地菍總黃酮抗2 型糖尿病作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究及實驗驗證

莫燁云，朱盼，唐雨菲，李笑笑，楊秋莉，李金燕，韋麗秋，李麗

廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 廣西高校中藥神經(jīng)-代謝及免疫藥理重點實驗室，廣西 南寧 530200

糖尿病是目前全球最突出的慢性疾病之一，其病因與遺傳、環(huán)境、年齡等多種因素有關(guān)[1]。相關(guān)研究表明，中藥能顯著改善糖尿病患者的血糖和臨床指標(biāo)，有效延緩糖尿病的進(jìn)展[2]。地菍為野牡丹科植物地菍Melastoma dodecandrumLour.的全草，廣西民族民間主要用來治療“消渴”“虛勞”“腸炎”等病證，是瑤醫(yī)藥的常用藥材之一[3]。在本課題組的前期研究中，地菍不同部位提取物對胰島素抵抗、鏈脲佐菌素（STZ）所致高血糖大鼠和小鼠模型均有不同程度的降血糖和調(diào)脂作用，其中地菍總黃酮不僅能降低2 型糖尿病大鼠的血糖，改善血脂及氧化應(yīng)激紊亂，緩解糖尿病病程發(fā)展引起的肝腎功能損傷及胰腺病理損傷，且其代謝組學(xué)研究結(jié)果表明地菍總黃酮發(fā)揮抗糖尿病藥理活性的主要作用途徑可能是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路，甘油磷脂代謝通路，花生四烯酸代謝通路，?；撬岷团；撬岬拇x通路，膽汁酸的生物合成通路及煙酸和煙酰胺代謝通路[4-17]。但地菍總黃酮治療2 型糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點仍不清楚。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對地菍總黃酮的化學(xué)成分及其治療2 型糖尿病的相關(guān)靶基因和代謝通路進(jìn)行較全面系統(tǒng)地分析，探討地菍總黃酮治療2 型糖尿病的作用機(jī)制；再結(jié)合動物實驗以高脂飲食誘導(dǎo)和ip STZ 構(gòu)建2 型糖尿病模型大鼠，記錄大鼠體質(zhì)量、飲水量和攝食量，檢測血糖及血脂的相關(guān)指標(biāo)，qPCR 法檢測地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠肝組織中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）作用靶點的調(diào)控作用，蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測大鼠肝臟中Akt、AMPK、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C（SREBP-1C）的蛋白表達(dá)量，為后續(xù)的機(jī)制研究提供一定的理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，180～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004；室內(nèi)環(huán)境溫度：21～25 ℃，相對濕度：50%～70%，在光照周期12 h/12 h 環(huán)境中分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)。動物實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)，批號DW20230528-103。

1.2 材料與試劑

地菍購于南寧小瑤王藥店，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室梁子寧教授鑒定為地菍Melastoma dodecandrumLour.的干燥全草。

鏈脲佐菌素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥75%，美國Sigma 公司，批號20200320）；鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格 0.85 g/片，批號ABQ2906）；總RNA 提取試劑盒（上海Promega Corporation 公司；批號LS1040）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾科技公司，批號K1622）；無水乙醇（廣州化學(xué)試劑廠）；引物（上海捷瑞股份有限公司）；MaximaTMSYBRGreen/ROXqPCRMasterMix（賽默飛世爾科技公司，K0221）；Akt 兔抗（Cell Signaling Technology，貨號#4685）；AMPK兔抗（Cell Signaling Technology，貨號#2603）；SREBP-1C 兔抗[亞飛（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號AF6283]；GAPDH鼠抗（上?？党煽萍及l(fā)展有限公司，貨號KC-5G4）；PVDF 膜（美國密理博，貨號IPVH00010）；Marker（賽默飛世爾科技公司，貨號PM2510）；蛋白定量分析試劑盒（上海博彩醫(yī)療器械有限公司，貨號K3000）；HRP 羊抗鼠（武漢博士德生物工程有限公司，貨號BA1050）；HRP 羊抗兔（武漢博士德生物工程有限公司，貨號BA1054）[2]。

1.3 主要儀器

勻漿機(jī)（Fastprep-24 MP）；LX-100 離心機(jī)（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；YXQ-LS-30S立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SKG-01 電熱恒溫干燥箱（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）；LightCycler96 PCR 儀（Roche 公司）；TS-1 搖床（金壇市富華儀器廠）；JS-680A 自動凝膠圖像分析儀（上海培清科技有限公司）；TGL-16 臺式高速冷凍離心機(jī)（Cence）；VE-186 電泳槽（上海天能科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.1.1 地菍總黃酮化學(xué)成分的收集與篩選 利用文獻(xiàn)報道[3,18-19]檢索收集地菍黃酮類的化學(xué)成分，在Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetpre diction.ch/）平臺，根據(jù)化合物的吸收、分布、代謝、排泄（ADME）特性進(jìn)行篩選[3]。

2.1.2 活性成分作用靶點的篩選 利用 Swiss Target Prediction 平臺，預(yù)測活性成分的潛在靶點（Probability＞0），即得藥物作用靶點基因。

2.1.3 疾病靶點的收集 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（https://TTD.org/）中輸入關(guān)鍵詞“type 2 diabetes mellitus”進(jìn)行檢索，得到2 型糖尿病相關(guān)靶基因。對從GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得的靶點按中位數(shù)進(jìn)行篩選，3個數(shù)據(jù)庫去除重復(fù)基因，即可得到與2 型糖尿病相關(guān)的靶基因。

2.1.4 “成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在Venn 2.1 在線軟件作圖工具平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）上分別錄入地菍黃酮類成分靶點與2 型糖尿病相關(guān)的作用靶點，得到藥物與疾病的共同靶點。由Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建活性“成分-疾病-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.5 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 將作用靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），選擇multiple proteins，限定物種為homo sapines，置信度＞0.4，構(gòu)建PPI 關(guān)系圖，并根據(jù)蛋白之間的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排序。

2.1.6 基因功能和通路富集分析 在R 3.6.1 軟件安裝Bioconductor 軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將藥物-疾病共同靶點轉(zhuǎn)換成entrezID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據(jù)已轉(zhuǎn)換的entrezID，以P＜0.05，Q＜0.05 進(jìn)行關(guān)鍵靶基因基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析，將結(jié)果以條形圖形式輸出。

2.2 動物實驗驗證

2.2.1 地菍總黃酮的提取與制備 地菍全草粉碎后稱取適量粉末，按照藥材質(zhì)量與溶劑體積為1∶30 加入50%乙醇溶液浸泡過夜，使用真空抽濾泵對藥液進(jìn)行抽濾并收集抽濾液。使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對抽濾液進(jìn)行減壓濃縮并收集濃縮液。使用AB-8大孔樹脂對濃縮液進(jìn)行純化，上樣后依次用純化水和70%乙醇進(jìn)行洗脫，并收集70%乙醇洗脫液。將洗脫液置于55 ℃恒溫水浴鍋上干燥，得到棕黃色地菍總黃酮粉末。經(jīng)測定地菍總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73.9%，RSD 為0.83%。對地菍總黃酮的最大給藥量進(jìn)行安全性測定，結(jié)果顯示地菍總黃酮ig 的日最大給藥量為11.2 mg/g。動物給藥前將地菍總黃酮粉末放入研缽中仔細(xì)研磨，稱取適量藥粉加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，配制不同濃度的地菍總黃酮混懸液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 2 型糖尿病大鼠模型建立、分組及給藥 將60 只SPF 級SD 雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)抽取8 只大鼠給予普通維持飼料作為對照組，其余大鼠均以高脂高糖飼料（普通飼料73.5%、蔗糖10%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇1%、膽酸鈉0.5%）連續(xù)喂養(yǎng)6 周，禁食不禁水12 h后，按照40 mg/kg 的劑量ip STZ（臨用前使用pH 4.2 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成1%的溶液），1 周后尾靜脈采血，測定空腹血糖（FBG）≥11.1 mmol/L 即為造模成功[10-11]。

將2 型糖尿病模型造模成功的40 只大鼠隨機(jī)分成模型組、二甲雙胍組（0.2 g/kg）組、地菍總黃酮高劑量（0.34、0.45、0.60 g/kg）組，每組8 只，繼續(xù)提供高脂飼料喂養(yǎng)。各組每天ig 相應(yīng)藥物，1次/d，對照組和模型組ig 0.5% CMC-Na 溶液，連續(xù)給藥5 周。

2.2.3 樣本收集與處理 給藥5 周后，將大鼠用水合氯醛麻醉后腹主動脈取血，處死大鼠，在冰面上分離大鼠肝臟，經(jīng)冰生理鹽水洗凈后擦干稱質(zhì)量，-80 ℃冷凍保存[13]。

2.2.4 大鼠體質(zhì)量、飲水量及攝食量 記錄各組大鼠給藥前后的飲水量、攝食量變化。每周將各組大鼠禁食不禁水10 h 后檢測和記錄其空腹體質(zhì)量值。

2.2.5 糖代謝指標(biāo)FBG 檢測 在給藥前、給藥第7、14、21、28、35 天，將所有大鼠禁食不禁水12 h 后經(jīng)尾靜脈采血，使用羅式血糖儀測定大鼠FBG。

2.2.6 脂代謝指標(biāo)檢測 按照試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）。

2.2.7 qPCR 法檢測大鼠肝臟組織PI3K、Akt、AMPKmRNA 水平 用總RNA 提取試劑盒提取大鼠肝臟總RNA，并測定濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于PCR 反應(yīng)。根據(jù)GenBank 中大鼠PI3K、Akt1、AMPK、β-actin基因的mRNA 序列，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，引物序列見表1，由上海捷瑞股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系10 μL：SYBR Green Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)至10 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共40 個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3 次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.2.8 Western blotting 法檢測大鼠肝臟組織Akt、AMPK、SREBP-1C 蛋白表達(dá)水平 制備肝組織勻漿，裂解后提取肝組織總蛋白，采用BCA 試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。取適量的蛋白樣本變性后進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；將PVDF 膜封于5%脫脂奶粉孵育2 h，封閉完成后加入按倍數(shù)稀釋好的Akt、AMPK、SREBP-1C 一抗4 ℃孵育過夜；孵育過夜后的PVDF 膜洗滌后，加入山羊抗兔二抗孵育繼續(xù)90 min；孵育完成的PVDF 膜洗滌后，按照ECL 發(fā)光試劑盒說明書操作，使用凝膠系統(tǒng)進(jìn)行觀察并采集圖像，并用JS-680A 自動凝膠成像分析儀器中SensiAnsys 軟件進(jìn)行目的條帶的灰度值分析。

2.2.9 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以表示，采用ANOVA 分析多組間比較，采用t檢驗分析組間比較，熒光定量PCR結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.1 黃酮類活性成分及其作用靶點

從文獻(xiàn)檢索出地菍黃酮類化學(xué)成分并通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行ADME 篩選，最終篩選出活性成分 12 個，利用 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測得到776 個基因靶點，刪除重復(fù)項后得到213 個藥物潛在靶點。其中4 個成分未預(yù)測到靶點，其余8 個活性成分見表2。

表2 地菍黃酮類活性成分基本信息Table 2 Basic information on the active ingredients of flavonoids in M. dodecandrum

3.2 疾病靶點的收集

基于GeneCards、DrugBank、TTD 平臺篩選、去重后，分別獲得1 151、116、81 個靶點，合并3個數(shù)據(jù)庫的靶點，刪除重復(fù)項后共得到1 274 個疾病潛在靶點。

3.3 “成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析

使用Cytoscape 軟件構(gòu)建“成分-疾病-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1 所示，其中長方形表示藥物，三角形表示8 個黃酮類成分，橢圓形表示這些活性成分對應(yīng)的抗2 型糖尿病作用相關(guān)靶點，菱形表示疾病，邊代表活性成分與抗2 型糖尿病靶點的相互作用。

圖1 “成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.1 “Active ingredient -target -disease” network

3.4 靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

在String 數(shù)據(jù)庫中錄入上述98 個共同靶點，分析得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，如圖2 所示，節(jié)點表示靶點，每條邊代表蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多代表關(guān)聯(lián)度越大。

圖2 地菍黃酮類靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of target of M. dodecandrum flavonoids

PPI 網(wǎng)絡(luò)中，共有98 個節(jié)點，981 條邊，平均節(jié)點度為20，平均局部聚類系數(shù)為0.54。排名前30位的靶點對應(yīng)的邊數(shù)如圖3 所示，可見蛋白激酶B1（Akt1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、絡(luò)氨酸激酶（SRC）、環(huán)狀素受體1（ESR1）、磷酸肌醇3 激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）等靶點位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

圖3 靶點對應(yīng)的邊數(shù)Fig.3 Number of edges corresponding to the target

3.5 GO 注釋分析和KEGG 富集分析

將98 個共同靶點經(jīng)R 語言運行后，GO 分析選取生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3 部分，得到交集基因集合共富集至1 712 條生物學(xué)過程、53 條細(xì)胞組分、121 個與分子功能相關(guān)的過程。分別選取前20 條結(jié)果形成GO 功能富集的條形圖，如圖4所示，P代表富集的顯著性，顏色越深則顯著性越高。交集基因主要參與抗氧化反應(yīng)（response to oxidative stress）、蛋白激酶B 信號傳導(dǎo)（protein kinase B signaling）、脂酰肌醇 3-激酶信號（phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to oxidative stress）等生物學(xué)過程；主要涉及磷脂酰肌醇3-kinase 復(fù)合物（phosphatidylinositol 3-kinase complex）、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)（transferase complex，transferring phosphorus-containing groups）、膜筏（membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain）、膜區(qū)域（membrane region 等細(xì)胞組分表達(dá)過程；主要富集蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）等分子功能。

KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，交集基因富集在126 條通路上，主要涉及磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信號通路（PI3K/Akt signaling pathway）、缺氧誘導(dǎo)因子信號通路（HIF-1 signaling pathway）、晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子信號通路（JAK-STAT signaling pathway）、腺苷酸活化蛋白激酶信號通路（AMPK signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等。選取前20 條目形成KEGG 功能富集的條形圖，見圖4。

4 實驗驗證結(jié)果

4.1 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠體質(zhì)量、飲水量及攝食量的影響

如表3、圖5 所示，在給藥35 d 后，與對照組相比，模型組大鼠的飲水量及攝食量顯著上升，體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，地菍總黃酮0.34、0.60 g/kg 組和二甲雙胍組大鼠空腹體質(zhì)量顯著上升（P＜0.05）。與模型組相比，地菍總黃酮各劑量組和二甲雙胍組大鼠的飲水量、攝食量均呈減少趨勢但不顯著。

圖5 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響（，n =8）Fig.5 Effect of M. dodecandrum flavonoids on body weight of type 2 diabetic rats (,n =8)

表3 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠體質(zhì)量、飲水量、攝食量的影響（，n =8）Table 3 Effects of M. dodecandrum flavonoids on body weight,water intake,and food intake in type 2 diabetic rats (,n =8)

表3 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠體質(zhì)量、飲水量、攝食量的影響（，n =8）Table 3 Effects of M. dodecandrum flavonoids on body weight,water intake,and food intake in type 2 diabetic rats (,n =8)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05。**P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group.

4.2 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響

如表4 所示，在給藥期間，與對照組相比，模型組大鼠FBG 顯著升高（P＜0.01），并持續(xù)處在高血糖狀態(tài)；與模型組相比，各給藥組大鼠也一直處于高血糖狀態(tài)，但FBG 呈現(xiàn)逐漸下降趨勢；在給藥第28、35 天時，除地菍總黃酮0.45 g/kg 組，各給藥組大鼠FBG 均顯著下降（P＜0.05、0.01）。

表4 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響（，n =8）Table 4 Effect of M. dodecandrum flavonoids on fasting blood glucose in type 2 diabetes rats (,n =8)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。**P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group.

4.3 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠血脂的影響

如表5 所示，與模型組相比，各給藥組大鼠血清中TG、TC、LDL-C 水平均下降（P＜0.05、0.01），地菍總黃酮0.45 g/kg 組及二甲雙胍組HDL-C 水平顯著上升（P＜0.05）。

表5 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠血脂的影響（，n =8）Table 5 Effect of M. dodecandrum flavonoids on blood lipids in type 2 diabetes rats (,n =8)

表5 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠血脂的影響（，n =8）Table 5 Effect of M. dodecandrum flavonoids on blood lipids in type 2 diabetes rats (,n =8)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。**P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group.

4.4 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠肝臟PI3K、Akt、AMPK mRNA 表達(dá)的影響

如圖6 所示，與模型組相比，各給藥組大鼠肝臟中Akt、AMPKmRNA 相對表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05、0.01），地菍總黃酮0.60 g/kg 組和二甲雙胍組大鼠肝臟PI3KmRNA 相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。

圖6 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠肝臟基因PI3K、Akt、AMPK mRNA 相對表達(dá)量的影響（，n =3）Fig.6 Effects of M. dodecandrum flavonoids on the relative mRNA expression of PI3K,Akt,and AMPK in liver of type 2 diabetes rats (,n =3)

4.5 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠肝臟Akt、AMPK、SREBP-1C 蛋白表達(dá)的影響

如圖7、表6 所示，與模型組大鼠相比，地菍總黃酮各劑量組大鼠Akt 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01）；地菍總黃酮0.45、0.60 g/kg組和二甲雙胍組大鼠的肝臟AMPK 蛋白表達(dá)水平均顯著增高（P＜0.01），而地菍總黃酮0.34、0.45 g/kg 組大鼠肝臟中SREBP-1C 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。

圖7 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠肝臟Akt、AMPK、SREBP-1C 蛋白表達(dá)量的影響（，n =3）Fig.7 Effect of M. dodecandrum flavonoids on protein expression of Akt,AMPK,SREBP-1C in liver of type 2 diabetes rats (,n =3)

表6 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠肝臟Akt、AMPK、SREBP-1C 蛋白表達(dá)的影響（，n =3）Table 6 Effect of M. dodecandrum flavonoids on protein expression of Akt,AMPK,and SREBP-1C in liver of type 2 diabetes rats (,n =3)

表6 地菍總黃酮對2 型糖尿病大鼠肝臟Akt、AMPK、SREBP-1C 蛋白表達(dá)的影響（，n =3）Table 6 Effect of M. dodecandrum flavonoids on protein expression of Akt,AMPK,and SREBP-1C in liver of type 2 diabetes rats (,n =3)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group.

3 討論

糖尿病是一種多基因疾病，隨著時間的推移，單靶向藥物的有效性下降，大多數(shù)患者需要增加劑量以維持治療效果，通常與多種不良反應(yīng)有關(guān)[20]，因此“一個靶點，一種藥物”可能不適用于2 型糖尿病等多基因疾病。多項研究對植物性藥物治療糖尿病進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)民間藥物含有多種具有抗糖尿病活性的活性成分，如黃酮類、三萜類、生物堿和皂甙[21-22]?；谒幱弥参锏奶烊怀煞挚梢葬槍Χ喾N蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)多種途徑，從而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。中草藥具有多成分、多靶點、多途徑的鮮明特點，可能對糖尿病患者長期血糖的調(diào)控發(fā)揮重要作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”的互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出了地菍黃酮類成分抗2 型糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是槲皮素、蘆丁、山柰酚、芹菜素、柚皮素、香葉木素等，相關(guān)研究表明槲皮素能有效降低糖尿病大鼠血糖和膽固醇的水平以及調(diào)節(jié)血脂紊亂[23]。芹菜素能夠降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖、血脂水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、降低自由基損傷、改善肝功能[24]。柚皮素具有抑制α-葡萄糖苷酶活性和晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）生成的能力，前者能催化水解低聚糖生成葡萄糖，上升餐后血糖，后者過度積累會導(dǎo)致糖尿病并發(fā)證的發(fā)生發(fā)展[25]。因此推測地菍總黃酮中抗2 型糖尿病的主要活性成分可能為槲皮素、芹菜素、柚皮素等。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)地菍總黃酮通過多靶點發(fā)揮抗2 型糖尿病的作用，關(guān)鍵靶點可能是Akt1、VEGFA、EGFR、MAPK1、SRC、ESR1、PIK3R1，Akt 屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、存活和增殖的多功能蛋白，表達(dá)于多種組織中，在2 型糖尿病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[26]。Akt 有3 個亞型，即Akt1、Akt2、Akt3，而Akt1 在體內(nèi)組織中廣泛表達(dá)[27]，許多研究證實Akt1 多態(tài)性可能與2 型糖尿病的發(fā)生有關(guān)[26]。PI3K 是Akt 信號通路中的關(guān)鍵蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長、分化、葡萄糖運輸和利用[28]。PIK3R1 基因編碼PI3K 蛋白的調(diào)節(jié)亞基，可與p110 催化亞基形成PI3K 蛋白[29]。PIK3R1 在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[28]，其多態(tài)性與2 型糖尿病易感性有關(guān)[30]，沉默PIK3R1 可減輕小鼠的胰島素抵抗[31]。因此Akt1、PIK3R1 極有可能成為有價值的2 型糖尿病治療靶點，為2 型糖尿病的治療提供新的方向。

對靶點進(jìn)行KEGG 分析表明影響的相關(guān)通路可能為PI3K/Akt、AMPK 信號通路，胰島素信號通路是涉及蛋白質(zhì)、糖類、脂代謝和生長調(diào)控的多條信號通路，其中PI3K/Akt 信號通路是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要節(jié)點，可調(diào)節(jié)血糖攝取、細(xì)胞代謝、細(xì)胞存活、增殖、遷移和糖原合成[32-33]。AMPK 通路與PI3K/Akt 通路作為一種中樞能量調(diào)節(jié)器，在體內(nèi)調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝中起著重要作用[34]。有研究表明AMPK 激活能調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號通路，改善肝臟、骨骼肌、脂肪組織糖脂代謝[34]。PI3K/Akt途徑也介導(dǎo)脂質(zhì)合成，SREBP-1C 在肝臟中的過度表達(dá)選擇性地誘導(dǎo)脂質(zhì)合成基因的表達(dá)。據(jù)報道，Akt 可調(diào)節(jié)mTORC1-S6K1 途徑，以調(diào)節(jié)肝臟中SREBP-1C 的表達(dá)[35]。AMPK 也可以通過調(diào)節(jié)SREBP-1C 的表達(dá)來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，激活脂肪酸、三酰甘油和膽固醇合成相關(guān)的基因[36]。本研究動物實驗中地菍總黃酮能顯著上調(diào)2 型糖尿病大鼠肝臟PI3K、Akt、AMPKmRNA 表達(dá)，表明地菍總黃酮可能緩解PI3K/Akt、AMPK 胰島素信號通路的損傷；Western blotting 實驗結(jié)果顯示，Akt、AMPK 蛋白表達(dá)量有降低但差異不具顯著性，原因可能是mRNA翻譯成蛋白的生物學(xué)過程具備太多可能性，且它們是通過調(diào)控下游產(chǎn)生聯(lián)級效應(yīng)，放大通路末游的蛋白SREBP-1C 進(jìn)而產(chǎn)生調(diào)控作用，因此SREBP-1C的蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明地菍總黃酮在一定程度上可能通過影響PI3K/Akt/SREBP-1C、AMPK/SREBP-1C 通路抑制2 型糖尿病大鼠的脂質(zhì)積累。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并結(jié)合動物實驗，對地菍黃酮類成分與2 型糖尿病之間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行研究，篩選出了地菍黃酮類成分抗2 型糖尿病的可能物質(zhì)基礎(chǔ)和作用靶點及其抗糖尿病的作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突