基于網絡藥理學和分子對接技術探討當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥的作用機制

李世哲 ，王蕾 ，宋光富

1.吉林工程技術師范學院 化學與工業(yè)生物工程交叉學科研究院，吉林 長春 130052

2.新型分子功能材料吉林省校企聯(lián)合技術創(chuàng)新實驗室，吉林 長春 130052

3.吉林工程技術師范學院 生物與食品工程學院，吉林 長春 130052

系統(tǒng)性硬化癥又稱硬皮病，是一種罕見且病因不明的自身免疫性疾病。其主要特征為廣泛血管病變和多器官組織的進行性纖維化，可累及皮膚、心臟、胃腸道和腎臟等多器官組織，嚴重影響患者生活質量甚至危及生命[1-3]。本病發(fā)病機制尚不明確，且缺少公認有效治療方法[4]?，F(xiàn)有研究表明系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病過程與免疫異常、血管損傷及細胞外基質合成過多密切相關[5-6]。西醫(yī)治療多采用鈣離子拮抗劑、糖皮質激素、結締組織抑制劑和免疫抑制劑等控制病情發(fā)展，但療效不佳且不良反應較大[7]。在中醫(yī)領域中，系統(tǒng)性硬化癥屬于“痹證”范疇，《素問·痹論》記載有“風濕寒三氣雜至，合而為痹也，”并認為該病是由陽虛凝寒、痰淤互結、血脈不通所致[8]。

當歸四逆湯出自《傷寒論》：“手足厥寒，脈細欲絕者，當歸四逆湯主之”[9]。該方劑由當歸、桂枝、芍藥、細辛、通草、大棗、炙甘草組成，具有溫經散寒，養(yǎng)血通脈之功效[9-10]。方中當歸為君藥補血，芍藥為臣滋養(yǎng)營氣，佐以桂枝、細辛溫散寒邪，大棗、甘草為使甘溫健脾補中，通草通行脈道[10]。現(xiàn)代臨床研究表明，當歸四逆湯對系統(tǒng)性硬化癥具有確實療效，且不良反應較少，與西藥聯(lián)用能提高療效，并減輕西藥的不良反應[11-12]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，當歸四逆湯具有抗凝及抗血栓形成、擴張血管末梢、鎮(zhèn)痛、抗炎及解痙等作用[10,13-15]；能夠明顯改善系統(tǒng)性硬化癥模型小鼠的皮膚硬化情況，并能降低組織中結締組織生長因子（CTGF）和轉化生長因子-β（TGF-β）的含量[16]；但當歸四逆湯對系統(tǒng)性硬化癥的治療機制尚待研究。

網絡藥理學是一門基于數(shù)據庫挖掘和高通量組學分析的交叉學科，并被廣泛用于藥物活性物質的整體作用機制研究[17]。據此，本研究采用網絡藥理學和分子對接技術系統(tǒng)分析當歸四逆湯對系統(tǒng)性硬化癥的治療過程，為將來進一步的實驗研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 當歸四逆湯活性成分的獲取與靶點的預測

分別以“當歸”“桂枝”“白芍”“細辛”“通草”“甘草”“大棗”為關鍵詞，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為標準，在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據庫和分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中檢索當歸四逆湯的活性成分。

1.2 潛在作用靶點的獲取

利用PubChem 數(shù)據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得各活性成分SMILES 式。將各SMILES 式輸入SwissTargetPrediction 數(shù)據庫預測各活性成分的藥物靶點。在GeneCards 數(shù)據庫（https://www.genecards.org ）中 以“ systemic scleroderma”為關鍵詞檢索獲得相關疾病靶點。利用UniProt 數(shù)據庫將所得藥物靶點和疾病靶點轉化為標準化基因名稱，再利用OmicShare 平臺（https://www.omicshare.com/）的韋恩圖工具繪制韋恩圖，并獲得藥物靶點和疾病靶點的交集，所得交集即為當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥的潛在作用靶點。

1.3 蛋白質相互作用（PPI）網絡和“化合物-靶點”網絡

將所得潛在作用靶點導入 String 數(shù)據庫（https://www.omicshare.com），并將物種設定為“Homo Sapiens”，置信度設置為0.4，構建PPI 網絡并獲得與治療相關性更強的PPI 靶點，同時以Cytoscape 3.7.2 軟件將PPI 網絡可視化，再利用Cytoscape 軟件中的network analyzer 插件進行網絡拓撲分析獲得各靶點的degree 值，并以degree 值為標準篩選PPI 網絡中的核心靶點（degree 值＞2 倍平均值）。將PPI 靶點及相關活性物質信息導入Cytoscape 軟件中構建“化合物-靶點”網絡，用于分析當歸四逆湯中活性成分與潛在作用靶點之間的關系，并通過網絡拓撲分析獲得各活性成分靶點在“化合物-靶點”網絡中的degree 值。

1.4 富集分析和關鍵靶點篩選

將PPI 靶點導入DAVID 數(shù)據庫（https://david.ncifcrf.gov）中進行基因本體（GO）功能和京都基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，選擇物種“Homo Sapiens”，設定閾值錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01。其中GO 功能富集分析包括細胞組分（CC）、生物過程（BP）、分子功能（MF）3 個部分。以FDR值排序后選擇排名前20 位的條目用于下一步分析，用OmicShare 平臺中高級氣泡圖工具實現(xiàn)可視化。

根據現(xiàn)有臨床研究和藥理學研究對KEGG 通路分析所得結果進行篩選，剔除不相關通路。將篩選所得通路和其相關靶點信息輸入Cytoscape軟件，建立“通路-靶點”網絡進行拓撲網絡分析獲得各靶點的degree 值，并以degree 值為標準篩選網絡核心靶點（degree 值＞2 倍平均值）。篩選PPI 網絡核心靶點和“通路-靶點”網絡核心靶點的交集，作為當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥的關鍵靶點。

1.5 分子對接

基于當歸四逆湯對系統(tǒng)性硬化癥治療關鍵靶點篩選結果，以相關活性物質為配體，關鍵靶點作為受體進行分子對接，驗證分析結果并預測治療中的潛在藥效成分。從RSDB PDB 數(shù)據庫（https://www1.rcsb.org）獲取關鍵靶點結構，通過TCMSP數(shù)據庫獲得相關活性物質的mol2 格式分子式，導入CB-Dock 網站（http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/index.php）進行分子對接并將結果可視化，以Vina Score 作為結合能力評價指標篩選潛在藥效成分（低于平均Vina Score）。

2 結果

2.1 活性物質的篩選和靶點預測

分別檢索當歸、桂枝、白芍、細辛、通草、甘草、大棗中有效成分，篩選得到2、7、13、8、4、92、29 個活性成分，去重后共計得到141 個活性成分，見表1。

表1 當歸四逆湯活性成分Table 1 Active ingredient of Danggui Sini Decoction

2.2 疾病靶點的獲取

將活性成分 SMILES 式導入 SwissTarget Prediction 數(shù)據庫預測靶點，共得到1 047 個靶點。以“systemic scleroderma”為關鍵詞在GeneCards 數(shù)據庫檢索，經過去重后共獲得1 568 個與系統(tǒng)性硬化癥相關的疾病靶點。經篩選后共得到當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥的潛在作用靶點266 個，圖1。

圖1 當歸四逆湯與系統(tǒng)性硬化癥靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of Danggui Sini Decoction and systemic sclerosis

2.3 PPI 網絡和“化合物-靶點”網絡

將266 個交集靶點導入String 數(shù)據庫中生成PPI 網絡，并以Cytoscape 軟件實現(xiàn)可視化，見圖2A。PPI 網絡中共包含261 個節(jié)點和4 992 條邊，節(jié)點平均degree 值38.25。圖中節(jié)點代表靶點，邊代表靶點之間相互關聯(lián)。經拓撲網絡分析篩選出29個靶點作為PPI 網絡的核心靶點，見圖2B，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL-6）、蛋白激酶B1（Akt1）、白蛋白（ALB）等?；谒肞PI 靶點及相關活性成分信息，以Cytoscape 軟件構建“化合物-靶點”網絡，見圖3，其中包含125 個活性成分節(jié)點和261 個靶點節(jié)點?！盎衔?靶點”網絡表示了當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥的多組分作用于多靶點的治療特點，活性成分的degree 值越高，說明其能夠作用于更多的靶點并可能在治療中發(fā)揮更多的作用。

圖2 當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥靶點PPI 網絡圖（A）和PPI 網絡的核心靶點（B）Fig.2 PPI network of therapeutic targets of Danggui Sini Decoction for systemic sclerosis (A) and core targets of PPI network (B)

圖3 “化合物-靶點”網絡Fig.3 “Compound-target” network

2.4 富集分析和關鍵靶點篩選

將所得PPI 靶點導入DAVID 數(shù)據庫進行GO功能富集分析，在FDR＜0.01 條件下篩選得到520條GO 條目，其中BP 條目399 條，CC 條目48 條，MF 條目73 條，以FDR 值排序后取各項前20 位的條目繪制氣泡圖，見圖4。其中BP 分析結果顯示，作用靶點主要富集于細胞增殖、細胞遷移、炎癥響應、血管病變、蛋白質磷酸化、細胞外基質、信號傳導、蛋白質水解等。CC 分析結果說明，作用靶點廣泛富集于細胞核、細胞質、細胞膜等部位。MF 分析結果表明，作用靶點可影響蛋白激酶活性和蛋白結合。

圖4 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析Fig.4 GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis

將所得PPI 靶點導入DAVID 數(shù)據庫進行KEGG 通路富集分析，在FDR＜0.01 條件下共篩選得到148 條信號通路，按照FDR 值排序后取前20位的信號通路繪制氣泡圖，見圖4。剔除與系統(tǒng)性硬化癥不相關通路后，篩選得到促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路、Rap1 信號通路、黏著斑（focal adhesion）、脂質和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、流體剪切應力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）等關鍵通路，見表2，這些通路主要涉及免疫、血管損傷和細胞外基質等調節(jié)。

表2 關鍵通路信息Table 2 Information of key pathways

基于信號通路篩選結果，將所得通路及相關靶點信息輸入Cytoscape 軟件建立“通路-靶點”網絡，見圖5。如圖所示，“通路-靶點”網絡包含6個信號通路節(jié)點和98 個靶點節(jié)點。經網絡拓撲分析獲得各靶點節(jié)點的degree 值，并以degree 值為標準篩選出“通路-靶點”網絡的核心靶點，比對PPI 網絡核心靶點和“通路-靶點”網絡核心靶點后得到交集，見圖6，交集靶點即為當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥的關鍵靶點。

圖5 “通路-靶點”網絡圖Fig.5 Network of “pathways-targets”

圖6 “通路-靶點”網絡的核心靶點Fig.6 Core targets of “pathways-targets” network

2.5 分子對接

基于關鍵治療靶點篩選結果將Akt1、血管內皮生長因子受體2（KDR）、V-Ha-Ras 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、MAPK1、MAPK3、血管內皮生長因子A（VEGFA）作為大分子受體，將相關活性成分作為配體，采用CB-Dock 進行分子對接。CB-Dock 使用基于空腔檢測法和配體結合姿態(tài)的AutoDock Vina 來預測蛋白的結合位點，Vina score是對受體和配體以相應參數(shù)對接而得到復合物的評分，評分越低說明二者結合越穩(wěn)定[18-19]。分子對接結果顯示，與Akt1、KDR、HRAS、MAPK1、MAPK3、VEGFA 結合能力較強的活性成分（低于平均Vina score）分別有6、18、2、6、5、4 個，這些結合能力較強的活性成分也可能是治療中發(fā)揮作用的潛在藥效成分。在這些藥效成分中，與Akt1、KDR、HRAS、VEGFA 結合能力最強的藥效成分分別是shinpterocarpin、水鬼蕉賓堿、芍藥苷、酸棗仁皂苷A，而原卟啉與MAPK1 和MAPK3 結合能力最強，見圖7。

圖7 分子對接結果可視化分析圖Fig.7 Visual analysis diagram of molecular docking results

3 討論

本研究結果表明，當歸四逆湯對系統(tǒng)性硬化癥的治療具有多組分通過多靶點調節(jié)多通路的特點。經過一系列網絡分析后得出當歸四逆湯對系統(tǒng)性硬化癥治療的關鍵靶點為Akt1、KDR、HRAS、MAPK1、MAPK3、VEGFA。其中Akt1 是一種調控免疫和炎癥的激酶，Akt1 蛋白水平可以影響系統(tǒng)性硬化癥模型小鼠皮膚硬化、間質性纖維化和炎癥情況[20-21]。VEGFA 是影響血管內皮細胞增殖、遷移和存活的主要生長因子之一，KDR 為其主要受體，VEGF/KDR 信號能夠促進內皮細胞的增殖、存活、黏附和遷移等，并與各類涉及病理性血管生成的疾病相關[22-23]。同時，KDR 和VEGFA 的表達上調和對VEGF/KDR 信號的激活也被認為在系統(tǒng)性硬化癥的血管損傷中發(fā)揮重要作用[23]。MAPK 能夠連接細胞外刺激和細胞內調節(jié)過程，協(xié)調環(huán)境變化對細胞反應和細胞信號間的影響[24]。有研究表明，MAPK3/MAPK1 信號的抑制能夠用于各類炎癥性疾病的治療[25]。此外，在對系統(tǒng)性硬化癥模型動物組織中mRNAs 的N6-甲基腺苷甲基化研究中發(fā)現(xiàn)，HRAS 在甲基化和表達中發(fā)生明顯變化，說明其在表觀遺傳機制中發(fā)揮重要作用，預示著其可能作為系統(tǒng)性硬化癥疾病的治療靶點[26]。

根據分子對接結果，共篩選出芍藥苷、shinpterocarpin、水鬼蕉賓堿、酸棗仁皂苷A_qt、原卟啉等57 個與關鍵靶點結合能力較強的活性成分。因其與靶點良好的結合能力，這些活性成分也可能是當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥的潛在藥效成分。這些成分可通過對相關靶點的作用從而調節(jié)相關通路，進而發(fā)揮藥效功能。芍藥苷在“化合物-靶點”網絡中具有高于平均水平的degree 值，說明其能與更多的藥物靶點對應并發(fā)揮更廣泛的藥效作用。分子對接結果顯示，芍藥苷是與HRAS 結合能力最強的藥效組分；同時也與KDR 和VEGFA 具有較強的結合能力，說明芍藥苷能通過調節(jié)多靶點并發(fā)揮廣泛的藥效功能。有研究表明，芍藥苷能夠抑制VEGF 及相關受體表達進而抑制血管增生，從而實現(xiàn)對慢性炎癥的治療[27]。此外，芍藥苷還能通控制血管內皮細胞產生一氧化氮（NO）實現(xiàn)對內皮細胞的保護作用[28]?！巴?靶點”網絡指出，芍藥苷能同時通過HRAS、KDR、VEGFA 參與MAPK 信號通路、PI3K/Akt 信號通路、Rap1 信號通路和黏著斑的調節(jié)，即芍藥苷可能通過HRAS、KDR、VEGFA調節(jié)上述通路實現(xiàn)對系統(tǒng)性硬化癥治療藥效作用。

KEGG 通路富集分析結果顯示，MAPK 信號通路、PI3K/Akt 信號通路、Rap1 信號通路、黏著斑、脂質和動脈粥樣硬化和流體剪切應力和動脈粥樣硬化等為當歸四逆湯治療系統(tǒng)性硬化癥的關鍵通路，這些通路主要涉及免疫、血管損傷和細胞外基質等調節(jié)。有研究表明，KDR 可以激活PI3K/Akt 信號通路并調節(jié)內皮細胞的增殖過程[29]；VEGFA 通過KDR 介導激活MAPK 信號通路從而促進內皮細胞的遷移[30]。內皮細胞間連接處的KDR 蛋白受應力刺激激活后可激活下游的Akt 和MAP 激酶并產生NO，進而影響系統(tǒng)性硬化癥血管損傷病變[31-32]。Rap1 在VEGF 誘導的內皮細胞遷移過程中發(fā)揮重要的介導作用[33]。細胞外基質累積是系統(tǒng)性硬化癥的主要治病機制，黏著斑在細胞外基質累積過程中發(fā)揮重要作用[34]；而受KDR 介導的信號可以影響內皮細胞的遷移和增殖，進而影響病情發(fā)展[35-36]。

綜上所述，當歸四逆湯可以通過芍藥苷、shinpterocarpin、水鬼蕉賓堿等成分作用于多靶點進而調節(jié)多條通路發(fā)揮對系統(tǒng)性硬化癥的治療作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突