基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討仙鶴草改善慢性萎縮性胃炎的作用機制

任小軍 ,張曼玲 ,趙慧慧 ,時昭紅*

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065

2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430022

慢性萎縮性胃炎是公認的胃癌前病變[1]。慢性萎縮性胃炎在組織病理上一般表現(xiàn)為胃黏膜固有腺體萎縮，或伴有腸上皮以及假幽門腺化生[2]。目前診斷主要依靠胃鏡結(jié)合病理活檢的方法[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療慢性萎縮性胃炎以根除幽門螺旋桿菌（HP）、補充葉酸、改善飲食習(xí)慣等治療為主[4-5]。中醫(yī)學(xué)尚無萎縮性胃炎的名稱，根據(jù)臨床癥狀多命名為“胃痞”“胃脘痛”等。病性多屬“本虛標(biāo)實”，本虛以脾胃氣虛和/或陰虛為主，標(biāo)實則有血瘀、熱毒、濕阻、氣滯等，多呈兼夾之勢[6]。中醫(yī)學(xué)從“整體觀念”和“辯病與辨證相結(jié)合”的角度出發(fā)，在治療慢性萎縮性胃炎方面取得較好的臨床療效。其中仙鶴草廣泛應(yīng)用于治療萎縮性性胃炎的復(fù)方中。

仙鶴草又名“脫力草”“狼牙草”臨床多取其“收斂止血”之功，而往往忽視其“健脾補虛”之效。南京中醫(yī)藥大學(xué)王燦暉教授臨床善用仙鶴草治療萎縮性胃炎，其認為“脾胃虛弱”是慢性萎縮性胃炎發(fā)病及轉(zhuǎn)變的根本內(nèi)因，因此其方劑多用仙鶴草以“健胃補虛”，常與白術(shù)、太子參等相需為用；有研究通過對其治療萎縮性胃炎的常用方藥進行數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，仙鶴草作為重要的“健胃補虛”藥廣泛出現(xiàn)在其方劑中[7]。同樣，通過對全國名中醫(yī)張杰教授治療萎縮性胃炎的1 019 個處方進行數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)果同樣顯示仙鶴草作為重點單藥廣泛存在其方劑中[8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，仙鶴草具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤和保護胃腸道等作用[9-10]，但其進一步的作用機制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)的方法，可以在一定程度上探明中藥有效成分及其作用靶點的對應(yīng)關(guān)系，進而揭示其療效機制[11]。因此，本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選仙鶴草治療慢性萎縮性胃炎的有效成分，進一步分析其作用靶點及相關(guān)信號通路，為后續(xù)基礎(chǔ)及臨床研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 篩選仙鶴草的主要成分及預(yù)測潛在靶點

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索仙鶴草的各種化學(xué)成分，根據(jù)口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 進行活性成分篩選以獲得活性化合物及其作用的靶點。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）查找所有靶點對應(yīng)的基因名，物種限定為人類。

1.2 獲取疾病相關(guān)靶點

以“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）查找慢性萎縮性胃炎相關(guān)疾病靶點，合并2 個數(shù)據(jù)庫的疾病靶點并剔除重復(fù)靶點，得到慢性萎縮性胃炎的靶點。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

為明晰仙鶴草相關(guān)靶點與慢性萎縮性胃炎靶點間的相互作用，將仙鶴草的靶點與慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點進行映射，并通過Venny 2.1 軟件將二者靶點取交集并繪制韋恩圖。進而將交集靶點提交至String 12.0 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，將生物種類設(shè)定為“homo sapiens”，去掉相互之間沒有聯(lián)系的節(jié)點，其余參數(shù)默認，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。再使用Cytoscape 3.10.1 軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，根據(jù)degree 值篩選核心靶點，degree 值越大表明其在PPI 關(guān)系圖中越重要。

1.4 靶點基因本體（GO）功能與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對“仙鶴草-慢性萎縮性胃炎”交集靶點進行GO功能與KEGG 代謝通路富集分析，其中GO 功能分析包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）三部分，通過R 軟件對保存的數(shù)據(jù)結(jié)果進行可視化。

1.5 分子對接驗證

在PubChem 數(shù)據(jù)庫及PDB 數(shù)據(jù)庫分別獲取配體的mol2 格式文件、受體的pdb 格式文件。首先在AutoDock Tools 1.5.7 軟件中對受體和配體進行去水、加氫、分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵等處理，其次通過Autodock Vina 進行分子對接，最后選取部分對接結(jié)果在Pymol 軟件中進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 仙鶴草主要活性成分

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫平臺，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18，共檢索并篩選得到仙鶴草5 個活性成分，即鞣花酸、山柰酚、兒茶素、木犀草素、槲皮素，見表1。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫進行Gene Symbol 轉(zhuǎn)換，剔除重復(fù)靶點，得到靶標(biāo)90 個。

表1 仙鶴草有效活性成分Table 1 Active ingredients of Agrimoniae Herba

2.2 疾病靶點預(yù)測

以“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞在GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫搜索有關(guān)慢性萎縮性胃炎的靶點，剔除重復(fù)靶點后共提取靶點929 個。將仙鶴草靶點與慢性萎縮性胃炎靶點進行取交集并繪制韋恩圖（圖1），得到“仙鶴草-慢性萎縮性胃炎”共同靶點46 個。

圖1 “仙鶴草-慢性萎縮性胃炎”靶點韋恩圖Fig.1 Targets Venn diagram of “Agrimoniae Herba -chronic atrophic gastritis”

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

將獲取的共同46 個共同靶點導(dǎo)入String 平臺構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有46 個蛋白節(jié)點，445 條邊代表蛋白之間的相互作用，各節(jié)點平均degree 值為22.5（圖2），將得到的PPI 信息導(dǎo)入Cytoscape 3.10.1 軟件，構(gòu)建“中藥-疾病-化合物-交集靶標(biāo)”交集網(wǎng)絡(luò)（圖3）。利用R 軟件對degree 排名前20 位的核心靶點可視化（圖4），結(jié)果表明這20個靶點可能是仙鶴草治療慢性萎縮性胃炎的潛在治療靶點。其中B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、表皮生長因子受體（EGFR）、缺氧誘導(dǎo)因子-1A（HIF-1A）、原癌基因（MYC）的degree 值最高，因此預(yù)測此5 個靶點為最核心靶點。其中Bcl-2、CASP3 與細胞凋亡關(guān)系密切；而EFGR 與細胞的生長、增殖、分化、遷移與腫瘤的發(fā)生都有關(guān)；HIF-1A 與氧代謝關(guān)系密切、MYC 是經(jīng)典的原癌基因。

圖2 “仙鶴草-慢性萎縮性胃炎”交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of “Agrimoniae Herba -chronic atrophic gastritis”

圖3 “中藥-疾病-化合物-交集靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of “traditional Chinese medicine -disease -compound -intersection target”

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前20 位的核心靶點Fig.4 Top 20 core targets in the degree value of the PPI network

2.4 GO 和KEGG 富集分析

GO 富集分析共獲得349 個條目，包括生物學(xué)過程（BP）254 條、細胞組成（CC）30 條、分子功能（MF）65 條，分別取BP、CC、MF 排名前10 位的條目進行可視化分析（圖5）。BP 涉及凋亡過程的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子途徑轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter）、基因表達的正調(diào)控（positive regulation of gene expression）、細胞對DNA 損傷刺激的反應(yīng)（cellular response to DNA damage stimulus）、增殖的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of proliferation）；主要涉及胞質(zhì)（cytosol）、細胞核（nucleus）、胞質(zhì)溶膠（cytosol）、核質(zhì)（nucleoplasm）等CC，與蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、相同蛋白結(jié)合（identical protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、泛素-蛋白質(zhì)連接酶結(jié)合（ubiquitin protein ligase binding）、蛋白質(zhì)同源二聚活性（protein homodimerization activity）等MF 關(guān)聯(lián)性較大。對交集靶點蛋白開展KEGG 通路富集分析，獲得104 條通路。根據(jù)P值的大小，選取前10 位關(guān)聯(lián)性較大的通路進行可視化分析（圖6）。仙鶴草治療慢性萎縮性胃炎的主要信號通路包括癌癥通路（pathways in cancer）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路（lipid and atherosclerosis）、卡卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、乙型肝炎（hepatitis B）等信號通路。

圖5 仙鶴草主要化合物作用靶點的GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of the main compound action targets of Agrimoniae Herba

圖6 KEGG 通路富集結(jié)果Fig.6 KEGG pathway enrichment results

2.5 核心靶點分子對接驗證

兒茶素、鞣花酸、山柰酚、木犀草素、槲皮素這5 種重要的化合物與核心靶點Bcl-2、CASP3、EGFR、HIF-1A、MYC 進行分子對接，驗證成分與靶點間的結(jié)合活性（表2）。對接結(jié)果用結(jié)合能表示，結(jié)合能小于0 則表明分子與靶點可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）時表明分子與靶點對接較好，結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol 表示結(jié)合的非常穩(wěn)固[12]。對接結(jié)果表明主要活性成分與核心靶點均能自發(fā)結(jié)合，其中木犀草素與Bcl-2 對接的結(jié)合能最低，兒茶素、鞣花酸、山柰酚、槲皮素均與EGFR結(jié)合能最低。將以上對接結(jié)果用PyMOL 進行可視化（圖7）。

圖7 核心成分與核心靶點的分子對接Fig.7 Core components interconnected with molecules of core targets

表2 仙鶴草核心成分與核心靶點的結(jié)合能Table 2 Binding energy of Agrimoniae Herba core component and core targets

3 討論

本研究使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對仙鶴草的活性成分進行篩選，運用GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫對慢性萎縮性胃炎的靶點進行預(yù)測篩選，研究發(fā)現(xiàn)仙鶴草中OB≥30%、DL≥0.18 的化合物有兒茶素、鞣花酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素，5 個化合物對應(yīng)46 個靶點，可見仙鶴草是通過多成分、多靶點的特點對慢性萎縮性胃炎發(fā)揮治療作用。既往研究提示槲皮素、木犀草素、兒茶素、山柰酚等天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[13-17]。研究顯示，槲皮素是一種強大的自由基清除劑，能使胃上皮GES-1 細胞免受過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的氧化損傷從而發(fā)揮保護作用[18]。槲皮素同時也是良好的抗炎劑，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以選擇性的阻斷環(huán)氧合酶-2（COX-2），表現(xiàn)出良好的抗炎活性；動物試驗證明其可以促進小鼠脾淋巴細胞增殖，抑制T、B 淋巴細胞增殖和分泌細胞因子[19]。此外，大量基礎(chǔ)研究顯示槲皮素可以通過多種途徑抑制胃癌細胞的增殖、同時誘導(dǎo)焦亡，從而表現(xiàn)出抗腫瘤作用[20-24]。兒茶素是一種天然抗氧化劑，表現(xiàn)出廣泛的抗炎、抗腫瘤作用，其機制可能是與調(diào)節(jié)核因子-κB（NF-κB）、核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）、Toll 樣受體4（TLR4）/NF-κB、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等多種通路相關(guān)[25]。研究表明，山柰酚通過調(diào)控細胞凋亡、使細胞周期停滯在G2/M 期、下調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物以及磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路來發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。研究顯示，木犀草素可以通過抑制腫瘤細胞增殖、防止致癌刺激、激活細胞周期停滯以及誘導(dǎo)細胞凋亡來阻止體外和體內(nèi)癌癥的發(fā)展[14]。鞣花酸是天然的抗氧化劑，其抗氧化特性是發(fā)揮潛在抗癌作用的基礎(chǔ)，而鞣花酸是通過清除自由基來表現(xiàn)出抗氧化活性[26]。

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)以及分子對接驗證的結(jié)果可知，仙鶴草治療慢性萎縮性胃炎所涉及到的重要靶點包括BCL-2、CASP3、EGFR、HIF-1A、MYC 等。Bcl-2 是一種抑制細胞凋亡的基因，它的過度表達可使細胞凋亡受抑制。生理狀態(tài)下，胃黏膜上皮細胞死亡的主要形式是細胞凋亡，胃黏膜憑借Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）促凋亡與Bcl-2 促增殖之間的平衡維持其穩(wěn)定性。一旦該平衡被打破，則有可能發(fā)生病變。有研究檢測了胃黏膜輕度不典型增生、重度不典型增生及胃癌組織標(biāo)本中Bcl-2 和Bax 的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在輕度、重度不典型增生及胃癌組織中Bcl-2 陽性表達率逐漸增高，Bax 陽性表達率逐漸降低[27]。由此可以推測Bcl-2 與Bax 比例失衡是胃黏膜異性增生和胃癌的特點之一。因此，大量研究進一步從動物模型上驗證了中醫(yī)藥可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2 與Bax 的表達來發(fā)揮治療作用。韋維等[28]發(fā)現(xiàn)，安胃湯可能通過降低Bcl-2 及NF-κB 在胃黏膜及血液中的表達，調(diào)節(jié)促進細胞凋亡、增強黏膜屏障的防御和修復(fù)的功能，從而達到治療慢性萎縮性胃炎的目的。婁華等[29]發(fā)現(xiàn)，愈胃靈合劑可以明顯下調(diào)慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜Bcl-2 表達同時上調(diào)Bax 的表達來發(fā)揮治療作用。還有袁紅霞等[30]發(fā)現(xiàn)，善胃Ⅰ號抑制大鼠胃黏膜Bcl-2 蛋白的表達并促進Bax 蛋白的表達的研究以及周巍等[31]通過傳統(tǒng)針灸療法降低NF-κB 及Bcl-2 基因表達發(fā)揮對慢性萎縮性胃炎的治療作用。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析可以看出，仙鶴草治療慢性萎縮性胃炎的核心靶點之一為Bcl-2 與既往研究結(jié)果一致。Caspase-3 是細胞凋亡途徑中最為關(guān)鍵的酶類之一，在促進細胞凋亡的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的作用[32]。有研究檢測了在非癌組織、癌前（萎縮性胃炎和腸化生）組織和胃癌組織Caspase-3 的表達，結(jié)果提示Caspase-3在所有非癌性黏膜中的表達為100%，在癌前組織中的表達為94.1%，在胃癌組織中的表達僅有31.3%[33]。同樣，也有研究檢測了不同病理狀態(tài)的胃黏膜組織中Caspase-3 的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caspase-3蛋白表達在慢性萎縮性胃炎和輕中度不典型不典型增生中表達上調(diào)，但在重度不典型增生和胃癌中表達下調(diào)，表明Caspase-3 失活或表達減少與胃黏膜癌變密切相關(guān)[34]?；谝陨衔葛つげ煌瑺顟B(tài)下Caspase-3 的表達差異，有學(xué)者通過動物試驗的方法進一步驗證了中藥補氣活血方可以有效逆轉(zhuǎn)萎縮性胃炎大鼠胃黏膜Caspase-3 表達下調(diào)從而發(fā)揮治療作用[35]。EGFR 屬于受體酪氨酸激酶（RTK）的ErbB 家族。這些跨膜蛋白在與表皮生長因子（EGF）蛋白家族的肽類生長因子結(jié)合后被激活。生長因子誘導(dǎo)的EGFR 信號傳導(dǎo)對于許多正常形態(tài)發(fā)生過程至關(guān)重要，但該受體家族成員的異?；钚砸驯蛔C明在多種腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]。有研究檢測了萎縮性胃炎大鼠和正常對照大鼠血清EGF 和胃黏膜EGFR 的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性萎縮性胃炎組平均EGF 水平和EGFR 表達陽性率80%顯著高于對照組[37]?？梢奅GFR 在萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。EGFR 位于調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附、遷移和分化等復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的前端，其下游可激活包括MAPK、PI3K/Akt 等多條信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)仙鶴草的多種有效成分均可以與EGFR 自發(fā)性結(jié)合，因此推測仙鶴草靶向EGFR 通過其下游多條相關(guān)通路發(fā)揮治療作用。腫瘤中普遍存在組織缺氧，對組織缺氧的適應(yīng)是惡性細胞的重要特征之一。HIF-1A 是缺氧誘導(dǎo)因子HIF的關(guān)鍵調(diào)節(jié)亞基，既往研究表明HIF-1A 過表達與結(jié)腸癌的不良預(yù)后相關(guān)[38]。c-NYC 基因是一種具有高度保守的DNA 結(jié)合蛋白的癌基因。c-MYC 蛋白在早期胃癌和慢性萎縮性胃炎中的表達顯著高于慢性非萎縮性胃炎，提示c-MYC 蛋白的過度表達與癌前病變和胃癌密切相關(guān)，研究顯示，胃熱傷陰證慢性萎縮性胃炎患者甲基化的c-MYC 均明顯高于其他證型[39]。

通過GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，仙鶴草靶點在生物過程中主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控，且廣泛分布于細胞質(zhì)及核內(nèi)，多數(shù)具有與蛋白結(jié)合的功能。KEGG 富集分析得104 條信號通路，根據(jù)P值大小進行排序，選取前10 位為主要信號通路如癌癥通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染和乙型肝炎感染等信號通路等。萎縮性胃炎已經(jīng)明確是癌前病變，其某些生物學(xué)特質(zhì)與胃癌相似，因此仙鶴草治療萎縮性胃炎的靶點富集到癌癥通路恰好可以說明這一點。癌癥與動脈粥樣硬化中存在許多相互作用[40]，因此仙鶴草可以通過調(diào)節(jié)動脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路從而調(diào)治癌癥及癌前病變的發(fā)生。此外，卡卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染和乙型肝炎感染為病毒感染的過程，因此可以推斷仙鶴草可能通路調(diào)節(jié)病毒與免疫過程發(fā)揮治療作用。

綜上所述，仙鶴草可能通過其有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、兒茶素、鞣花酸等作用于Bcl-2、CASP3、EGFR、HIF-1A、MYC 等腫瘤相關(guān)靶點調(diào)控腫瘤相關(guān)通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染和乙型肝炎感染等通路，進而影響細胞增殖、凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激、免疫等生物學(xué)過程發(fā)揮治療萎縮性胃炎這一癌前病變的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突