荔枝殼多酚超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究

鄭亞男，蔡 旭，鄧艾平*

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430014； 2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，湖北 武漢 430065； 3.清華大學(xué)工程物理系，北京 100084）

荔枝來源于無患子科荔枝屬荔枝LitchichinensisSonn.的果實(shí)，其果肉、種子、果殼均具有較高的藥用、食用價值，為藥食兩用資源［1-2］。荔枝殼性味苦、寒，具有除濕止痢、止血的功效［3］。研究表明，荔枝殼含有豐富的多酚類、酚酸、多糖類等物質(zhì)［4］，具有抗氧化［5］、抗炎［6］、調(diào)節(jié)免疫［7］等作用。多酚類成分是荔枝殼的主要活性成分，被開發(fā)為奧力高樂、糕點(diǎn)、洗發(fā)水等功能食品、日用品。

雙水相體系由2 個互不相溶的體系組成，利用組分在雙水相體系內(nèi)的分配系數(shù)差異進(jìn)行高效的提取與純化［8］。雙水相提取條件溫和，可保留分子的生物活性，適用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸等大分子的提取分離，如聚乙二醇-檸檬酸鈉提取Bacillus subtilis D3d 木聚糖酶［9］、甲醇-麥芽糊精提取醋酸格拉替雷［10］、聚乙二醇-磷酸氫二鉀分離質(zhì)粒DNA［11］等。雙水相體系也常用于提取中藥多糖、活性小分子的研究，如湖北海棠多糖［12］、陳皮黃酮［13］、巴戟天游離蒽醌［14］等。相較于傳統(tǒng)的溶劑提取方法，雙水相提取效率高，活性成分含量高，避免了反復(fù)低效的提取和萃取操作［15］。本實(shí)驗(yàn)擬通過單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助雙水相提取荔枝殼多酚，獲得最佳提取工藝，并評價其體外抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用荔枝殼資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； TGL-16M 臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）； 多功能粉碎機(jī)（皇代電器有限公司）； KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 電子精密天平（萬分之一、十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）； FD-1D-50 真空冷凍干燥機(jī)（上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司）； Gen Pure 超純水系統(tǒng)（德國TKA 公司）。

1.2 試劑與藥物 硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水碳酸鈉（純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）； 沒食子酸、維生素C、水楊酸、硫酸亞鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（純度≥98%，美國Sigma-Aldrich 公司）； 福林酚試劑、胃蛋白酶（純度≥60%，上海源葉生物科技有限公司）； 正丙醇、丙酮，無水乙醇、鹽酸（分析純，北京市通廣精細(xì)化工公司）； H2O2（濟(jì)南嘉陽化工有限公司）； 磷酸緩沖鹽水溶液、Tris-Hcl 緩沖溶液、蒸餾水為自制。荔枝于2022 年2月購于武漢，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為正品，除去果肉及種子，得荔枝殼，經(jīng)清洗凍干、粉碎、過篩后備用，編號為LZK20220210，保存于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院藥學(xué)部。

2 方法

2.1 雙水相體系制備 稱取同質(zhì)量的硫酸銨或磷酸二氫鉀，置于錐形瓶中，按比例加水溶解，逐漸滴加有機(jī)試劑，獲得澄清透明的雙水相體系，見表1。

表1 不同組分雙水相體系組成

2.2 荔枝殼多酚提取 稱取荔枝殼粉末M1，置入錐形瓶中，加不同雙水相體系搖勻，超聲提取（功率300 W）。將液料比20 ∶1、超聲時間30 min、提取溫度40 ℃作為初始提取條件，70%乙醇作為對照組M7，提取完成后過濾，靜置分層，取上層溶液，凍干后獲得荔枝殼多酚提取物，稱重M2。精確稱取荔枝殼多酚提取物，置于量瓶中，加水超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成樣品溶液，記錄體系體積V。

2.3 線性關(guān)系、方法學(xué)考察

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取5.0 mg 沒食子酸對照品，置于量瓶中，加水超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，配制成1.0 mg／mL 原液，精密吸取適量，重復(fù)上述操作，配制成0.1～1.0 mg／mL，冷藏備用。

2.3.2 線性關(guān)系考察 沒食子酸對照品溶液分別取0.2 mL，置于24 孔板中，并滴加0.4 mL 福林酚試劑，搖勻，靜置反應(yīng)6 min，隨后加入1.2 mL 7% Na2CO3溶液，搖勻，避光，靜置反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后，測定溶液的吸光度，波長760 nm。以沒食子酸質(zhì)量濃度X、吸光度A分別為橫、縱坐標(biāo)，繪制方程A＝2.859 2X＋0.362 6 （R2＝0.992 8），在0.1 ～1.0 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取沒食子酸對照品溶液1 份，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法平行測定6 次，測得吸光度RSD 為1.52%，表明該方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液1 份，常溫放置0、2、4、6、8 h 后按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定，測得吸光度RSD 為1.47%，表明在8 h 內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品溶液6 份，按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定，測得吸光度RSD 為1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱取含量已知的樣品9 份各10 mg，分別加入不同劑量沒食子酸（0.5、0.75、1.0 mg），分為低、中、高劑量組，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法提取，測得總多酚加樣回收率、RSD 分別為101%、2.31%。

2.4 雙水相體系選擇 考察不同雙水相體系對荔枝殼多酚含量、得率的影響，并以荔枝殼多酚得率為主要指標(biāo)。

2.5 單因素試驗(yàn) 選擇ATPS1 作為提取溶劑，按“2.2”項(xiàng)下提取條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（10% ～50%）、硫酸銨質(zhì)量濃度（0.2 ～0.4 g／mL）、液料比（10 ∶1～30 ∶1）、超聲時間 （20 ～60 min）、提取溫度 （30 ～70 ℃）對荔枝殼多酚得率的影響。

2.6 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時間作為影響因素，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平見表3。

表3 因素水平

2.7 荔枝殼多酚含量測定 按“2.3.2” 項(xiàng)下方法測定樣品溶液吸光度，計(jì)算多酚質(zhì)量濃度C、荔枝殼多酚得率Y2、荔枝殼多酚含量，其中M1、M2、V分別為荔枝殼粉末質(zhì)量、荔枝殼多酚提取物質(zhì)量、樣品溶液體積。

2.8 抗氧化活性測定

2.8.1 DPPH 自由基清除作用 精密稱取“2.6” 項(xiàng)下荔枝殼多酚提取物（ATPS7 組）、荔枝殼多酚乙醇提取物（M7 組），制成樣品溶液（質(zhì)量濃度10～1 000 μg／mL），維生素C 作為陽性對照組。采用DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)［16］，測定雙水相體系提取的荔枝殼多酚抗氧化活性，取上述樣品溶液1.0 mL，分別與2.0 mL DPPH 溶液（0.1 μmol／mL）混勻，避光反應(yīng)30 min。將上述反應(yīng)后的混合溶液置于515 nm波長處測定吸光度As，計(jì)算DPPH 清除率I1其中Ab、Ac分別是DPPH 溶液、樣品溶液吸光度。

2.8.2 羥自由基清除作用 取“2.8.1” 項(xiàng)下樣品溶液，測定雙水相體系提取的荔枝殼多酚抗氧化活性； 取9.0 μmol／mL 水楊酸乙醇溶液、9.0 μmol／mL 硫酸亞鐵溶液、樣品溶液各1.0 mL，混勻后加入1.0 mL H2O2溶液反應(yīng)15 min。將上述反應(yīng)后的混合溶液置于510 nm 波長處測定吸光度As，計(jì)算羥自由基清除率其中Ab、Ac分別空白溶液、樣品溶液吸光度［16］。

2.9 體外模擬消化實(shí)驗(yàn) 采用體外模擬消化方法［17］，取“2.8” 項(xiàng)下10.0 μg／mL 樣品溶液1.0 mL，加入氯化鈉溶液（質(zhì)量濃度10.0 mg／mL）稀釋，滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5，隨后加入4.0 mL 胃液（0.4 g 胃蛋白酶溶于0.01 mol／L鹽酸溶液中），混勻，在37 ℃、120 r／min 下避光反應(yīng)2 h，12 000 r／min 離心15 min，取上清液，凍干，用于多酚含量、抗氧化活性測定。

3 結(jié)果

3.1 雙水相體系的選擇 雙水相體系通過有機(jī)體系和鹽對水分子的激烈競爭，形成雙水相。利用體系與溶質(zhì)的表面性質(zhì)、電荷、離子鍵等作用，破壞了溶劑效應(yīng)，使得活性成分可在兩相體系中進(jìn)行高效的溶出與分配，達(dá)到快速提取分離的效果［18-19］。因此，不同類型有機(jī)相和無機(jī)鹽組成的雙水相體系具有不同的物理化學(xué)特性，可選擇性提取，提高活性成分得率及其含量。如圖1 所示，不同類型ATPS對荔枝殼多酚的得率不同，其得率和含量均高于70%乙醇。乙醇-硫酸銨體系提取荔枝殼多酚得率最高為6.43%，多酚含量為88.1%； 70%乙醇提取荔枝殼多酚得率僅為4.31%，多酚含量為19.1%。荔枝殼多酚水溶性較強(qiáng)，丙酮對其提取能力有限。丙酮-磷酸二氫鉀體系荔枝殼多酚得率為4.72%，多酚含量為46.5%。因此，選擇乙醇-硫酸銨體系作為提取荔枝殼多酚的提取體系。

圖1 不同雙水相體系對荔枝殼多酚得率、含量的影響

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對荔枝殼多酚得率的影響 乙醇作為有機(jī)相，是乙醇-硫酸銨雙水相體系重要的組成部分。乙醇分子含有的親水基團(tuán)，可與水無限互溶。然而，乙醇分子與無機(jī)鹽離子間的排斥作用，可競爭性均衡鹽離子和水分子之間的靜電作用，促使體系分層［20］。因此，適當(dāng)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)是乙醇-硫酸銨雙水相體系形成分相的必要條件。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過低時，乙醇分子與鹽離子間的斥力無法平衡乙醇分子與水分子的親和力，電勢差較小，使得體系體系無法分相。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，上相脂溶性增加，極性減小，會降低對水溶性成分多酚的提取率［21］。如圖2 所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10% 時，體系無法分相；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加枝殼多酚得率呈先增加后迅速降低的趨勢，最高為7.2%，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對荔枝殼多酚得率的影響

3.2.2 硫酸銨質(zhì)量濃度對荔枝殼多酚得率的影響 硫酸銨易溶于水，主要以離子形式，存在于乙醇-硫酸銨雙水相體系的下相。硫酸根離子、銨離子與乙醇分子對水分子存在激烈競的關(guān)系，并與乙醇分子產(chǎn)生靜電作用，易使體系體系分層［20］。然而，當(dāng)鹽離子濃度過高時，無機(jī)鹽飽和析出，無法發(fā)揮促進(jìn)分相的作用，浪費(fèi)資源； 同時，高濃度鹽離子使得下相極性增加，使水溶性荔枝殼多酚更多的溶解于下相［22］。因此，合適的硫酸銨質(zhì)量濃度有利于乙醇-硫酸銨雙水相體系提取、富集荔枝殼多酚。如圖3 所示，隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加荔枝殼多酚得率呈先增加后略微降低的趨勢，最高為7.7%，故選擇硫酸銨質(zhì)量濃度為0.3 g／mL。

圖3 硫酸銨質(zhì)量濃度對荔枝殼多酚得率的影響

3.2.3 液料比對荔枝殼多酚得率的影響 植物細(xì)胞壁含有豐富的纖維素、木質(zhì)素、果膠等，具有較好的韌性和延展性。當(dāng)提取溶劑過少，原料偏多，組織細(xì)胞無法充分吸收體系產(chǎn)生溶脹、破裂，使活性成分溶出、得率降低。當(dāng)提取體系較多時，體系的提取能力未能充分挖掘，浪費(fèi)溶劑，又易促使多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)的溶出［23］。因此，溶劑的提取能力是有限的。通過優(yōu)化液料比提升中藥活性成分得率，是充分利用中藥資源的重要手段。如圖4 所示，隨著液料比增加荔枝殼多酚得率呈先快速增加后降低的趨勢，最高為7.2%，故選擇液料比為20 ∶1。

圖4 液料比對荔枝殼多酚得率的影響

3.2.4 超聲時間對荔枝殼多酚得率的影響 超聲是一項(xiàng)可破壞細(xì)胞壁的技術(shù)，將其與雙水相提取技術(shù)有機(jī)結(jié)合，有利于中藥成分的提取與富集，如陳皮黃酮［13］、橘紅花總黃酮［21］、吊石苣苔黃酮［23］。但是，花青素、沒食子酸、兒茶素作為荔枝殼多酚的活性成分，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，受熱易分解［24］。超聲時間過長會消耗大量的能量，促使荔枝殼多酚成分分解，降低多酚得率［4］。如圖5 所示，隨著超聲時間增加荔枝殼多酚得率呈先大幅增加后緩慢降低的趨勢，最高為7.5%，故選擇超聲時間為40 min。

圖5 超聲時間對荔枝殼多酚得率的影響

3.2.5 提取溫度對荔枝殼多酚得率的影響 提取溫度可加劇分子熱運(yùn)動，有利于活性成分充分溶出。然而，乙醇作為是乙醇-硫酸銨雙水相體系的有機(jī)相，易揮發(fā)，過高的提取溫度不利于其提取。同時，過高的提取溫度也加快了花青素、沒食子酸、兒茶素等不穩(wěn)定荔枝殼多酚的分解［24］。另外，在雙水相成相點(diǎn)附近，溫度對雙水相體系的相圖、提取能力的影響較顯著。因此，選擇合適的提取溫度是必要的考慮因素。如圖6 所示，隨著提取溫度增加荔枝殼多酚得率呈先快后慢的增加趨勢，但超過60 ℃時快速下降，最高為7.8%，故選擇提取溫度為50 ℃。

圖6 提取溫度對荔枝殼多酚得率的影響

3.3 響應(yīng)面法 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、超聲時間（C）作為影響因素，荔枝殼多酚得率（Y）作為評價指標(biāo)，共17 組試驗(yàn)，結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 方差分析

利用Design-expert 12.0 軟件對表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，得方程為Y＝35.3＋0.85A＋0.74B＋0.76C-0.025AB＋0.17AC＋0.7BC-2.03A2-2.35B2-2.25C2，其中A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2影響顯著（P＜0.05），AC影響不顯著（P＞0.05）。由表5 可知，模型P＜0.01，失擬項(xiàng)P失擬項(xiàng)＞0.05，F(xiàn)失擬項(xiàng)＞0.5，表明模型具有高度顯著性，擬合度較好； 回歸系數(shù)R2＝0.985 1，Radj2＝0.965 9，表明模型可用于預(yù)測分析； 各因素影響程度依次為液料比（B）＞超聲時間（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）。響應(yīng)面分析見圖7。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、超聲時間（C）響應(yīng)面圖

最終確定，最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)30.91%，料液比21.01 ∶ 1，超聲時間41.69 min，荔枝殼多酚得率為8.72%，考慮實(shí)驗(yàn)可操作性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)31%，料液比22 ∶1，超聲時間42 min，即ATPS7 組。在上述最優(yōu)工藝下，ATPS7 組荔枝殼多酚得率為8.54%，近似于預(yù)測值8.72%，遠(yuǎn)高于M7 組乙醇提取的荔枝殼多酚得率4.31%。多酚含量測定顯示，ATPS7 組荔枝殼多酚含量為88.2%，遠(yuǎn)高于M7 組多酚含量16.8%，表明該模型適用于荔枝殼多酚提取，乙醇-硫酸銨雙水相體系是提取荔枝殼多酚的有效溶劑體系。

3.4 抗氧化活性測定 荔枝殼多酚是荔枝殼提取物主要活性成分，具有良好的抗氧化［5］、抗炎［6］、調(diào)節(jié)免疫［7］等生物活性，常用于護(hù)膚、美白、抗衰老等。體外抗氧化活性評價結(jié)果如圖8 所示，ATPS7 組、M7 組清除DPPH 自由基半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為33.8、236.2 μg／mL，清除羥自由基IC50分別為23.4、65.2 μg／mL，表明ATPS7 組荔枝殼多酚抗氧化活性更強(qiáng)。

圖8 ATPS 組、M7 組體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 體外消化試驗(yàn) 荔枝殼多酚的成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性較差，易受溫度、氧氣、酸堿等因素破壞，從而失去活性。經(jīng)體外消化后，ATPS7 組、M7 組多酚含量分別為51.9%、12.6%，降低了41.5%、25.0%。體外抗氧化活性評價結(jié)果如圖9 所示，ATPS7 組、M7 組清除DPPH 自由基IC50分別為51.8、139.5 μg／mL，清除羥自由基IC50分別為30.4、48.7 μg／mL，表明相對于M7 組荔枝殼多酚，經(jīng)體外消化后ATPS7 組荔枝殼多酚的含量與活性顯著降低，即其不穩(wěn)定性較強(qiáng)。

圖9 體外模擬消化后ATPS 組、M7 組抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

雙水相體系是一種新型提取方法，條件溫和，操作簡單，提取效率高，避免了反復(fù)低效的萃取過程。然而，中藥活性成分的提取易受多種因素影響，如溶劑類型、液料比、提取溫度、時間等。本實(shí)驗(yàn)制備了6 種不同的雙水相體系用于提取荔枝殼多酚，乙醇-硫酸銨雙水相體系提取效果最佳，故將其作為荔枝殼多酚的提取溶劑。Box-Behnken響應(yīng)面法是一種多因素非線性試驗(yàn)條件優(yōu)選方法，可評估多因素的非線性影響，有效地篩選多因素間的最優(yōu)組合，預(yù)測能力優(yōu)越。結(jié)果顯示，最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)31%，料液比22 ∶1，超聲時間42 min，荔枝殼多酚得率為8.54%，多酚含量達(dá)88.2%。與常規(guī)的乙醇提取方法比較，乙醇-硫酸銨雙水相體系提取荔枝殼多酚操作簡單，效率高，且多酚含量高，不需繁瑣的純化富集過程［25］。

荔枝殼多酚含有花青素、沒食子酸、兒茶素等成分，活性強(qiáng)，但結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易分解從而失去活性［4，24］。荔枝殼多酚的應(yīng)用前景與多酚的穩(wěn)定性、消化前后的抗氧化活性密切相關(guān)?？寡趸钚越Y(jié)果顯示，乙醇-硫酸銨雙水相體系提取的荔枝殼多酚DPPH、羥自由基IC50分別為33.8、23.4 μg／mL； 經(jīng)體外消化后，其DPPH、羥自由基IC50分別為51.8、35.4 μg／mL，多酚含量為51.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然乙醇-硫酸銨雙水相提取的荔枝殼多酚結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定更顯著，但多酚含量高，抗氧化活性更佳，優(yōu)于乙醇提取的荔枝殼多酚。綜上所述，采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取荔枝殼多酚是一種高效快速的提取方法，有利于荔枝殼多酚的提取純化，進(jìn)一步開發(fā)與利用荔枝資源。