合物呈弱酸性，并參考《中國藥典》2020 年版一部中金錢草的測定方法，分別考察了甲醇-酸水溶液、乙腈-酸水溶液不同體系的醋酸和磷酸水溶液，最終確定為甲醇-0.4%磷酸水溶液系統(tǒng)梯度洗脫，5 種黃酮類化合物能達到較好的分離。將紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素5 種對照品溶液和金錢草供試品溶液分別在300～450 nm 波長進行掃描，根據(jù)紫外掃描圖譜和預實驗的結果，選擇360 nm 作為金錢草藥材中活性成分測定的檢測波長。

現(xiàn)代藥理研究表明，紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和保護神經(jīng)損傷等藥理作用[12-16]，對這些活性成分進行質(zhì)量分析研究對金錢草的質(zhì)量控制具有重要的實際意義。本研究建立HPLC 法測定金錢草藥材中紫云英苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素5 種有效成分的方法，方法的重復性好，操作簡單，結果準確，可以用來控制金錢草藥材及其制劑的質(zhì)量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突