UPLC-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定朱日亨滴丸中15 種成分

布 仁，張彭鵬，王躍武，祖 文，梁方圓，王小寧，陸景坤*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.包頭中藥有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 包頭 014040；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

蒙醫(yī)治療冠心病有悠久的歷史，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，將本病歸屬于“心刺痛” 范疇［1］。朱日亨滴丸源自蒙醫(yī)國(guó)醫(yī)大師蘇榮扎布教授治療“赫依盛型心刺痛” 的多年臨床驗(yàn)方［2］，由廣棗、肉豆蔻、阿魏、紅花、梔子、牛黃、沉香、草果、冰片9 味藥材組成，具有清心熱、化瘀血、補(bǔ)心功效，主治心熱、心赫依、心刺痛、心慌氣短［3-6］。課題組前期對(duì)朱日亨滴丸醇提物中7 種成分進(jìn)行含量測(cè)定［7］，并對(duì)130 種成分進(jìn)行鑒定和歸屬［8］。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)建立超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）法同時(shí)測(cè)定朱日亨滴丸中鞣花酸、沒食子酸、去氫二異丁香酚、甲基丁香酚、欖香素、綠原酸、梔子苷、蘆丁、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、沉香四醇、龍腦、膽酸、牛磺酸、去氧膽酸的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Thermo UltiMate 3000 高效液相色譜儀、Q-Exactive 串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng) （美國(guó)Thermo 公司）； TB-214 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）； 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）； 離心濃縮裝置，配置UT200 冷阱、CVE-3110 離心濃縮組合（東京理化器械株式會(huì)社）。

1.2 試劑 鞣花酸（批號(hào)111959-201903）、沒食子酸（批號(hào)110831-201906）、去氫二異丁香酚（批號(hào)111838-201403）、甲基丁香酚（批號(hào)111642-200301）、綠原酸（批號(hào)110753-202018）、梔子苷（批號(hào) 110749-201919）、蘆丁 （ 批號(hào) 100080-201610）、羥基紅花黃色素 A （批號(hào)111637-201810）、阿魏酸（批號(hào)110773-201614）、沉香四醇（批號(hào)111980-201904）、膽酸（批號(hào)100078-201415）、?；撬幔ㄅ?hào)111616-201605）、去氧膽酸（批號(hào)110724-201808）、龍腦 （批號(hào)111688-200501）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；欖香素對(duì)照品（批號(hào)487-11-6）購(gòu)自北京英萊克發(fā)展有限公司，純度均≥98%。聚乙二醇、二甲基硅油均購(gòu)自江西益普生藥業(yè)有限公司； 吐溫-80 購(gòu)自湖南爾康制藥股份有限公司。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純； 其他試劑均為分析純。

1.3 藥物與藥材 朱日亨滴丸 （編號(hào)D22001、D22002、D22003）由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙藥創(chuàng)新研究中心研制，包頭中藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)。阿魏購(gòu)自亳州抱樸藥業(yè)有限公司，人工牛黃購(gòu)自四川弘茂制藥有限公司，冰片購(gòu)自四川青神康華制藥有限公司，其他7 味藥材均購(gòu)自內(nèi)蒙古億利甘草有限公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)薛培鳳教授鑒定為正品，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 一部規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 精密稱取3 批樣品，每批4 粒（約2.5 g），置于5 mL 量瓶中，加入4 mL 50%乙醇崩解后定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇定容至5 mL，制成貯備液，置于4 ℃冰箱中，取適量轉(zhuǎn)移至量瓶中，流動(dòng)相定容，即得。

2.2 UPLC-MS／MS 分析條件

2.2.1 色譜 Thermo C18色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸（含10 mmol／L 乙酸銨）（B），梯度洗脫（0 ～20 min，10% ～90%A）； 體積流量0.3 mL／min； 柱溫30 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI）； MS dd-ms2掃描模式定性； 一級(jí)全掃模式定量； 正負(fù)離子掃描，負(fù)離子模式下鞘氣體積流量12 L／min，輔助氣體積流量5 L／min，噴霧電壓2.8 kV，毛細(xì)管離子傳輸管溫度350 ℃，S-lens 水平50，掃描范圍m／z100～1 000，而正離子模式下噴霧電壓3.5 kV，其余條件同負(fù)離子模式。采用各化合物準(zhǔn)分子離子峰作為定量監(jiān)測(cè)離子，二級(jí)碎片掃描后與相應(yīng)對(duì)照品二級(jí)碎片進(jìn)行比對(duì)，以期確保所測(cè)色譜峰為目標(biāo)化合物，而非其同分異構(gòu)體或同質(zhì)異素體。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，依次稀釋100、30、20、10、3、2、1 倍，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下供試品溶液3 μL，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得鞣花酸、沒食子酸、去氫二異丁香酚、甲基丁香酚、沉香四醇、欖香素、綠原酸、梔子苷、蘆丁、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、去氧膽酸、膽酸、?；撬?、龍腦峰面積RSD 分別為3.67%、5.16%、3.40%、10.25%、3.18%、9.22%、4.74%、10.55%、2.11%、5.60%、1.99%、2.99%、2.30%、8.65%、4.33%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鞣花酸、沒食子酸、去氫二異丁香酚、甲基丁香酚、沉香四醇、欖香素、綠原酸、梔子苷、蘆丁、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、去氧膽酸、膽酸、牛磺酸、龍腦含量RSD 分別為2.85%、3.00%、5.54%、8.41%、4.25%、4.72%、2.07%、8.16%、3.03%、4.23%、3.41%、6.84%、3.03%、6.23%、4.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.1” 項(xiàng)下供試品溶液適量，于0、1、2、4、8 h 在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鞣花酸、沒食子酸、去氫二異丁香酚、甲基丁香酚、沉香四醇、欖香素、綠原酸、梔子苷、蘆丁、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、去氧膽酸、膽酸、牛磺酸、龍腦峰面積RSD 分別為5.47%、8.89%、3.36%、9.91%、3.98%、9.94%、3.99%、5.42%、1.25%、6.28%、3.18%、1.72%、1.34%、11.31%、2.89%，表明溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的的本品（批號(hào)D22001）6 粒（約1.2 g），按100%水平加入對(duì)照品溶液，按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，鞣花酸、沒食子酸、去氫二異丁香酚、甲基丁香酚、沉香四醇、欖香素、綠原酸、梔子苷、蘆丁、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、去氧膽酸、膽酸、?；撬?、龍腦平均加樣回收率（RSD）分別為105.59% （4.20%）、75.91% （5.31%）、111.81%（7.13%）、105.25% （10.02%）、95.86% （9.40%）、84.36% （4.49%）、107.37% （11.17%）、87.42%（3.19%）、109.14% （3.09%）、90.58% （5.92%）、95.51% （3.33%）、103.39% （10.66%）、95.66%（3.03%）、112.13% （9.83%）、106.06% （3.81%）。

2.4 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n＝3）

3 討論

研究表明，沒食子酸、鞣花酸是朱日亨滴丸君藥廣棗特征成分，去氫二異丁香酚、欖香素、甲基丁香酚是臣藥肉豆蔻特征成分，沉香四醇、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、梔子苷、龍腦分別是沉香、阿魏、紅花、梔子、冰片2020 年版《中國(guó)藥典》 檢測(cè)成分，去氧膽酸、?；撬?、膽酸是人工牛黃主要成分，蘆丁是廣棗、紅花共有成分，綠原酸是紅花、梔子共有成分，沒食子酸是廣棗、紅花共有成分，其中沒食子酸具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎活性［9］，綠原酸、蘆丁均具有糖脂代謝調(diào)控活性［10-11］，去氫二異丁香酚、梔子苷具有顯著的抗炎活性［12-14］，阿魏酸［15-16］、?；撬幔?7］能抑制血小板凝集，羥基紅花黃A 具有保護(hù)心血管活性［18］，鞣花酸具有抗炎、抗氧化活性［19］。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，鞣花酸、甲基丁香酚均可直接或間接調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號(hào)通路，從而減少H9c2 心肌細(xì)胞氧化損傷［20］。

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)不同流動(dòng)相［甲醇-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 甲酸（含10 mmol／L乙酸銨）］、稀釋液（水、30% 甲醇、50% 甲醇、70%甲醇、甲醇）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)50% 甲醇稀釋后乙腈-0.1%甲酸洗脫時(shí)各成分色譜峰峰形、響應(yīng)最優(yōu)。另外，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，各成分線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、加樣回收率RSD 均符合要求，加樣回收率在3.03% ～11.17% 之間，供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定了廣棗、肉豆蔻、沉香、紅花、梔子、人工牛黃、人工冰片中特征成分限量標(biāo)準(zhǔn)，以及草果、阿魏中揮發(fā)油含量。為了改善全產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量控制，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上又增加了8 種質(zhì)控成分，初步表明朱日亨滴丸中原藥材所含有效成分均得到了很好的物質(zhì)傳遞。