漢黃芩素在骨關(guān)節(jié)炎中的藥理作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展

段 航，王林華，鄺高艷，盧 敏

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是指由于關(guān)節(jié)或關(guān)節(jié)周圍組織異常引起的關(guān)節(jié)應(yīng)力失衡從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷的一種全關(guān)節(jié)慢性退行性疾?。?］，常見于中老年患者，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生緩慢的、進(jìn)行性的、不可逆性的破壞，其病理生理學(xué)復(fù)雜，不僅表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性，還表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨下骨和關(guān)節(jié)滑膜液的改變［2-3］。從分子水平上分析，其主要是由于軟骨細(xì)胞合成和分解代謝途徑之間失衡而改變其原有的代謝穩(wěn)態(tài)［4］，早期的臨床表現(xiàn)為局部癥狀，包括疼痛、僵硬、關(guān)節(jié)活動減少和肌肉無力，長期發(fā)展可能引起全身癥狀，包括身體機(jī)能退化、睡眠受損、疲勞及抑郁，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)功能障礙。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，故目前暫無有效的治療方案，患者首選的治療方案是非手術(shù)治療，包括健康宣教、運(yùn)動治療、體重管理、口服藥物治療、中醫(yī)藥治療等［5-6］，只有在一線和二線治療方案失效后才考慮手術(shù)治療，但昂貴的關(guān)節(jié)置換手術(shù)使得許多患者望而生畏。研究證實黃芩的有效提取物漢黃芩素能夠通過多個途徑抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和軟骨細(xì)胞基質(zhì)的降解，有望成為治療骨關(guān)節(jié)炎的補(bǔ)充及替代療法［7］。核因子（紅血球來源2）樣2 ［nuclear factor （erythroid-derived 2）-like 2，Nrf2］是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，通過細(xì)胞保護(hù)基因來調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)，以響應(yīng)親電和氧化應(yīng)激［8］。最近一項研究表明，Nrf2 的激活對骨關(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用，Nrf2／ARE 信號通絡(luò)的激活能夠保護(hù)機(jī)體免受各種炎癥刺激和氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的侵襲［9］。本文通過分析國內(nèi)外文獻(xiàn)，對漢黃芩素作用于ROS／ERK／Nrf2 信號通路干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展作一綜述，以期為漢黃芩素在骨關(guān)節(jié)炎治療中的進(jìn)一步研究及開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 漢黃芩素的概述

漢黃芩素（5，7-二羥基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮）是從唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi、滇黃芩SratellaruaamoenaC.H.Wright、半枝蓮Scutellaria barbataDon 的根及夾竹桃科植物鱔藤（神葛）Anodendron affine（Hook.et Arn.）Druce 莖中提取的天然黃酮類化合物，主要來源是中藥黃芩。黃芩作為臨床運(yùn)用最廣泛的中草藥之一，屬于清熱解毒類中藥，一般以根入藥，被廣泛用于治療炎性疾病、過敏性疾病、呼吸道和胃腸道的細(xì)菌和病毒感染及腫瘤疾?。?0］。研究證實從黃芩根提取物的主要生物活性成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素［11］，目前已被證實能抑制大鼠肝臟的脂質(zhì)過氧化、減輕心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、抑制NF-κB 信號通路、激活人結(jié)腸癌細(xì)胞和人單核細(xì)胞的Nrf2 信號通路來抑制炎癥相關(guān)的結(jié)直腸癌發(fā)生［12-13］。近年來，黃芩與兒茶的天然混合物被廣泛用于緩解膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)癥狀不適［14-15］，黃芩的活性成分黃芩素和漢黃芩素能夠抑制炎癥反應(yīng)，其抗炎作用是通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和環(huán)氧化酶-2 （cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)來介導(dǎo)的［16-17］。此外，Park 等［18］采用骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞檢測漢黃芩素的抗炎和軟骨保護(hù)作用的研究結(jié)果表明，漢黃芩素能降低炎性因子水平并抑制兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP-3 蛋白的表達(dá)。Khan 等［19］通過HPLC 和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對黃芩進(jìn)行了系統(tǒng)、全面的分析，結(jié)果表明黃芩發(fā)揮抗炎及抗氧化最有效的成分之一是漢黃芩素，并針對漢黃芩素進(jìn)行了體內(nèi)及體外實驗，體內(nèi)實驗結(jié)果表明漢黃芩素能抑制白介素1β（iinterleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解，體外實驗證實了漢黃芩素能抑制IL-1β 誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen activated protein kinase，MAPK）、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和激活因子蛋白-1 （activator protein-1，AP-1）的激活。通過上述實驗結(jié)果表明漢黃芩素能調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種疾病的氧化應(yīng)激，對多種炎性疾病均具有治療作用，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

2 白介素-1β 在骨關(guān)節(jié)炎中的作用

白介素-1β 是一種促炎細(xì)胞因子，由關(guān)節(jié)組織的細(xì)胞產(chǎn)生，包括軟骨細(xì)胞，具有多種化學(xué)和生物活性特征，在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起關(guān)鍵作用，是多種骨關(guān)節(jié)炎分解因子的有效誘導(dǎo)劑，包括基質(zhì)降解金屬蛋白酶 （ matrix metalloproteinase，MMPs）和聚集酶。骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨降解是由基質(zhì)降解蛋白酶和聚集酶的過量產(chǎn)生破壞代謝穩(wěn)態(tài)所致，特別是MMP-3 能降解關(guān)節(jié)軟骨中的蛋白多糖并激活前膠原酶，已被報道能降解細(xì)胞外基質(zhì)的成分如蛋白聚糖，在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要的病理生理作用［4］。IL-1β 還能夠誘導(dǎo)白介素6 （iinterleukin-6，IL-6）、COX-2、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、iNOS、一氧化氮（nitric oxide，NO）等炎癥介質(zhì)的表達(dá)和產(chǎn)生，這些炎性介質(zhì)的表達(dá)和產(chǎn)生都與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)［20-22］。此外，IL-1β 主要由IL-1β的前體（pro-IL-1β）產(chǎn)生，必須通過剪切產(chǎn)生成熟和活躍的細(xì)胞因子IL-1β 才能產(chǎn)生病理學(xué)效應(yīng)。負(fù)責(zé)這種卵裂的細(xì)胞內(nèi)酶是caspase-1，缺乏caspase-1 的動物沒有成熟的IL-1β。IL-1β 的生物學(xué)效應(yīng)可被其天然抑制劑IL-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）和IL-1 誘騙受體（IL-1RⅡ）所抑制，IL-1誘騙受體可以結(jié)合IL-1β 而不傳遞信號［23］。IL-1β 一旦與其Ⅰ型受體（IL-1RⅠ）結(jié)合，可啟動多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使得細(xì)胞內(nèi)Ca2＋增加，PKC、p38、ERK1／2 和JNK 被激活，核因子-κB （NF-κB）、活化轉(zhuǎn)錄因子（ATF）和活化蛋白1（AP1）發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)。IL-1β 在關(guān)節(jié)內(nèi)的表達(dá)增加及與受體IL-1RⅠ的相互作用可導(dǎo)致一系列分子效應(yīng)，每種分子效應(yīng)都在一定程度上參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程［24］。因此，降低局部IL-1β 水平，阻斷其特異性受體或阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要的臨床價值。

3 漢黃芩素對IL-1β 誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用

3.1 漢黃芩素抑制IL-1β 誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥介質(zhì)的表達(dá)和產(chǎn)生 炎癥現(xiàn)在已經(jīng)成為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要介質(zhì)，因為在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)了高水平的炎癥因子，如IL-1β、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNFα）和IL-6。IL-1β 是參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能夠刺激其他炎癥介質(zhì)的表達(dá)［25］。多種炎癥介質(zhì)，如IL-6和COX-2 的釋放引起的炎癥被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的重要組成部分［26］。研究表明黃芩水提物能抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、COX-2 和iNOS 的分泌以及PGE2、NO 的產(chǎn)生［27］。Khan 等［19］研究漢黃芩素對IL-1β 誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞IL-6、COX-2 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示漢黃芩素能夠抑制IL-1β 誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中IL-6、COX-2 基因和蛋白表達(dá)，此外，檢測中還發(fā)現(xiàn)漢黃芩素完全阻斷了IL-1β 刺激骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6 的分泌，這表明漢黃芩素能抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎性因子的表達(dá)。COX-2 通過產(chǎn)生前列腺素（PGE2）發(fā)揮炎癥作用，而PGE2在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中抑制蛋白多糖合成和刺激基質(zhì)降解方面發(fā)揮著重要的作用。因此，Attur 等［28］檢測了漢黃芩素對IL-1β 誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)IL-1β 處理后，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞PGE2表達(dá)顯著增加，使用漢黃芩素預(yù)處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞PGE2表達(dá)被顯著抑制。沈曉慶等［29］研究漢黃芩素治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎 （collagen induced arthritis，CIA）大鼠的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)漢黃芩素降低IL-1β、TNF-α 及白介素-18 （iinterleukin-18，IL-18）的水平； 也能降低核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、pro-caspase-1 及caspase-1 蛋白表達(dá)，提示漢黃芩素可能是通過抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以改善膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。上述的研究結(jié)果提示漢黃芩素可能是通過抑制IL-6、TNF-α、IL-18、COX-2 等炎癥介質(zhì)的表達(dá)和PGE2的水平來阻斷IL-1β 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。

3.2 漢黃芩素抑制IL-1β 誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的氧化和亞硝化應(yīng)激 研究表明，過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），如NO 引起的氧化和亞硝化應(yīng)激激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì) （extracellular matrix，ECM）降解，從而在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［30］。Kimura 等［31］為確定漢黃芩素對IL-1β 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響，通過檢測骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中ROS 的水平來觀察細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-1β 處理骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的氧化敏感染料（dihydrorhodamine，DHR）熒光的表達(dá)升高。這一實驗結(jié)果顯示IL-1β 能誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞ROS 水平升高，相較來看，經(jīng)漢黃芩素預(yù)處理的組別，ROS 水平降低，實驗結(jié)果表明漢黃芩素對IL-1β 誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的ROS 生成具有抑制作用，這也證實漢黃芩素有效的抑制了IL-1β 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。王慧蓮等［32］也證實漢黃芩素可通過激活p38 MAPK 信號通路以誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖，增加其凋亡及ROS 水平，并呈現(xiàn)劑量依賴性。細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)是由細(xì)胞ROS 和還原物質(zhì)谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平之間的平衡維持的，GSH 是最豐富的硫醇抗氧化劑，負(fù)責(zé)解毒ROS，這一過程也消耗GSH［33］，因此，漢黃芩素在抑制IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的ROS 生成時，GSH 水平也應(yīng)該會隨之降低。有研究團(tuán)隊基于熒光檢測方法檢測了軟骨細(xì)胞GSH 水平，結(jié)果顯示漢黃芩素處理骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞后，GSH 水平呈劑量依賴性地降低。這些結(jié)果表明漢黃芩素通過抑制ROS 的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，從而降低細(xì)胞GSH 水平［19］。

為研究漢黃芩素對IL-1β 介導(dǎo)的亞硝化應(yīng)激的影響，Akhtar 等［34］檢測了IL-1β 處理的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的產(chǎn)生情況，實驗結(jié)果表明經(jīng)過IL-1β 刺激的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的NO 分泌增加，使用漢黃芩素預(yù)處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，NO 完全不分泌，這表明漢黃芩素抑制了亞硝化應(yīng)激。NO 是由誘導(dǎo)型iNOS 催化底物精氨酸氨基上的N 與分子氧結(jié)合生成，該酶在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中受炎癥細(xì)胞因子IL-1β 調(diào)控［35］。Khan 等［19］通過研究漢黃芩素對IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞iNOS 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示在IL-1β 處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，iNOSmRNA 的基因表達(dá)比對照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞高數(shù)百倍，而漢黃芩素預(yù)處理則顯著抑制了iNOSmRNA 表達(dá)，這種表現(xiàn)在iNOS 蛋白表達(dá)的結(jié)果上也得到了印證。上述的研究表明，漢黃芩素可通過抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中iNOS 的表達(dá)和ROS、RNS的產(chǎn)生，進(jìn)而有效抑制IL-1β 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激。

3.3 漢黃芩素抑制IL-1β 誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解 由基質(zhì)降解酶如聚集酶和金屬蛋白酶激活引起的基質(zhì)降解是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要機(jī)制之一［36］。MMP-13、MMP-3、MMP-9 和含凝血酶敏感蛋白模體的解整合素樣金屬蛋 白 酶 （ A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs-4，ADAMTS-4）是軟骨細(xì)胞對IL-1β的反應(yīng)產(chǎn)生的主要膠原酶，有助于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)?。?7］。Khan 等［19］研究了漢黃芩素對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中IL-1β誘導(dǎo)的MMPs 和ADAMTS-4 mRNA 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示IL-1β 刺激人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞后，ADAMTS-4、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 表達(dá)升高，而經(jīng)漢黃芩素預(yù)處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞ADAMTS-4、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 表達(dá)降低。MMP-13 是一種參與軟骨降解的主要膠原酶，研究表明經(jīng)IL-1β 刺激后的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-13 分泌增加，然而，經(jīng)漢黃芩素預(yù)處理的軟骨細(xì)胞MMP-13 分泌水平降低，且呈劑量依賴性。此外，Western blot 結(jié)果同樣顯示，經(jīng)漢黃芩素預(yù)處理的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，MMP-13 蛋白表達(dá)降低［38］。在近期的研究中，使用特定的MMPs 抑制劑作為治療骨關(guān)節(jié)炎的思路被引起廣泛的關(guān)注［34］，漢黃芩素能有效抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解蛋白酶的表達(dá)，為骨關(guān)節(jié)炎的防治提供一種新的選擇。

骨關(guān)節(jié)炎的軟骨降解是通過膠原酶介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分（包括2 型膠原和聚蛋白多糖）的消耗發(fā)生的，Khan 等［19］使用體外人類軟骨降解模型探討漢黃芩素是否對成軟骨分化中Ⅱ型膠原A1 （collagen，typeⅡ，alpha 1，COL2A1）和軟骨聚糖蛋白（aggrecan，ACAN）水平有影響。通過檢測漢黃芩素處理、不處理及IL-1β 刺激的人軟骨移植體上清液中COL2A1 和ACAN 的釋放，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-1β處理后的上清液中COL2A1 和ACAN 分泌顯著增加，表明基質(zhì)降解，然而預(yù)先使用漢黃芩素干預(yù)則顯著阻斷IL-1β介導(dǎo)的COL2A1 和ACAN 在培養(yǎng)基中的釋放，并呈劑量依賴性，表明漢黃芩素具有軟骨基質(zhì)保護(hù)能力。Li 等［39］使用體外軟骨降解模型檢測了聚集蛋白降解水平，結(jié)果顯示，與未刺激的對照組比較，使用IL-1β 處理的軟骨外植體培養(yǎng)基中硫酸化糖胺多糖 （sulfated glycosaminoglycan，s-GAG）的釋放顯著增加。然而，漢黃芩素顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨外植體s-GAG 在培養(yǎng)基中的表達(dá)，并呈劑量依賴性。因此，漢黃芩素可能是一種有效的軟骨保護(hù)劑，通過抑制IL-1β 介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)降解，上調(diào)病理條件下人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞軟骨合成因子COL2A1 和ACAN 的表達(dá)，這表明漢黃芩素有可能逆轉(zhuǎn)軟骨細(xì)胞的代謝軸，將分解代謝調(diào)整為合成代謝方向，進(jìn)而來控制疾病進(jìn)展。

通過上述研究可以發(fā)現(xiàn)從黃芩根提取物中分離的漢黃芩素可抑制IL-1β 刺激的氧化應(yīng)激介質(zhì)（ROS、NO）水平，炎癥介質(zhì) （IL-6、COX-2、PGE2、iNOS、NO）表達(dá)和產(chǎn)生，主要蛋白酶（MMP-3、MMP-9、MMP13、ADAMTS4）和s-GAG 的釋放等多種生物學(xué)效應(yīng)來防止軟骨退化［40］。還發(fā)現(xiàn)漢黃芩素通過上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中軟骨合成因子COL2A1、ACAN 表達(dá)來發(fā)揮軟骨保護(hù)能力，具體作用途徑（詳見表1）。因此，可以推測漢黃芩素可能具有軟骨保護(hù)特性，在抑制骨關(guān)節(jié)的誘導(dǎo)和發(fā)病機(jī)制方面有重要價值。基于漢黃芩素的特性，富含漢黃芩素活性組分的中藥可能是潛在治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

4 漢黃芩素通過激活ROS／ERK／Nrf2／HO-1-SOD2-NQO1信號軸來調(diào)節(jié)氧化還原介導(dǎo)的Nrf2／ARE 通路

過度氧化應(yīng)激將觸發(fā)骨關(guān)節(jié)炎信號通路的激活，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡或壞死［30］。誘導(dǎo)線粒體功能障礙、高水平ROS 產(chǎn)生及炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 水平，這些都是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要介質(zhì)［41］。Nrf2 信號通路作為抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)控因子，能調(diào)控抗氧化反應(yīng)基因和Ⅱ期解毒酶的表達(dá)，如醌氧化還原酶1、血紅素氧合酶1、谷胱甘s-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷氨酸-半胱氨酸連接酶、和過氧化物蛋白I，通過增強(qiáng)對細(xì)胞毒性ROS 的清除來對抗組織損傷中的氧化損傷［42］。多項研究表明，Nrf2在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著不可或缺的作用，缺乏它會增加炎癥反應(yīng)的易感性［43-44］。Nrf2 的激活已被證明可以在多種炎癥條件下抑制炎癥通路［45］。為進(jìn)一步證實Nrf2 在漢黃芩素介導(dǎo)的軟骨保護(hù)中的作用，Innamorato 等［45-46］利用特異性siRNA 在人類骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中對Nrf2 進(jìn)行了基因消融，然后用漢黃芩素處理這些軟骨細(xì)胞，并用IL-1β 刺激細(xì)胞，觀察到siRNA 介導(dǎo)的Nrf2 的缺失消除漢黃芩素對IL-1β 誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞IL-6、COX-2、iNOS、MMP-13、ADAMTS-4 mRNA 表達(dá)的抑制以及COL2A1 和ACAN 表達(dá)的上調(diào)，這說明了Nrf2 在病理條件下對漢黃芩素介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥、分解代謝分子表達(dá)的抑制和合成代謝分子的上調(diào)中起著直接的作用。這驗證了漢黃芩素通過調(diào)節(jié)Nrf2／ARE 通路來保護(hù)軟骨，突出了漢黃芩素通過激活人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Nrf2 來抑制關(guān)節(jié)退變和疾病進(jìn)展的潛力。但這一結(jié)論仍需要通過在體實驗進(jìn)一步深入研究。

由于漢黃芩素通過低水平的ROS 生成擾亂了軟骨細(xì)胞的氧化還原平衡，有研究團(tuán)隊通過共聚焦顯微鏡檢測Nrf2在漢黃芩素處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的活化，結(jié)果顯示Nrf2 在軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核中顯著積累［47］。Khan 等［48］對漢黃芩素和Keap1 Kelch 域晶體結(jié)構(gòu)的硅分子進(jìn)行了分子對接研究來解釋漢黃芩素介導(dǎo)Nrf2 激活的分子機(jī)制以確定漢黃芩素是否可以干擾Keap1 和Nrf2 之間的相互作用，結(jié)果表明漢黃芩素能夠有效地與Keap1 蛋白Kelch 結(jié)構(gòu)域中的Arg415 和Asn414 特異性結(jié)合，直接阻斷Keap1 蛋白中Nrf2的結(jié)合位點(diǎn)，從而阻止其泛素化和隨后的降解，導(dǎo)致Nrf2的激活。綜上所述，漢黃芩素治療骨關(guān)節(jié)炎是通過激活氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，干擾其與Keap1 的相互作用來實現(xiàn)的。目前通過直接抑制Keap1-Nrf2 蛋白與蛋白之間的相互作用來調(diào)節(jié)Nrf2 的激活，已經(jīng)成為治療各種疾病的有效分子靶點(diǎn)［49］。

據(jù)報道，一些富含多酚和黃酮類化合物的植物化學(xué)物質(zhì)可以通過激活Nrf2 和誘導(dǎo)血紅素氧合酶1 （Heme oxygenase-1，HO-1）等細(xì)胞保護(hù)酶來保護(hù)細(xì)胞和組織損傷［50］。為確定漢黃芩素介導(dǎo)的Nrf2 激活如何提供軟骨保護(hù)，Khan 等［48］檢測了漢黃芩素對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Nrf2效應(yīng)下游表達(dá)的影響，結(jié)果表明，漢黃芩素誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞超氧化物歧化酶-2 （superoxide dismutase-2，SOD-2）、醌過氧化物還原酶-1 （nicotinamide quinone oxidoreductase-1，NQO-1）及其下游靶基因谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）和HO-1 mRNA 的表達(dá)，并呈劑量和時間依賴性。在漢黃芩素處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，這些分子的蛋白水平也呈時間和劑量依賴性地增加。這表明漢黃芩素介導(dǎo)的ROS 的增加和GSH 的水平下降與Nrf2 激活增加和Nrf2 依賴基因（包括HO-1、GCLC、SOD-2 和NQO-1）轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)。由于PI3K／AKT／GSK3β 是細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)Nrf2 的重要環(huán)節(jié)［51-54］，Gupta 等［53］通過探索PI3K／AKT／GSK3β 信號軸進(jìn)一步研究了漢黃芩素介導(dǎo)Nrf2 激活的分子機(jī)制，然而，結(jié)果顯示漢黃芩素處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞沒有誘導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B （protein kinase B，PKB／Akt）或糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）蛋白磷酸化，這表明漢黃芩素在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中激活Nrf2 不通過調(diào)節(jié)PI3K／AKT／GSK3β 信號軸。最近的研究表明，黃酮類藥物介導(dǎo)的 Nrf2 激活涉及上游細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase1／2，ERK1／2）的磷酸化［54］。Khan 等［48］研究漢黃芩素對骨關(guān)節(jié)炎的治療是否誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞ERK1／2 磷酸化，結(jié)果顯示經(jīng)漢黃芩素處理后，人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞ERK1／2 的磷酸化水平顯著增加，還發(fā)現(xiàn)處理后的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞ROS 的表達(dá)，這可能與ERK1／2 激活有關(guān)，因為ROS 介導(dǎo)的信號通路被認(rèn)為是MAP 激酶活化的重要介質(zhì)。上述研究結(jié)果表明漢黃芩素誘導(dǎo)Nrf2 的激活不是通過PI3K／AKT／GSK3β 信號軸，而是通過激活MAP 激酶ERK1／2 信號通路，示意圖詳見圖1。

圖1 漢黃芩素對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Nrf2 激活機(jī)制示意圖

5 總結(jié)與展望

現(xiàn)有的研究證明天然黃酮類化合物漢黃芩素通過抑制軟骨或者軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥、基質(zhì)降解等關(guān)鍵分子學(xué)效應(yīng)來中發(fā)揮對軟骨和軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，從而延緩骨關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展。漢黃芩素在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)低水平的ROS，可通過激活ROS／ERK／Nrf2／HO-1-SOD2-NQO1 信號軸調(diào)節(jié)氧化還原介導(dǎo)的Nrf2／ARE 通路來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的代謝。目前發(fā)現(xiàn)氧化還原調(diào)節(jié)劑具有抗炎和軟骨保護(hù)劑的潛力，漢黃芩素作為一種有希望的候選藥物，有巨大的開發(fā)利用前景。Nrf2 在骨關(guān)節(jié)發(fā)病中調(diào)節(jié)作用為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的思路，但目前漢黃芩素調(diào)節(jié)Nrf2／ARE 通路對骨關(guān)節(jié)治療的作用機(jī)制尚未完全闡明，在未來的研究中，進(jìn)一步明確漢黃芩素多途徑、多靶點(diǎn)的調(diào)控機(jī)制將為開發(fā)漢黃芩素的衍生物或類似化合物提供有利的條件。