炆遠(yuǎn)志炮制工藝優(yōu)化及其成分與色澤相關(guān)性分析

宋金菊，鐘凌云*，薛 曉*，解 楊，李家晴，王 卓，黃 藝，陳明霞，劉 斌，李育凈

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004； 2.建昌幫藥業(yè)有限公司，江西 撫州 344700）

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygalatenuifolia或卵葉遠(yuǎn)志P.sibirica的干燥根，性溫，味苦、辛，入心、腎、肺經(jīng)，具益智安神、祛痰、消腫等作用［1］。遠(yuǎn)志的炮制方法主要有去心、甘草制、蜜炙和炆制等［2-3］，其中炆遠(yuǎn)志的特色炮制方法是將甘草與遠(yuǎn)志共同放入藥罐中，加水后用糠火炆制，不僅可消除“戟人咽喉” 的副作用，還能增強(qiáng)其益智安神之功［3-6］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，炆遠(yuǎn)志可減輕對(duì)大鼠胃腸功能的抑制作用［7］，提高心腎不交型失眠大鼠的記憶能力，且安神益智作用強(qiáng)于生品［8］。然而，評(píng)價(jià)炆遠(yuǎn)志質(zhì)量完全靠老藥工的經(jīng)驗(yàn)，主觀性強(qiáng)，難以有效控制，故本實(shí)驗(yàn)將炆遠(yuǎn)志的成分與色澤度相關(guān)聯(lián)，建立更客觀的評(píng)價(jià)方法。

本實(shí)驗(yàn)將Box-Behnken 響應(yīng)面法和層次分析法（AHP）結(jié)合，進(jìn)行炆遠(yuǎn)志炮制工藝的優(yōu)化，再使用色差分析技術(shù)，將不同的炆遠(yuǎn)志樣品粉末的外觀顏色與內(nèi)在成分相關(guān)聯(lián)，研究分析炆遠(yuǎn)志的外觀色澤與內(nèi)在成分間的傳遞規(guī)律，為炆遠(yuǎn)志飲片在炮制過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控提供數(shù)據(jù)支持，以便實(shí)現(xiàn)炆遠(yuǎn)志的規(guī)范化生產(chǎn)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2965 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）； SHZ-D （Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）； 111-B 二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）； Precision colorimetry SR-62 色差儀（深圳市三恩時(shí)科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 遠(yuǎn)志（產(chǎn)地山西，批號(hào)20200701，江西古漢精制中藥飲片有限公司）、甘草（產(chǎn)地山西，批號(hào)20181224，江西旴江生態(tài)科技有限公司）分別經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒、葛菲教授鑒定為正品。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（批號(hào)CHB180329）、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ（批號(hào)CHB180913）、阿魏酸（批號(hào)CHB180206）、3，6′-二芥子?；崽?（批號(hào)CHB180429），均購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司。磷酸［阿拉丁試劑（上海）有限公司］。

2 方法與結(jié)果

2.1 炆遠(yuǎn)志制備 取1.5 cm 遠(yuǎn)志段100 g 和適量切制成斜片的生甘草，將兩者放入炆藥壇內(nèi)，手動(dòng)拌勻后，加入相應(yīng)量的滑水或溫水，蓋好壇蓋，放置于壇底兩邊以磚架起的圍灶內(nèi)，壇的四周用足量的干糠堆滿(mǎn)，點(diǎn)火后炆制相應(yīng)的時(shí)間［2，6，9］，至糠燼藥熟、壇內(nèi)湯水基本吸干為度，起壇倒出，揀去甘草段，烘箱干燥至手握即碎，即得。

2.2 醇浸出物的定量測(cè)定 選用2020 年版《中國(guó)藥典》四部2201 （浸出物測(cè)定法）項(xiàng)下熱浸法［2］。

2.3 各成分含量測(cè)定 采用HPLC 法。

2.3.1 色譜條件 參考文獻(xiàn) ［2］報(bào)道，采用Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

色譜條件1：流動(dòng)相甲醇（A）-0.05%磷酸（70 ∶30）；體積流量1.0 mL／min； 檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm； 柱溫35 ℃； 進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品（A）、供試品（B）溶液HPLC 色譜圖（Ⅰ）

色譜條件2：流動(dòng)相乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～20 min，18% A； 20 ～60 min，18% ～24% A）；體積流量1.0 mL／min； 柱溫35 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm； 進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照品（A）、供試品（B）溶液HPLC 色譜圖（Ⅱ）

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，置于棕色量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲處理5 min，即得（遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、阿魏酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、3，6′-二芥子?；崽琴|(zhì)量濃度分別為0.28、0.11、1.006 6、0.312 5 mg／mL），在4 ℃下保存。

2.3.3 供試品溶液制備 供試品溶液1：精密稱(chēng)定過(guò)3 號(hào)篩的炆遠(yuǎn)志粉末約1 g，后續(xù)選用遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷測(cè)定含量方法，與2020 年版《中國(guó)藥典》 方法［2］一致。

供試品溶液2：與崔月莉等［10］報(bào)道一致，不同之處在于溶劑為70%甲醇，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 取“2.3.2” 項(xiàng)下細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋2、4、8、10、16、20 倍，配制質(zhì)量濃度分別為 1.006 6、0.503 3、0.251 65、0.125 825、0.100 66、0.062 912 5、0.050 33 mg／mL 的溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件1 下進(jìn)樣測(cè)定。

精密吸取“2.3.2” 項(xiàng)下阿魏酸、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽菍?duì)照品溶液適量，甲醇將阿魏酸稀釋40、80、160、320、400 倍，分別制成質(zhì)量濃度為0.11、0.002 75、0.001 375、0.000 687 5、0.000 343 75、0.000 275 mg／mL 的溶液； 將遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ稀釋2、4、8、10、16 倍，分別制成質(zhì)量濃度為0.28、0.14、0.07、0.035、0.028、0.017 5 mg／mL 的溶液； 將3，6′-二芥子酰基蔗糖稀釋2、4、8、10、16 倍，分別制成質(zhì)量濃度為0.312 5、0.156 25、0.078 125、0.039 062 5、0.031 25、0.019 531 25 mg／mL 的溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件2 下進(jìn)樣測(cè)定。

以各成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 各成分線(xiàn)性關(guān)系

2.3.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品溶液10 μL，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件1 下進(jìn)樣測(cè)定6 次，分別精密吸取另外3 個(gè)對(duì)照品溶液20 μL，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件2 下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、3，6′-二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ峰面積RSD 分別為0.67%、0.32%、0.52%、0.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取10 μL “2.3.3” 項(xiàng)下供試品溶液1，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件1 下進(jìn)樣測(cè)定； 精密吸取20 μL “2.3.3” 項(xiàng)下的供試品溶液2，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件2 下進(jìn)樣測(cè)定，時(shí)間點(diǎn)均為0、2、4、8、16、24 h，測(cè)得細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、3，6′-二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ峰面積RSD 分別為2.21%、0.92%、0.26%、1.18%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批炆遠(yuǎn)志粉末6 份，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液1、2，分別在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件1、2 下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、阿魏酸、3，6′-二芥子酰基蔗糖、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量RSD 分別為2.14%、1.34%、0.31%、0.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.3.3” 項(xiàng)下各成分含量已知的供試品溶液1、2 各0.5 mL，平行6 份，置于具塞錐形瓶中，供試品溶液1 中加入“2.3.2” 項(xiàng)下細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品溶液適量，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件1 下進(jìn)樣測(cè)定； 供試品溶液2 中加入“2.3.2” 項(xiàng)下阿魏酸、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽菍?duì)照品溶液適量，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件2 下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，各成分平均加樣回收率分別為細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷103.56%、阿魏酸0.62%、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ0.52%、3，6′-二芥子酰基蔗糖2.10%。

2.4 指標(biāo)成分權(quán)重確定

2.4.1 AHP 法 基于醇浸出物、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ和3，6′-二芥子酰基蔗糖作為2020 年版《中國(guó)藥典》遠(yuǎn)志質(zhì)量控制的關(guān)鍵性指標(biāo)，阿魏酸為遠(yuǎn)志炆制后含量會(huì)上升的小分子酸［10］，并且具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙和神經(jīng)保護(hù)作用［11-12］，故將其納入為評(píng)價(jià)炆遠(yuǎn)志炮制工藝的關(guān)鍵指標(biāo)范疇。將這5 個(gè)指標(biāo)分為5 個(gè)層次，建立炆遠(yuǎn)志炮制工藝評(píng)價(jià)層次結(jié)構(gòu)模型，以含量多少和指向性明確為標(biāo)準(zhǔn)，醇浸出物指向性最低，故層級(jí)占比最?。?阿魏酸指向性強(qiáng)但含量最低，層級(jí)占比高于醇浸出物； 而細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量雖高，但提取方法和液相方法不同于其他指標(biāo)成分，所以確定指標(biāo)的重要性排序?yàn)?，6′-二芥子酰基蔗糖＞遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ＞細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷＞阿魏酸＞醇浸出物。兩兩比較重要性按照1～9 的相對(duì)評(píng)分規(guī)則進(jìn)行，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2，成分成對(duì)比較優(yōu)先判斷矩陣及權(quán)重系數(shù)見(jiàn)表3，可知CR＝0.095 7＜0.1，矩陣符合一致性檢驗(yàn)［13-14］，表明能在炆遠(yuǎn)志炮制工藝的優(yōu)化評(píng)分中應(yīng)用該權(quán)重系數(shù)。

表2 各層級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表3 各指標(biāo)成對(duì)比較優(yōu)先判斷矩陣及其權(quán)重系數(shù)

2.4.2 綜合評(píng)分（OD）計(jì)算 公式為OD ＝（W1×Y1／Y1max＋W2×Y2／Y2max＋W3×Y3／Y3max＋W4×Y4／Y4max＋W5×Y5／Y5max）×100%，其中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5分別為遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、阿魏酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、3，6′-二芥子?；崽?、醇浸出物含量，Y1max、Y2max、Y3max、Y4max、Y5max分別為對(duì)應(yīng)的最大值［14］。

2.5 Box-Bohnken 響應(yīng)面法 參考文獻(xiàn)［15］報(bào)道和課題組前期研究［2］，以加水量（A）、甘草用量（B）、干燥溫度（C）為影響因素，遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ（Y1）、阿魏酸（Y2）、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（Y3）、3，6′-二芥子酰基蔗糖（Y4）、醇浸出物（Y5）含量的綜合評(píng)分（OD）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因素水平見(jiàn)表4，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 因素水平

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.06 軟件對(duì)表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得方程為OD＝90.29-1.44A＋2.21B＋4.11C＋2.58AB＋1.61AC-1.14BC-2.18A2＋1.06B2-4.91C2，方差分析見(jiàn)表6。由此可知，模型F＝4.16，P＝0.036 8 ＜0.05； 失擬項(xiàng)F＝0.75，P＝0.578 4＞0.05，可見(jiàn)模型具有高度顯著性，可用于預(yù)測(cè)分析； 一次項(xiàng)顯著性依次為C＞B＞A，二次項(xiàng)顯著性依次為C2＞A2＞B2，交互項(xiàng)無(wú)顯著性； 因素C影響極顯著 （P＜0.01），C2影響顯著（P＜0.05）。

表6 方差分析

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖3。最終確定，最優(yōu)工藝為每100 g 1.5 cm 遠(yuǎn)志段加5 倍量水、7 g 甘草，干燥溫度70 ℃。

圖3 加水量（A）、甘草用量（B）、干燥溫度（C）響應(yīng)面圖

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱(chēng)取1.5 cm 的遠(yuǎn)志段100 g，平行3 份，按“2.5” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行炮制，測(cè)得綜合評(píng)分分別為89.16、88.87、89.90 分，表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.7 色度值測(cè)定 采用Precision colorimetry SR-62 色差儀，設(shè)置測(cè)定條件為D65 光源，孔徑4 mm，SCE 模式，對(duì)儀器進(jìn)行黑白板校正。該模式下L、a、b 代表各個(gè)炮制品的色度值，Eab 為總色度值，其中L 為明亮度，a 和b 分別調(diào)控2 個(gè)色調(diào)方向，L 值越大，明亮度越高，表現(xiàn)為越白，反之越黑； a 調(diào)控紅色和綠色，＋a 表示與a 值呈正相關(guān)，調(diào)控紅色，-a 表示與a 值呈負(fù)相關(guān)，調(diào)控綠色； b 調(diào)控黃色和藍(lán)色，＋b 表示與b 值呈正相關(guān)，調(diào)控黃色，-b 表示與b 值呈負(fù)相關(guān)，調(diào)控藍(lán)色［16-18］。

先取與“2.5.1” 項(xiàng)下炆遠(yuǎn)志同批次的生品粉末進(jìn)行標(biāo)樣測(cè)定，再取“2.5.1” 項(xiàng)下17 組炆遠(yuǎn)志粉末作為供試品依次測(cè)定，平行3 次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表7。遠(yuǎn)志生品中，各成分含量分別為遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ3.339 2 mg／g、阿魏酸0.035 3 mg／g、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷26.842 3 mg／g、3，6′-二芥子酰基蔗糖7.585 9 mg／g、醇浸出物含量44.800 0 g／g。

表7 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志L、a、b 值

2.8 相關(guān)性分析 根據(jù)炆遠(yuǎn)志不同炮制品中色度值L、a、b 值和5 個(gè)指標(biāo)的含量制作相應(yīng)的變化趨勢(shì)圖，將兩者進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析［19］，結(jié)果見(jiàn)圖5～6、表8。

表8 成分含量秩檢驗(yàn)相關(guān)性分析

圖5 色度值、成分含量變化趨勢(shì)

圖6 成分含量與色度值相關(guān)性熱圖

結(jié)果顯示，炆遠(yuǎn)志成分含量的高低影響著色澤的變化，其關(guān)聯(lián)性表現(xiàn)為醇浸出物和遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量調(diào)控亮度和綠色，含量越高越亮白、越綠； 阿魏酸含量調(diào)控黑色和紅色，阿魏酸含量越高越黑、越紅； 醇浸出物和遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量越高，Eab 值越大； 阿魏酸含量越高，Eab 值越小。雖然由表7 的相關(guān)性分析數(shù)據(jù)可知，b 值各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性沒(méi)有顯著性，但遠(yuǎn)志生品的外觀為黃棕色，與b 值關(guān)系密切，故做進(jìn)一步的分析。結(jié)果，b 值與細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、3，6′-二芥子酰基蔗糖和醇浸出物含量呈正相關(guān)，與阿魏酸和遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量呈負(fù)相關(guān)。由表4 可知，1 g 炆遠(yuǎn)志中各成分含量依次為醇浸出物＞細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷＞3，6′-二芥子?；崽牵具h(yuǎn)志口山酮Ⅲ＞阿魏酸； 遠(yuǎn)志炆制后，醇浸出物、3，6′-二芥子?；崽恰⑦h(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量有不同程度的下降，阿魏酸含量有所上升，表明炆遠(yuǎn)志的外觀色澤度變化與其內(nèi)在指標(biāo)成分含量的變化具有一致性，可通過(guò)將直觀的飲片外觀顏色與內(nèi)在的成分相關(guān)聯(lián)，作為鑒定飲片質(zhì)量的新方法。

3 討論與結(jié)論

本研究以《建昌幫中藥傳統(tǒng)炮制法》 和2008 年版《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》 為基礎(chǔ)，選擇5 種關(guān)鍵成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)影響炆遠(yuǎn)志飲片質(zhì)量的3 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，探究能否通過(guò)改變?yōu)蛇h(yuǎn)志炮制過(guò)程中的加水量、甘草用量和干燥溫度來(lái)把控飲片生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，炮制工藝因素對(duì)炆遠(yuǎn)志影響程度由大到小排序?yàn)楦稍餃囟龋靖什萦昧浚炯铀?，其中干燥溫度?duì)遠(yuǎn)志炆制工藝具有顯著差異（P＜0.05），最終確定最優(yōu)炆制工藝為100 g 遠(yuǎn)志加5 倍水、7 g 甘草，干燥溫度70 ℃。

中藥飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要由外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量綜合確定，本研究將表面顏色與內(nèi)在成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析［20］增加外觀顏色來(lái)判定炆遠(yuǎn)志飲片炮制程度［21］，進(jìn)而把控其飲片質(zhì)量。傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，遠(yuǎn)志主要以筒粗、肉厚、去凈木心為佳［22］，但由于遠(yuǎn)志炆制后，肉眼難以辨別外觀性狀的差異。因此，本實(shí)驗(yàn)采用色差儀對(duì)炆遠(yuǎn)志粉末的表面顏色進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明炆遠(yuǎn)志飲片外觀顏色受醇浸出物、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ和阿魏酸含量影響，醇浸出物和遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量越高，越亮綠，反之越黑紅； 阿魏酸含量越高，越黑紅，反之越亮綠。研究數(shù)據(jù)表明，與生品相比，遠(yuǎn)志炆制后醇浸出物和遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量降低，阿魏酸含量升高，表面顏色變化趨向黑紅，與內(nèi)在指標(biāo)成分含量的變化具有一致性。