基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證探討瓜蔞皮注射液治療動脈粥樣硬化的作用機制

高錕，朱春勝，于東升，李曉萍

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

動脈粥樣硬化是血管內(nèi)膜內(nèi)各種細(xì)胞、脂質(zhì)和碎片組織形成斑塊的過程，是一種由傳統(tǒng)和非傳統(tǒng)危險因素介導(dǎo)的慢性血管炎癥[1]。臨床大量研究表明動脈粥樣硬化是心血管疾病的病理基礎(chǔ)，其中不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊破裂、血小板聚集、血栓形成引起血管狹窄或閉塞，是導(dǎo)致心肌梗死、缺血性心肌病、中風(fēng)和外周動脈疾病等心血管疾病的主要因素[2-3]。美國國家健康與營養(yǎng)檢查數(shù)據(jù)顯示，2005—2008 年美國高低密度脂蛋白膽固醇的總體人口患病率已達(dá)33.5%[4]?！吨袊难芙】蹬c疾病報告2019》指出，我國目前心血管病患病率處于逐年上升階段，患病人數(shù)已達(dá)3.3 億人，且平均每5例死亡病例中就有2 例死于心血管病[5]。因此，開展動脈粥樣硬化的治療對防治心血管病帶來的風(fēng)險顯得尤為重要。

瓜蔞皮注射液是由瓜蔞皮提取純化制成的中藥注射劑，目前已被廣泛應(yīng)用于冠心病、不穩(wěn)定型心絞痛、冠脈介入術(shù)后等心血管疾病的臨床治療[6]。然而瓜蔞皮注射液對心血管疾病的前期動脈粥樣硬化是否有影響還未見相關(guān)報道。中藥產(chǎn)生的藥效是多靶點、多成分的綜合效應(yīng)，其生物活性及其分子機制非常復(fù)雜，如何避免中藥多成分割裂式的研究，構(gòu)建反映中藥“整體性”特色的藥效成分篩選模式是一個值得不斷深入探索的科學(xué)問題[7]。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從多成分、多靶點、多途徑層面系統(tǒng)闡述中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，較好地體現(xiàn)了中醫(yī)的“整體觀”，已逐步獲得了業(yè)內(nèi)人士的認(rèn)可[8-9]。因此，本研究將結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實驗，從體內(nèi)外2 個維度探討了瓜蔞皮注射液治療動脈粥樣硬化的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，以期為瓜蔞皮注射液向臨床深入推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 瓜蔞皮注射液化學(xué)成分與潛在靶點篩選 以“ 瓜蔞皮注射液”“ Trichosanthis Pericarpium Injection”“Gualoupi Injection”為關(guān)鍵詞，在CNKI、萬方數(shù)據(jù)庫、PubMed 數(shù)據(jù)庫檢索并收集有關(guān)瓜蔞皮注射液的化學(xué)成分文獻(xiàn)報道。將上述獲得的化合物導(dǎo)入PubChem 數(shù)據(jù)庫下載化合物2D 結(jié)構(gòu)的SDF圖，并導(dǎo)入Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫，以胃腸道吸收度（GI absortion）為“High”和滿足類藥性五原則lipinski、ghose、veber、egan、muegge 其中的2 個或2 個以上為條件再次篩選。同時，將上述符合條件的化合物導(dǎo)入到Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中檢索相應(yīng)的靶點，收集靶點信息。

1.1.2 動脈粥樣硬化靶點檢索及“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在OMIM、TTD、Gene Cards 3 個數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“atherosclerosis”進(jìn)行檢索，匯總與動脈粥樣硬化相關(guān)的靶點，并結(jié)合Uniprot 蛋白庫對上述靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，構(gòu)建動脈粥樣硬化靶點數(shù)據(jù)庫。

將瓜蔞皮注射液活性成分與瓜蔞皮注射液-動脈粥樣硬化相關(guān)靶點使用Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer 功能對瓜蔞皮注射液的主要活性成分進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì)分析，根據(jù)degree 值進(jìn)行排序，以獲得瓜蔞皮注射液活性成分成分和靶點的網(wǎng)絡(luò)圖。使用Venny 2.1 軟件將1.1.1 項下瓜蔞皮注射液活性成分預(yù)測靶點和動脈粥樣硬化靶進(jìn)行匹配，繪制共同靶點韋恩圖，獲得瓜蔞皮注射液治療動脈粥樣硬化的共有靶點。

1.1.3 基于String 的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建 將瓜蔞皮注射液和動脈粥樣硬化共有靶點輸入到String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”進(jìn)行檢索，以獲得PPI 圖，同時通過degree 值來篩選瓜蔞皮注射液治療動脈粥樣硬化的核心靶點。

1.1.4 通路富集分析 將瓜蔞皮注射液和動脈粥樣硬化共有靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行關(guān)鍵靶點基因本體（GO）生物學(xué)富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析。利用微生信在線繪圖工具對GO 分析結(jié)果中的生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）以及KEGG 結(jié)果作可視化處理。

1.2 動物實驗驗證

1.2.1 藥品與試劑 瓜蔞皮注射液購自上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，規(guī)格4 mL/瓶，批號2 103201；三酰甘油（TG）試劑盒（批號141722012）、總膽固醇（TC）試劑盒（批號141622014）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（批號142122013）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（批號142022013）均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；蛋白激酶B1（Akt1）抗體（批號51077-1-AP）、p-Akt1 抗體（批號28731-1-AP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（批號66470-z-Ig）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）抗體（批號11097-1-AP）均購自美國Proteintech 公司，p-SRC 抗體（批號595485）購自美國CST 公司。

1.2.2 主要儀器 BS-240VET 全自動生化分析儀（深圳邁瑞公司）；石蠟組織切片機（美國AO 公司）；Nikon Eclipse E100 型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；5430R 低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；YB3002 分析天平（上海力能電子儀器公司）；恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2.3 動物 SPF 級8 周齡雄性Apo E-/-小鼠18 只及相同周齡及遺傳背景的雄性C57BL/6J 小鼠6 只，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物中心，動物批號110324210106099213，許可證號SCXK（京）2019-0010。實驗期間全程喂養(yǎng)于動物實驗中心適應(yīng)1 周，室內(nèi)溫度22～25 ℃，相對濕度40%～45%。本實驗獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生命科學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批號2023-KY-1400

鑒于施工圖紙設(shè)計的復(fù)雜性的自身特征，對于總體工作量較大的制圖環(huán)節(jié)，管理人員也應(yīng)當(dāng)重視圖紙設(shè)計的統(tǒng)一規(guī)范性和合理性，并通過監(jiān)管制度的落實，及時發(fā)現(xiàn)不合格的圖紙資料，對其進(jìn)行修正處理，確保圖紙資料對于實際建筑施工的參考價值。

1.2.4 動物模型建立及分組 Apo E-/-小鼠給予高脂飲食8 周建立動脈粥樣硬化小鼠模型，周齡及遺傳背景相同的雄性C57BL/6J 對照組小鼠給予普通飲食[10]；高脂飲食飼養(yǎng)7 周后，18 只Apo E-/-小鼠隨機分為模型組、瓜蔞皮注射液（0.6、1.2 mL/kg）組，每組6 只。瓜蔞皮注射液組分別im 0.6、1.2 mL/kg 瓜蔞皮注射液，連續(xù)給藥3 周。

1.2.5 取材 末次給藥后，小鼠麻醉后，腹主動脈采血，放于普通試管中，3 000×g離心10 min，分離上清液，用于測定TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平；同時剝離主動脈，部分置于4%多聚甲醛固定用于病理學(xué)觀察，部分置于液氮用于核心蛋白表達(dá)的驗證。

1.2.6 觀察主動脈組織病理變化 取新鮮主動脈組織，固定液固定組織，固定后清水沖洗，并采用梯度乙醇進(jìn)行處理，并進(jìn)行石蠟組織包埋，后經(jīng)脫蠟、脫水等一系列操作后，伊紅染色3 min，脫水封片，顯微鏡下觀察組織病理情況。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）法檢測核心蛋白表達(dá) 稱取各組小鼠主動脈組織，加入裂解液提取總蛋白，采用BCA 法對各樣本蛋白濃度進(jìn)行定量。提取的蛋白（20 μg）通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5 %脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜（核心蛋白抗體Akt1、Caspase 3、p-SRC 及內(nèi)參β-actin 稀釋比例1∶1 000，p-Akt1 稀釋比例1∶2 000，SRC 稀釋比例1∶500）。用TBST緩沖溶液洗滌后，二抗孵育1 h。用ECL 顯色，Bio-RAD 曝光儀曝光，采集不同時段的顯色條帶。以βactin 為內(nèi)參，用Image J 軟件對條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8.01（美國San Diego）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，結(jié)果用表示。使用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，美國）進(jìn)行Western blotting 分析。

2 結(jié)果

2.1 瓜蔞皮注射液主要活性成分的篩選

通過對瓜蔞皮注射液相關(guān)文獻(xiàn)報道[11-14]的梳理，共搜集瓜蔞皮注射液化學(xué)成分63 個，結(jié)合Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫，以GI absortion 為“High”和滿足類藥性五原則中的2 個或以上為篩選件，共篩選出包括芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、香草酸等21 個化學(xué)成分，見表1。

表1 瓜蔞皮注射液主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Gualoupi Injection

2.2 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

圖1 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.1 “Drug -ingredient -target” network

2.3 “瓜蔞皮注射液-動脈粥樣硬化”共有靶點預(yù)測和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的21 個瓜蔞皮注射液活性成分的潛在作用靶點與動脈粥樣硬化靶點繪制韋恩圖，見圖2。將上述共有蛋白輸入String 數(shù)據(jù)平臺，以獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，其中degree 值排名前5 位的潛在靶點包括Akt1、Caspase-3、前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（PTGS2）、SRC、表皮生長因子受體（EGFR），上述蛋白可能是瓜蔞皮注射液發(fā)揮治療動脈粥樣硬化作用的核心靶點。

圖2 “瓜蔞皮注射液-動脈粥樣硬化”共有靶點維恩圖Fig.2 Venn diagram of common targets of “Gualoupi Injection -atherosclerosis”

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI Network

2.4 GO 生物學(xué)功能分析和KEGG 通路富集分析

GO 富集分析共獲得702 條目，其中BP 545 個，CC 67 個，MF 90 個。根據(jù)P值＜0.05、FDR＜0.05的條目將前10 位作可視化處理，結(jié)果見圖4。主要涉及對細(xì)胞增殖的調(diào)控、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡的調(diào)控、細(xì)胞死亡的調(diào)控等BP 過程，CC包括神經(jīng)元投射、細(xì)胞表面、等離子體膜、軸突等，MF 包括肽酶的活動、鈣離子結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、鐵離子結(jié)合等。KEGG 通路富集分析共得到42 條信號通路（P＜0.05），選取排名前20 位的信號通路并作可視化分析，結(jié)果見圖5，提示白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、精氨酸生物合成、花生四烯酸代謝、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、核因子-κB（NF-κB）等通路與動脈粥樣硬化密切相關(guān)。

圖4 瓜蔞皮注射液治療動脈粥樣硬化的GO 分析Fig.4 GO analysis of Gualoupi Injection in treatment of atherosclerosis

圖5 瓜蔞皮注射液治療動脈粥樣硬化的KEGG 通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis of Gualoupi Injection in treatment of atherosclerosis

2.5 瓜蔞皮注射液對動脈粥樣硬化小鼠血脂水平的影響

與對照相比，模型組小鼠血清TC、TG、LDLC 顯著升高，HDL-C 顯著降低（P＜0.01）；與模型相比，瓜蔞皮注射液組小鼠血清TC、TG、LDL-C均顯著降低（P＜0.05、0.01），而對HLD-C 無顯著改變，見表2。

表2 瓜蔞皮注射液對動脈粥樣硬化小鼠血清TC、TG、LDI-C、HDL-C 的影響（，n =6）Table 2 Effects of Gualoupi Injection on serum TC,TG,LDI-C,and HDL-C of atherosclerosis mice (,n =6)

表2 瓜蔞皮注射液對動脈粥樣硬化小鼠血清TC、TG、LDI-C、HDL-C 的影響（，n =6）Table 2 Effects of Gualoupi Injection on serum TC,TG,LDI-C,and HDL-C of atherosclerosis mice (,n =6)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。**P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group.

2.6 瓜蔞皮注射液對動脈粥樣硬化小鼠主動脈的影響

HE 染色結(jié)果顯示，對照組小鼠主動脈內(nèi)膜光滑完整，無斑塊形成。模型組小鼠主動脈壁破損，可見較大斑塊附著于管壁上，斑塊內(nèi)見少量泡沫細(xì)胞。與模型組相比，瓜蔞皮注射液組小鼠主動脈壁較完整，部分可見少量斑塊和泡沫細(xì)胞附著于管壁上，見圖6。

圖6 瓜蔞皮注射液對動脈粥樣硬化小鼠主動脈的影響Fig.6 Effect of Gualoupi Injection on aorta in mice with atherosclerosis

2.7 瓜蔞皮注射液對核心蛋白的影響

與對照組比較，模型組p-SRC、p-Akt1 蛋白表達(dá)水平顯著升高，Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，瓜蔞皮注射液組p-SRC、p-Akt1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01、0.05），而SRC、Akt1 蛋白在各組中無顯著變化，見圖7。

圖7 瓜蔞皮注射液對動脈粥樣硬化小鼠主動脈核心蛋白的影響（，n =6）Fig.7 Effect of Gualoupi Injection on aortic core protein in atherosclerosis mice (,n =6)

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)并無動脈粥樣硬化記載，根據(jù)其臨床癥狀及病理表現(xiàn)，將其歸屬于“胸痹”“脈痹”“中風(fēng)”等范疇[15]。歷代醫(yī)家對動脈粥樣硬化的病因病機進(jìn)行了不同的闡述，《醫(yī)學(xué)正傳》記載：“津液稠黏，為痰為飲，積久滲入脈中，血為之濁”，提出痰飲相生而互結(jié)，留滯于脈中即可發(fā)展為動脈粥樣硬化[16]；《醫(yī)林改錯》記載：“元氣既虛，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”提出氣虛血瘀可發(fā)展為動脈粥樣硬化[17]；馮文偉等[18]根據(jù)課題組多年的臨床實踐經(jīng)驗，提出“脈絡(luò)積”學(xué)說，認(rèn)為氣滯、血瘀、痰濁等積聚內(nèi)生于脈是形成動脈粥樣硬化的核心病機；余鋒等[19]根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對動脈粥樣硬化的認(rèn)識及臨床實踐，認(rèn)為形成動脈粥樣硬化的病機是“氣陽虧虛，血瘀熱毒”?？梢姎馓?、痰飲、血瘀是形成動脈粥樣硬化的主要病機。而瓜蔞皮注射液作為化痰泄?jié)犷惖拇恚哂行袣獬凉M、開胸除痹之功，現(xiàn)代藥理研究亦表明瓜蔞皮注射液具有抗血小板聚集、抗自由基、活血化瘀等作用[20]，但是對動脈粥樣硬化的作用機制系統(tǒng)報道較少。

因瓜蔞皮注射液在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺上檢索不到相應(yīng)成分，實驗基于文獻(xiàn)報道結(jié)合胃腸道吸收度為“High”和滿足類藥性五原則中的2 項作為瓜蔞皮注射液活性成分的篩選，共篩選出包括芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、香草酸、亮氨酸、煙酸等21 個成分。Ashokkumar 等[21]發(fā)現(xiàn)香草酸可引起除血漿HDL 水平升高外的相當(dāng)大的脂質(zhì)譜降低，此外，還可以減少肝組織中膠原蛋白的積累。孫霽寒等[22]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以通過降低高脂血癥大鼠的TC、TG、LDL-C 水平，升高過氧化氫酶來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，減輕肝細(xì)胞脂肪在肝臟的沉積。李志樂等[23]研究發(fā)現(xiàn)煙酸可通過顯著提高主動脈B7-H3、B7-H4 蛋白表達(dá)，調(diào)控血脂TC、TG、LDL-C 和炎性因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、γ 干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平，從而發(fā)揮治療動脈粥樣硬化藥效。本實驗結(jié)果表明瓜蔞皮注射液可顯著降低動脈粥樣硬化小鼠血清TC、TG、LDL 水平，HE 染色顯示瓜蔞皮注射液還可減少斑塊和泡沫細(xì)胞主動脈管壁上的黏附，提示瓜蔞皮注射液可能是通過上述多個成分減少血脂在血管中蓄積進(jìn)而發(fā)揮治療動脈粥樣硬化作用。

PPI、GO、KEGG 結(jié)果顯示，瓜蔞皮注射液通過調(diào)節(jié)Akt1、Caspase-3、SRC 等在內(nèi)的多個活性靶點，從細(xì)胞表面、等離子體膜、軸突等層面影響肽酶的活動、鈣離子結(jié)合、絲氨酸水解酶活性進(jìn)而干預(yù)對細(xì)胞增殖的調(diào)控、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡的調(diào)控等過程，最終通過調(diào)控IL-17 信號通路、花生四烯酸代謝、NF-κB 等多個通路發(fā)揮治療動脈粥樣硬化。有研究顯示，Akt1 基因的缺失會導(dǎo)致小鼠體生長遲緩，伴隨著多個器官的縮小，限制性細(xì)胞類型的細(xì)胞凋亡水平升高[24-25]，同時還表現(xiàn)出胚胎外血管模式受損和胎盤萎縮，以及圍產(chǎn)期高胎兒死亡率[26]。此外，Akt1 可通過參與調(diào)節(jié)一氧化氮合成酶和一氧化氮的生成，對動脈粥樣硬化斑塊具有保護(hù)作用[27]。近年來隨著人們的深入研究，發(fā)現(xiàn)Caspase-3 可通過介導(dǎo)細(xì)胞焦亡引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[28]。而Caspase-3 作為細(xì)胞凋亡的終末蛋白，其升高與動脈粥樣硬化、心肌病、心肌缺血等密切相關(guān)[29]。在3 221 名受試者研究中，發(fā)現(xiàn)Caspase 3 與冠狀動脈鈣化、主動脈壁厚度、主動脈順應(yīng)性獨立相關(guān)，提示Caspase-3 與動脈粥樣硬化之間存在聯(lián)系[30]。SRC 是人類發(fā)現(xiàn)較早的一類由多種胞外信號分子激活的非跨膜型蛋白，包括9 種結(jié)構(gòu)相似的家族成員，有研究發(fā)現(xiàn)SRC 參與了細(xì)胞中多種活動，如細(xì)胞增殖、遷移、脂質(zhì)代謝等[31]。Ba 等[32]發(fā)現(xiàn)紅景天苷可通過增強SRC的活性和Caveolin-1的自噬降解來抑制LDL胞吞作用從而預(yù)防動脈粥樣硬化。Western blotting研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組p-SRC、p-Akt1蛋白表達(dá)水平顯著升高，Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；瓜蔞皮注射液可逆轉(zhuǎn)上述蛋白的表達(dá)（P＜0.01、0.05），而對SRC、Akt1 蛋白表達(dá)無顯著影響，說明瓜蔞皮注射液發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用機制可能與調(diào)控 p-SRC、p-Akt1、Caspase-3 的蛋白表達(dá)有關(guān)，同時也間接證實網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選核心蛋白的合理性。

綜上，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合動物實驗探討瓜蔞皮注射液治療動脈粥樣硬化的作用機制，發(fā)現(xiàn)瓜蔞皮注射液可能通過芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、香草酸等多個成分調(diào)控Caspase-3、p-SRC、p-Akt1 等靶標(biāo)蛋白，降低TC、TG、LDL 血脂水平，減少斑塊在主動脈附著，進(jìn)而發(fā)揮治療動脈粥樣硬化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突