藿香正氣方揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化及GC-MS 分析

連益純，張東元，楊 輝，段銀穎，翁澄瑩，李知瑾，林 靜，羅友華

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122； 2.廈門市醫(yī)藥研究所，福建 廈門 361008； 3.廈門市天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，福建 廈門 361008）

藿香正氣方源于宋《太平惠民和劑局方》，用于濕邪為患的多種病證，被歷代醫(yī)家尊為“祛濕圣藥”，用于治療胃腸道感冒、濕阻中焦等癥效果明顯［1-2］。我國約有630家藥廠生產(chǎn)10 種藿香正氣劑型，2020 年版《中國藥典》收載了5 種藿香正氣制劑［3］，藿香正氣水、口服液、滴丸3 種劑型的處方、比例相同（廣藿香油-紫蘇葉油＝2 ∶1，蒼術-陳皮-姜厚樸-白芷＝2 ∶2 ∶2 ∶3，干姜-生半夏＝1 ∶11.9），制法不同； 上述3 種劑型與軟膠囊的處方、比例和制法均不同。上述4 種制劑處方均用蒼術取代白術，生半夏取代半夏曲，干姜取代生姜（制法中把干姜與用冷水浸泡透心的生半夏共煎，以降低生半夏毒性），甘草浸膏取代炙甘草，廣藿香油取代廣藿香，紫蘇葉油取代紫蘇葉，刪去大棗、桔梗，與藿香正氣散差異較大； 加味藿香正氣軟膠囊與藿香正氣散基本相同［3-4］。

為更好提取藿香正氣方中揮發(fā)油，本研究以藿香正氣水處方為依據(jù)，以得率優(yōu)選揮發(fā)油提取工藝，以轉(zhuǎn)移率優(yōu)選3 種蒸餾工藝路線； 建立GC-MS 法比較單提和混提揮發(fā)油化學成分差異。從揮發(fā)油藥效物質(zhì)基礎的角度為藿香正氣制劑二次開發(fā)和含揮發(fā)油成分的中藥制劑研究提供參考。

1 材料

Agilent 7890A-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配置MSD ChemStation F.01.03.2357 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、NIST17 標準質(zhì)譜圖庫，美國安捷倫公司）； 揮發(fā)油測定器（測定管刻度5 mL，精確到0.1 mL，廈門綠茵試劑玻儀有限公司）；XS205 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； 水蒸氣發(fā)生器（水蒸氣溫度為室溫～150 ℃）、定制玻璃管圓柱（內(nèi)徑5 cm，長度30 cm）［菁工儀器（上海）有限公司］；KQ-500VDB 型三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

姜厚樸（批號20201102，產(chǎn)地四川，廣東匯群中藥飲片股份有限公司）、白芷（批號201101，產(chǎn)地四川遂寧，亳州市張仲景中藥飲片有限責任公司）、紫蘇葉、干姜（批號2006033、2012038，產(chǎn)地浙江，浙江華宇藥業(yè)股份有限公司）、廣藿香（批號20201101，產(chǎn)地廣東，廣東匯群中藥飲片股份有限公司）、陳皮（批號200401，產(chǎn)地浙江衢州，安徽人民中藥飲片有限公司）、蒼術 （批號210115079a，產(chǎn)地內(nèi)蒙呼倫貝爾，安徽新盛中藥飲片有限公司）、生半夏（批號200905-04，產(chǎn)地甘肅，福建承天藥業(yè)有限公司）均購自國藥控股福建有限公司，經(jīng)專家鑒定為正品。正己烷（批號20201021，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥典法提取揮發(fā)油（外部加熱共水回流法）按藿香正氣水系列處方、制備工藝情況，把方中含揮發(fā)油的飲片按表1 分成5 種混合樣品，分別提取混合揮發(fā)油。

稱取廣藿香、紫蘇葉、姜厚樸、蒼術、陳皮、白芷、干姜、生半夏適量，分別粉碎過2 號篩得8 味飲片粗粉。按2020 年版《中國藥典》 四部2204 揮發(fā)油測定甲法，分別稱取上述粗粉各100 g 和①～⑤號樣品，分別放入2 000 mL 圓底燒瓶中，從測定器上端口加入1 000 mL 飲用水，將燒瓶放入電熱套中，接上球形回流冷凝管和水溫2～6 ℃的冷卻水，飲片（或粗粉）浸泡30 min 后開始加熱，沸騰后計時，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 分別記錄揮發(fā)油體積，用標記好的棕色瓶收存揮發(fā)油，密封后于4 ℃冰箱冷藏備用，同法提取上述樣品揮發(fā)油2 批，計算揮發(fā)油得率和轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表2 ～4，公式為揮發(fā)油得率＝ ［揮發(fā)油體積／飲片（粗粉）質(zhì)量］×100%、揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率＝（混提所得揮發(fā)油體積／混提物料中所含揮發(fā)油的理論體積之和）×100%。

表2 單味飲片粗粉揮發(fā)油得率測定結(jié)果（藥典法，%，n＝3）

由表2 可知，廣藿香粉、紫蘇葉粉、蒼術粉、陳皮粉、白芷粉、姜厚樸粉、干姜粉按藥典法單獨提取揮發(fā)油的最高得率分別為1.58%、0.28%、2.15%、0.34%、0.16%、0.62%、1.51%，單獨提取的最優(yōu)時間分別為5、6、5、5、3、7、5 h。生半夏粉未提取得到揮發(fā)油，說明藥典法不適用于生半夏揮發(fā)油的提取，與文獻［5］報道一致。

由表3 可知，①～⑤號樣品的揮發(fā)油最高得率分別為0.98%、0.40%、1.14%、0.81%、1.02%，最優(yōu)混合提取時間分別為8、8、8、7、5 h。

表3 5 種樣品揮發(fā)油得率測定結(jié)果（藥典法，%，n＝3）

根據(jù)混提飲片（粗粉）質(zhì)量和本實驗測得單味粉末揮發(fā)油得率，計算①～⑤（按干姜質(zhì)量計算）號樣品的揮發(fā)油理論得率分別為 0.74%、0.74%、0.99%、0.99%、1.51%，再按“2.1” 項下?lián)]發(fā)油轉(zhuǎn)移率公式和表3 混提揮發(fā)油最高得率分別計算其揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表4。由此可知，藿香正氣水處方飲片、粉末混提揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率平均值不同，依次為①＞③＞④＞⑤＞②，說明采用藥典法提取藿香正氣方揮發(fā)油時，粗粉混提揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率高于飲片混提。

表4 5 種樣品揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果（藥典法，%）

2.2 通入水蒸氣加熱共水回流法提取混合飲片揮發(fā)油 分別稱?、冖芴枠悠?，放入2 000 mL 三口圓底燒瓶中，一側(cè)口用帶有溫度計的橡膠塞密封，另一側(cè)口接水蒸氣發(fā)生器，中間口接揮發(fā)油測定器，從測定器上端口加入1 000 mL 飲用水，接上球形回流冷凝管和水溫為2～6 ℃的冷卻水，飲片浸泡30 min 后，向圓底燒瓶中的藥液通入水蒸氣開始加熱，水蒸氣發(fā)生器溫度設為115 ℃，藥液沸騰（溫度為95 ℃以上）后開始計時，其余操作同 “2.1” 項。按“2.1” 項下方法再分別提取上述2 種混合飲片揮發(fā)油2 批，計算揮發(fā)油得率和轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表5～6。

表5 混提處方揮發(fā)油得率測定結(jié)果（通入水蒸氣加熱共水回流法，%，n＝3）

由表5 可知，藿香正氣水處方中②④號樣品通入水蒸氣加熱共水回流法揮發(fā)油最高得率分別為0.38%、0.62%；飲片混提的最優(yōu)時間分別為9、7 h。

由表6 可知，藿香正氣水處方中②④號樣品混合飲片通入水蒸氣加熱共水回流法揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率分別為50.90%、62.96%。

表6 混提處方揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果（通入水蒸氣加熱共水回流法，%）

2.3 水蒸氣擴散法提取混合飲片揮發(fā)油 分別稱?、冖芴柣旌巷嬈傊?0 g，放入定制的玻璃管圓柱中，用飲用水潤濕飲片后將玻璃管圓柱豎直靜置30 min，玻璃管圓柱的上進口接水蒸氣發(fā)生器，下出口接蛇形冷凝管后再接揮發(fā)油測定器，接上水溫為2～6 ℃的冷卻水，通入115 ℃水蒸氣后開始計時，其余操作同“2.1” 項。按“2.1” 項下方法再分別提取上述2 種混合飲片揮發(fā)油2 批，發(fā)現(xiàn)采用水蒸氣擴散裝置無法提取到②④號樣品的揮發(fā)油。

2.4 藿香正氣水處方揮發(fā)油最優(yōu)提取工藝的確定 由表4、6 可知，藿香正氣水處方中②④號樣品按揮發(fā)油得率平均值的提取方法均依次為藥典法＞通入水蒸氣加熱共水回流法＞水蒸氣擴散法，所以藿香正氣水處方中②④號樣品揮發(fā)油的最優(yōu)水蒸氣蒸餾法提取工藝均為粗粉回流8 h； 但因采用粗粉提取時，需先把飲片粉碎成粗粉，在水煎煮提取過程中粗粉容易發(fā)生焦糊，后續(xù)藥液過濾比飲片困難。因此，②④號樣品的最優(yōu)提取工藝分別確定為飲片混提8 h、飲片混提7 h。

因半夏和干姜的粗粉在水提取過程中，均發(fā)生嚴重焦糊現(xiàn)象，所以⑤號樣品揮發(fā)油只能采用飲片提取。由表4可知，⑤號樣品的最優(yōu)提取工藝為飲片混提5 h。

2.5 供試品溶液制備 分別吸取廣藿香油、紫蘇葉油、姜厚樸油、蒼術油、陳皮油、白芷油、干姜油及①～⑤號揮發(fā)油各15 μL 至棕色瓶中，分別用1 485 μL 正己烷稀釋并混勻，超聲（45 kHz、500 W）提取3 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.6 氣相色譜條件 Agilent HP-5MS 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 進樣口溫度250 ℃； 載氣氦氣（質(zhì)量分數(shù)99.999%）； 分流比10 ∶1； 體積流量1 mL／min； 程序升溫（初始60 ℃，以8 ℃／min 升至280 ℃，保持27.5 min）； 進樣量2 μL。

2.7 質(zhì)譜條件 電子電離源，電子能量70 eV； 離子源溫度230 ℃； 四級桿150 ℃； 掃描質(zhì)量范圍m／z50 ～1 500，全掃描方式； 溶劑延遲時間4 min。

2.8 GC-MS 分析 采用GC-MS 分析“2.5” 項下12 種揮發(fā)油供試品溶液，得其總離子流圖，見圖1。通過安捷倫計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)NIST17 數(shù)據(jù)庫，對各成分峰質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行檢索對照，按匹配度在70%以上初步鑒定化合物，確定了上述12 種揮發(fā)油的主要化學成分，按相對含量歸一化法計算各化合物在揮發(fā)油中的相對含量（相對百分含量），對匹配度70%、相對含量1%以上的化合物進行分析比較，結(jié)果見表7。

圖1 藿香正氣水處方12 種樣品揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

表7 揮發(fā)油成分相對含量（排名前5 位）

由此可知，①揮發(fā)油與②揮發(fā)油、③揮發(fā)油與④揮發(fā)油、干姜粉末揮發(fā)油和⑤揮發(fā)油排在前5 位的化合物及相對含量均不同，說明單提和混提揮發(fā)油以及原料采用粗粉還是飲片，其所得揮發(fā)油的成分種類和相對含量均發(fā)生了較大變化。

藿香正氣水處方單提和混提揮發(fā)油成分和相對含量比較可見，②揮發(fā)油與②飲片分別單提油（45 個化合物）比較，d-檸檬烯等5 個化合物相對含量發(fā)生了變化，新增1-甲基-4- （1-甲基乙基）-1，4-環(huán)己二烯等5 個化合物，減少α-桉葉醇等40 個化合物。①揮發(fā)油與①飲片分別單提油（45 個化合物）比較，β-桉葉醇等8 個化合物相對含量發(fā)生了變化，新增沉香螺萜醇等6 個化合物，減少α-桉葉醇等37 個化合物。③揮發(fā)油（22 個化合物）與③飲片分別單提油（60 個化合物）比較，百秋李醇等17 個化合物相對含量發(fā)生了變化，新增沉香螺萜醇等5 個化合物，減少α-桉葉醇等43 個化合物。④揮發(fā)油（14 個化合物）與④飲片分別單提油（60 個化合物）比較，百秋李醇等13 個化合物相對含量發(fā)生了變化，新增（1R，4aS，6R，8aS）-8a，9，9-三甲基-1，2，4a，5，6，7，8，8a-八氫-1，6-甲烷萘-1-醇1 個化合物，減少α-桉葉醇等47 個化合物。結(jié)果表明，②揮發(fā)油與②飲片分別單提油、④揮發(fā)油與④飲片分別單提油之間成分種類和相對含量也不相同。⑤揮發(fā)油（24 個化合物）與干姜粉油（9 個化合物）比較，姜烯等6個化合物相對含量發(fā)生了變化，新增4-甲基-1- （1-甲基乙基）-雙環(huán)［3.1.0］六-2-烯等18 個化合物，減少（Z）-1-甲基-4- （6-甲基庚-5-烯-2-亞基）環(huán)己-1-烯等3 個化合物，表明用干姜和半夏在一起炮制煎煮過程中，干姜揮發(fā)油成分的種類和相對含量均發(fā)生了較大變化。

3 討論

2020 年版《中國藥典》 一部收載的藿香正氣水中，廣藿香和紫蘇葉是以廣藿香油-紫蘇葉油（2 ∶1）投料，優(yōu)點是很好地保證了飲片揮發(fā)油的劑量，不足的是丟失了飲片的水溶性成分，是否科學值得進一步研究［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)水蒸氣擴散法無法提出藿香正氣水飲片的揮發(fā)油，可能是水分子不能充分滲透進入植物細胞油室中，導致?lián)]發(fā)油分子無法與水乳化，無法和水蒸氣一起進入冷凝管中，故未能提取得到揮發(fā)油。藿香正氣水處方的12 種樣品揮發(fā)油得率為0.16% ～2.15%，單一成分相對含量為1.0% ～44.3%，故分析得到揮發(fā)油單一成分在原復方飲片中的含量為0.001 6% ～0.908 2%。

廣藿香的揮發(fā)油和黃酮類化合物對金色葡萄球菌、念珠菌均有抑制作用，對細菌感染的皮膚病有療效［7］。Murugan 等［8］鑒定出廣藿香油26 種成分，主要為α-愈傷木烯、塞舌爾烯、α-廣藿香烯、α-布爾烯和廣藿香醇。Xu等［9］對不同部位厚樸油分析表明，桉葉醇及其異構(gòu)體（a-，c-桉葉醇）含量較高，分別為47.66%、36.74%、36.31%。Liu 等［10］分析了紫蘇梗油、紫蘇葉油和紫蘇子油成 分，發(fā) 現(xiàn) 1，4，7-cycloundecatriene-1、5，9，9-tetramethyl-zzz、1-環(huán)己烷-1-甲醛、β-石竹烯、2-己?；秽ⅵ?法尼烯是其主要成分。Luo 等［11］測定了我國不同產(chǎn)地10 個品種25 批次陳皮成分，共鑒定出98 個化合物，主要為d-檸檬烯、γ-松油烯、α-松油烯、芳樟醇和月桂烯。Shirooye 等［12］共鑒定出姜油94% 以上的成分（55 個化合物），最多的為α-姜烯（15.20%）、β-菲香烯（13.51%）、莰烯 （7.69%）、E-E-α-法尼烯 （7.04%）、β-倍半香烯（6.96%）和ar-姜黃烯 （5.60%），占揮發(fā)油的56%。Li等［13］對白芷等4 種傘形科植物揮發(fā)油分析表明，含多種鄰內(nèi)酯類化合物，其中富含木本內(nèi)酯、反式苯甲醚和蛇床子素，均具抗炎活性。

由于產(chǎn)地、采收時間、采收部位、炮制方法、提取工藝等均會影響揮發(fā)油得率和成分，本研究對藿香正氣水處方揮發(fā)油的GC-MS 分析結(jié)果與許多文獻報道的結(jié)果也不盡相同［14-21］。因此，希望藥學人員繼續(xù)積累中藥揮發(fā)油的分析數(shù)據(jù)，建立中藥揮發(fā)油GC-MS 數(shù)據(jù)庫，為中藥現(xiàn)代化發(fā)展奠定揮發(fā)油藥效物質(zhì)研究基礎。