基于HGF/c-Met 通路探究矢車菊素-3-O-葡萄糖苷改善高糖高脂誘導(dǎo)胰島β 細胞損傷的機制

馬存花，高靜

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830000

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、生活方式的改變和人口老齡化，糖尿病的患病率不斷上升，現(xiàn)已成為全球大多數(shù)國家亟待解決的健康問題。近年來，我國2型糖尿病患病率迅速上升，現(xiàn)已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題[1]。此外，越來越多的糖尿病患者出現(xiàn)嚴重并發(fā)證，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病等，無疑給患者和社會帶來了沉重負擔(dān)[2-4]。胰島β 細胞的胰島素分泌水平是維持機體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，當遺傳因素和環(huán)境因素損害胰島β 細胞導(dǎo)致胰島素分泌遭到破壞時，便會引發(fā)代謝性疾病糖尿病的發(fā)生[5]。因此，保護胰島β 細胞免受損傷以維持其正常功能是防治糖尿病的有效手段。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是類黃酮家族中最豐富的花青素之一，廣泛分布于紫色、紅色蔬菜和水果中，具有抗癌、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用[6-7]。目前，已在人類和實驗動物中證實花青素可以降低胰島素抵抗，促進對葡萄糖的吸收和利用，在預(yù)防和治療2 型糖尿病中起著重要作用[8]。還有研究報道指出，在胰島淀粉樣蛋白、β-淀粉樣蛋白 1-42（Aβ1-42）、雷帕霉素刺激下，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能夠發(fā)揮抗氧化和抗炎癥作用從而提高胰島β 細胞活力，維持其正常功能[9]。

肝細胞生長因子（HGF）是一種含肽的多功能細胞因子，能調(diào)節(jié)細胞增殖、存活、分化、形態(tài)以及受損器官的組織再生，通過與其特異性受體間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（c-Met）結(jié)合，將信號傳遞到細胞中并觸發(fā)c-Met 的內(nèi)在激酶活性，發(fā)揮相關(guān)作用。以往研究表明，HGF/c-Met 信號傳導(dǎo)對于胰島β 細胞的增殖至關(guān)重要，激活該途徑可以增強胰島β 細胞的再生能力[10]?；诖?，本研究采用葡萄糖與棕櫚酸模擬高糖高脂環(huán)境誘導(dǎo)胰島β 細胞損傷，觀察矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對葡萄糖＋棕櫚酸鈉（HGHF）誘導(dǎo)的胰島β 細胞損傷的影響并探究可能的作用機制，為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷防治糖尿病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

INS-1 胰島β 細胞（中國科學(xué)院細胞庫，批號SCSP-5061），矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（質(zhì)量分數(shù)≥98%，北京康瑞納生物科技有限公司，批號LB1573），c-Met 抑制劑SU11274（北京百奧萊博科技有限公司，批號M01028），胎牛血清（南京森貝伽生物公司，批號BC-SE-FBS01），RPMI-1640 培養(yǎng)液（美國ScienCell 公司，批號09511），胰蛋白酶（美國Hyclone 公司，批號SH30042），葡萄糖與棕櫚酸（美國Sigma 公司，批號G8270、P5585），CCK-8 試劑盒（上海優(yōu)利科生命科學(xué)有限公司，批號Y1026S），DCFH-DA 活性氧（ROS）熒光探針（西安百螢生物科技有限公司，批號BY15204），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測試盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-ELH6188、E-EL-K027），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）胰島素檢測試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司，批號YM-PF0588），蛋白裂解液（上海雅吉生物科技有限公司，批號3222），二辛可寧酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號PA115-01），聚偏二氟乙烯膜（PVDF）和ECL 化學(xué)發(fā)光液（上海碧云天生物研究所，批號FFP39、P0018M），HGF、磷酸化的間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子受體（p-c-Met）、c-Met、β-肌動蛋白（β-actin）抗體及辣根過氧化物酶標記的IgG 抗體（英國Abcam 公司，批號分別為 ab178395、ab278552、ab68141、ab179467、ab205718）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島β 細胞，將培養(yǎng)體系放于37 ℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)，每隔1 d換液1 次，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞活力 將胰島β 細胞按照每孔5×103個的密度接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2恒溫箱過夜培養(yǎng)至貼壁后，換用含10、20、30、40、50 μmol/L 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的培養(yǎng)液處理24 h，對照組為不含矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)的胰島β 細胞，CCK-8 法檢測不同處理下的細胞活力，多功能酶標儀測定490 nm 處每孔的吸光度（A），分別計算各處理組的細胞活力。

1.2.3 實驗分組與處理 將胰島β 細胞以每孔2×105個的密度接種于6 孔板中，分為4 組進行實驗，具體分組與處理如下：對照組使用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島β 細胞24 h；模型組參考文獻報道[11]，使用含25 mmol/L 葡萄糖與0.5 mmol/L 棕櫚酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島β 細胞24 h，誘導(dǎo)細胞損傷；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10、50 μmol/L 組在模型組基礎(chǔ)上分別使用含10、50 μmol/L 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島β 細胞24 h。處理結(jié)束后收集細胞，CCK-8 法檢測各處理組細胞活力。

1.2.4 ELISA 法測定胰島素分泌量 為通過檢測胰島素分泌量變化來判斷胰島β 細胞功能是否正常，將分組處理后的胰島β 細胞收集至離心管，1 000 r/min 離心20 min，棄上清，PBS 洗滌，分別添加含2.8、16.7 mmol/L 葡萄糖的KRBH 緩沖液（無BSA，無糖），在37 ℃、5% CO2恒溫箱孵育1 h，離心后收集上清，采用ELISA 法測定上清液中胰島素分泌量，嚴格按照說明書操作。

1.2.5 DCFH-DA 熒光探針法檢測細胞內(nèi)的ROS 水平 將胰島β 細胞按照每孔1×105個的密度植入6孔板中，按分組進行對應(yīng)處理后，去除上清，在細胞孔中添加含1 μmol/L DCFH-DA 熒光探針的培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)避光孵育30 min，結(jié)束后，PBS 洗滌細胞，采集熒光圖像，使用Image J 軟件分析各組的熒光強度，以熒光強度表示細胞內(nèi)ROS 水平。

1.2.6 SOD 活性和MDA 含量檢測 胰島β 細胞分組處理后，4 000 r/min 離心10 min，棄上清，在沉淀中加入蛋白裂解液提取總蛋白，采用比色法檢測SOD 活性與MDA 含量，嚴格根據(jù)試劑盒說明書進行測定。

1.2.7 Western blotting 法檢測相關(guān)蛋白表達 在各處理組胰島β 細胞中加入適量蛋白裂解液，置于冰上充分裂解細胞，提取總蛋白，BCA 法對蛋白濃度進行定量。各樣本均取30 μg 蛋白上樣至凝膠孔，10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白，并電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，再將膜浸入脫脂奶粉中封閉2 h，TBST 洗膜，加入HGF、p-c-Met、c-Met 抗體（1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜，取膜復(fù)溫，TBST 洗膜，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。結(jié)束后，ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影，采集蛋白條帶，使用Image J 軟件分析條帶灰度值，選擇β-actin 作為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來統(tǒng)計目的蛋白相對表達量。

1.2.8 c-Met 抑制劑SU11274 干預(yù)細胞 將胰島β細胞分為對照組、模型組、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷組、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷＋SU11274 組進行實驗，按照每孔2×105個的密度接種于6 孔板中，進行對應(yīng)處理，具體如下：對照組使用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島β 細胞24 h；模型組使用含25 mmol/L 葡萄糖與0.5 mmol/L 棕櫚酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島β 細胞24 h；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷組使用含50 μmol/L矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島β 細胞24 h；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷＋SU11274 組使用含50 μmol/L 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島β 細胞，并加入5 μmol/L SU11274 共作用24 h。結(jié)束后，收集各組細胞，CCK-8 法檢測細胞活力，按1.2.4項下ELISA 法測定上清液中胰島素分泌量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行統(tǒng)計分析，制作統(tǒng)計圖。實驗結(jié)果用表示。多組數(shù)據(jù)差異比較和組間兩兩比較分別采用單因素方差分析與LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對胰島β 細胞活力的影響

結(jié)果顯示，相較于對照組，10、20、30、40、50 μmol/L 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷均顯著提高了胰島β 細胞活力（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度矢車菊素-3-O-葡萄糖苷處理下胰島β 細胞活力比較（，n =6）Fig.1 Comparison of islet β cell activity under different concentrations of cyanidin-3-O-glucoside (,n =6)

2.2 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對HGHF 誘導(dǎo)下的胰島β 細胞活力的影響

結(jié)果顯示，與模型組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10、50 μmol/L 組細胞活力顯著升高（P＜0.05），且矢車菊素-3-O-葡萄糖苷50 μmol/L 組細胞活力升高更為顯著（P＜0.05），見圖2。

圖2 各處理組胰島β 細胞活力比較（，n =6）Fig.2 Comparison of islet beta cell activity among treatment groups (,n =6)

2.3 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對HGHF 誘導(dǎo)下的胰島β 細胞胰島素分泌水平的影響

在2.8、16.7 mmol/L 葡萄糖刺激下，與對照組相比，模型組胰島素分泌水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10、50 μmol/L 組胰島素分泌水平均顯著增加（P＜0.05），且矢車菊素-3-O-葡萄糖苷50 μmol/L 組胰島素分泌水平升高更為顯著（P＜0.05），見表1。

表1 各組胰島β 細胞分泌胰島素水平比較（，n =6）Table 1 Comparison of insulin secreted by islet β cells among groups (,n =6)

表1 各組胰島β 細胞分泌胰島素水平比較（，n =6）Table 1 Comparison of insulin secreted by islet β cells among groups (,n =6)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10 μmol·L-1 組比較：&P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs cyanidin-3-O-glucoside 10 μmol·L-1 group.

2.4 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對HGHF 誘導(dǎo)下的胰島β 細胞氧化損傷的影響

與模型組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10、50 μmol/L 組細胞內(nèi)ROS 水平、MDA 含量顯著降低，SOD 活性顯著升高（P＜0.05）。與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10 μmol/L 組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷50 μmol/L 組細胞內(nèi)ROS 水平、MDA 含量顯著降低，SOD 活性也顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組胰島β 細胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較（，n =6）Table 2 Comparison of oxidative stress-related indexes in islet β cells of each group (,n =6)

表2 各組胰島β 細胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較（，n =6）Table 2 Comparison of oxidative stress-related indexes in islet β cells of each group (,n =6)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10 μmol·L-1 組比較：&P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs cyanidin-3-O-glucoside 10 μmol·L-1 group.

2.5 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對HGHF 誘導(dǎo)下的胰島β 細胞中HGF/c-Met 信號通路的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，與模型組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10、50 μmol/L 組細胞中HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷10 μmol/L 組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷50 μmol/L 組細胞中的HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白表達水平也要顯著升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組胰島β 細胞中HGF 和p-c-Met/c-Met 蛋白表達水平比較（，n =6）Fig.3 Comparison of HGF and p-c-Met/c-Met protein expression levels in islet β cells of different groups (,n =6)

2.6 c-Met 抑制劑SU11274 作用下對矢車菊素-3-O-葡萄糖苷改善HGHF 誘導(dǎo)下胰島β 細胞損傷效果的影響

結(jié)果顯示，與模型組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷組細胞活力顯著升高（P＜0.05）；與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷＋SU11274 組細胞活力顯著降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組胰島β 細胞活力比較（，n =6）Fig.4 Comparison of islet β cell activity among treatment groups (,n =6)

胰島β 細胞分泌胰島素水平結(jié)果顯示，經(jīng)過2.8、16.7 mmol/L 葡萄糖刺激下，與模型組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷組胰島素分泌水平均顯著增加（P＜0.05）；而與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷組比較，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷＋SU11274 組胰島素分泌水平顯著減少（P＜0.05），見表3。

表3 各組胰島β 細胞分泌胰島素水平比較（，n =6）Table 3 Comparison of insulin secreted by islet β cells among groups (,n =6)

表3 各組胰島β 細胞分泌胰島素水平比較（，n =6）Table 3 Comparison of insulin secreted by islet β cells among groups (,n =6)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷組比較：&P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs cyanidin-3-O-glucoside group.

3 討論

糖尿病作為一種慢性疾病，是全球十大死因之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對人類健康造成了嚴重威脅[12]。胰島β 細胞功能障礙和/或胰島β 細胞丟失引起的胰島素分泌不足是引發(fā)糖尿病的關(guān)鍵原因。胰島β 細胞功能障礙或死亡可能由多種代謝紊亂引發(fā)，如糖毒性、脂毒性、氧化反應(yīng)等[13-14]。研究表明，高糖高脂環(huán)境極易誘發(fā)胰島β 細胞死亡，引起血糖水平增高，形成惡性循環(huán)，促進了疾病進展[15]。因此，保護胰島β 細胞免受高糖高脂環(huán)境誘導(dǎo)的損傷是延緩糖尿病進程的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過在葡萄糖與棕櫚酸建立的高糖高脂環(huán)境中培養(yǎng)胰島β 細胞后，細胞活力顯著降低，通過2.8、16.7 mmol/L 葡萄糖刺激后，胰島β 細胞分泌胰島素的水平也顯著減少。由此說明，在葡萄糖與棕櫚酸誘導(dǎo)下胰島β 細胞發(fā)生了糖脂毒性損傷。

近年來，越來越多的研究揭示了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對人體健康的益處，如矢車菊素-3-O-葡萄糖苷通過抑制c-Jun 氨基末端激酶（JNK）通路阻斷腫瘤細胞及其微環(huán)境中的自噬水平，在體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤作用[16]；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能夠修復(fù)破損腸黏膜和調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道疾病與保持腸道穩(wěn)態(tài)，起到腸道保護作用[17]；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能夠減少心肌缺血再灌注損傷中心肌梗死面積，減輕組織病理改變，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，其可能是保護心肌免受缺血再灌注損傷的潛在藥物[18]。此外，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對糖尿病及其并發(fā)證產(chǎn)生積極作用。Ye 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能夠抑制高濃度高葡萄糖和棕櫚酸誘導(dǎo)胰島β 細胞的氧化損傷，并緩解糖尿病db/db 小鼠胰島氧化應(yīng)激；Bartel 等[20]研究表明，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷參與緩解炎癥、降低血糖以及與2 型糖尿病發(fā)展相關(guān)的基因表達，有助于預(yù)防與減輕2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展；Anfuso 等[21]研究指出矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能提高高濃度葡萄糖刺激下人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的活力，降低細胞內(nèi)ROS 水平，防治血液-視網(wǎng)膜屏障破壞，有效地保護視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞免受高葡萄糖損傷。本研究結(jié)果顯示，相較于單獨在高糖高脂環(huán)境下培養(yǎng)的胰島β 細胞，在高糖高脂環(huán)境中同時加入10、50 μmol/L 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷培養(yǎng)胰島β 細胞后，細胞活力顯著升高，2.8、16.7 mmol/L 葡萄糖刺激下的胰島素分泌水平也顯著增加，細胞內(nèi)ROS 水平、MDA 含量顯著降低且SOD 活性顯著升高。由此說明，在高糖高脂環(huán)境下，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能夠提高胰島β 細胞活力，改善其胰島素分泌功能，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

與其他生長因子及其受體不同，HGF 作為獨特的配體與c-Met 結(jié)合，誘導(dǎo)c-Met 的聚集和磷酸化，隨后導(dǎo)致適配器分子與其結(jié)合并介導(dǎo)下游信號的傳輸。HGF/c-Met 信號通路的生物學(xué)功能廣泛而多樣，對于肝臟損傷修復(fù)、肝纖維化、肝移植后再生具有重要的臨床意義[22]，激活該通路也能夠促進子宮內(nèi)膜損傷的修復(fù)作用[23]。先前已有研究表明，在高糖刺激下，缺失了c-Met 的胰島INS-1 細胞表現(xiàn)為胰島素分泌不足[24]，提示HGF/c-Met 信號通路對于維持正常的胰島分泌功能至關(guān)重要。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，在高糖高脂環(huán)境中培養(yǎng)的胰島β細胞中HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白水平顯著下調(diào)；而加入10、50 μmol/L 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷培養(yǎng)的胰島β 細胞中檢測到HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白水平顯著上調(diào)。因此推測，HGF/c-Met 信號通路可能參與胰島β 細胞的糖脂毒性損傷。為了進一步驗證該結(jié)論，在高糖高脂環(huán)境聯(lián)合矢車菊素-3-O-葡萄糖苷培養(yǎng)的體系中加入c-Met 抑制劑SU11274 處理胰島β 細胞后，檢測到細胞活力顯著下降，且胰島素分泌水平顯著減少。以上結(jié)果表明，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對HGHF 誘導(dǎo)的胰島β 細胞損傷的保護效應(yīng)與激活HGF/c-Met 通路有關(guān)。

綜上所述，本研究表明矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能夠提高高糖高脂誘導(dǎo)下的胰島β 細胞活力，改善胰島素分泌功能，抑制氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)，該作用與其激活HGF/c-Met 通路有關(guān)。本研究為糖尿病的治療提供新的切入點，并為探究矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的抗糖脂毒性作用提供實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突