基于UHPLC-Q-Orbitrap／MS 的不同產(chǎn)地西洋參皂苷類成分分析

梁力文，郭 娜，劉小康，黃 鑫，蔡廣知，郭云龍*，貢濟(jì)宇*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117； 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117）

西洋參為五加科人參屬植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根［1-2］，又名美國參、洋參、花旗參等，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效［3-5］，其主要含有皂苷類成分，在抗腫瘤、抗炎、降血壓、降血脂、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用［6-11］。

西洋參原產(chǎn)于加拿大安大略、美國威斯康辛州，我國自上世紀(jì)80 年代引種西洋參［12-14］。目前已經(jīng)形成吉林、遼寧、黑龍江、山東等主產(chǎn)區(qū)，由于氣候、海拔、溫度等其他因素的影響，來自不同產(chǎn)區(qū)的西洋參品質(zhì)有差異，地理來源影響了西洋參中皂苷類成分的含量［15-18］。HPLC 法、FT-IR 法用于皂苷類成分鑒定［19-21］。然而，這些方法測(cè)定皂苷數(shù)量有限，液質(zhì)聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)高通量的數(shù)據(jù)采集，并實(shí)現(xiàn)全面的數(shù)據(jù)挖掘彌補(bǔ)了前者的不足，近年來已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜系統(tǒng)的研究。

本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap／MS 技術(shù)結(jié)合主成分分析、正交偏最小二乘法對(duì)吉林、山東、黑龍江、遼寧產(chǎn)西洋參中皂苷類成分進(jìn)行分析，以期為不同產(chǎn)地西洋參的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Ultimate 3000 超高效液相色譜、QOrbitrap-MS／MS 儀 （美國Thermo Fisher Scientific公司）； AB135-S 型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 人參皂苷Rb3、Re、Rg1、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd 及擬人參皂苷F11對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B21052、B21055、B21057、B21050、B21058、B21053、B21051、B21054、B20902，純度均大于98%）。乙腈、磷酸（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 甲醇（色譜純，美國Tedia 公司）； 水為超純水。西洋參來源于4 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)，分別為吉林集安、山東威海、黑龍江綏化、遼寧新賓各10 批，共40 批樣品，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)蔡廣知副教授鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliumL.的干燥根。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取西洋參粉末（過3 號(hào)篩）0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入5 mL 70%甲醇，密封，稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rb3、Re、Rg1、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd 及擬人參皂苷F11對(duì)照品適量，加70%甲醇定容至5 mL 量瓶中，即得。

2.3 色譜條件 Supelco C18色譜柱（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A）-0.1% 甲酸水（B），梯度洗脫（0 ～2 min，15% A； 2 ～15 min，15% ～30% A； 15 ～25 min，30% ～95% A； 25 ～27 min，95% ～15%A； 27 ～35 min，15%A）； 體積流量0.5 mL／min； 柱溫35 ℃； 進(jìn)樣量5 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI）； 負(fù)離子模式； 鞘氣體積流量35 arb； 輔助氣體積流量10 arb；毛細(xì)管電壓-3.5 kV； 毛細(xì)管溫度350 ℃； 掃描范圍m／z150～2 000。

2.5 數(shù)據(jù)采集及分析 按“2.1” “2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品、對(duì)照品溶液，在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得到總離子流圖。通過Sieve 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括去噪、峰提取、峰對(duì)齊、峰識(shí)別和歸一化等。將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.0 軟件，進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析，根據(jù)VIP ＞1 及P＜0.05尋找差異皂苷，并用GraphPad Prism 9 軟件對(duì)不同產(chǎn)地的皂苷類成分的相對(duì)含量進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地西洋參皂苷類成分鑒定 共得到62個(gè)皂苷類化合物。圖1 顯示了不同產(chǎn)地西洋參在負(fù)離子模式下的基峰色譜圖。所鑒定化合物的詳細(xì)信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地西洋參皂苷類成分Tab.1 Saponins of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

圖1 不同產(chǎn)地西洋參在負(fù)離子模式下的基峰色譜圖Fig.1 Basal peak chromatograms of Panacis Quinquefolii Radix from different origins in negative ion model

3.2 主成分分析（PCA）由圖2 可知，QC 樣本聚集保證實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)穩(wěn)定性。4 組樣本完全分離，每組樣本較為集中的聚集為1 類，說明組內(nèi)重復(fù)性較好，存在較好的區(qū)分度。遼寧、吉林、黑龍江樣本最為接近，表明3 地西洋參所含成分最為相似，說明地理位置相近的產(chǎn)地采集的樣本成分具有相似性。山東樣本與其他產(chǎn)地樣本相距均較遠(yuǎn)，表明山東樣本化學(xué)成分與其他產(chǎn)地樣本差異顯著。

圖2 不同產(chǎn)地西洋參PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.3 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）共得到6 組結(jié)果。由圖3 可知，每組2 個(gè)產(chǎn)地樣本相距較遠(yuǎn)，分布在左右兩側(cè)，無任何重疊現(xiàn)象，差異明顯。山東與吉林、山東與遼寧、山東與黑龍江、遼寧與黑龍江、遼寧與吉林、黑龍江與吉林的OPLS-DA 模型解釋程度參數(shù)R2Y分別為0.999、0.995、0.994、0.998、0.999、0.999，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2分別為0.988、0.981、0.981、0.911、0.88、0.956，數(shù)據(jù)表明模型解釋度和預(yù)測(cè)度良好。

圖3 不同產(chǎn)地西洋參OPLS-DA 得分圖及S-plotFig.3 OPLS-DA sore plot and S-plot of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.4 差異成分分析 根據(jù)VIP＞1，P＜0.05 篩選并鑒定得到28 個(gè)不同產(chǎn)地西洋參差異皂苷類化合物，包括原人參二醇型13 個(gè)、原人參三醇型6 個(gè)、齊墩果烷型4 個(gè)、奧克梯隆型2 個(gè)、C-17 側(cè)鏈變異型3 個(gè)。

3.4.1 原人參二醇型 共鑒定得到原人參二醇型皂苷13 個(gè)，見圖4。4 個(gè)產(chǎn)地中丙二酰人參皂苷Rb1、丙二酰人參皂苷Rc、丙二酰人參皂苷Rd，人參皂苷Rb1含量均較高。吉林、黑龍江、遼寧的珠子參苷F5含量相近，且明顯低于山東產(chǎn)地。5種差異成分在山東產(chǎn)西洋參中含量最高，分別為人參皂苷Rc，人參皂苷Rb3、西洋參皂苷Ⅰ、20（S）-人參皂苷Rg3、20 （R）-人參皂苷Rg3。西洋參皂苷Ⅲ在山東產(chǎn)西洋參中含量遠(yuǎn)低于其他產(chǎn)地，吉林產(chǎn)西洋參越南人參皂苷R4及丙二酰人參皂苷Rb2含量較高。綜上所述，原人參二醇型皂苷在4 個(gè)產(chǎn)地中的含量由高到低依次為遼寧、吉林、黑龍江、山東。

3.4.2 原人參三醇型 原人參二醇型和原人參三醇型皆是西洋參主要皂苷類型，共鑒定得到原人參三醇型皂苷6 個(gè)，見圖5。山東產(chǎn)西洋參人參皂苷Re 含量低于其他產(chǎn)地。山東產(chǎn)西洋參野三七皂苷E 含量遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地，可作為山東產(chǎn)地的標(biāo)志性成分。吉林產(chǎn)西洋參三七皂苷R1含量最高。3 種差異成分在遼寧產(chǎn)西洋參中含量最高，分別為人參皂苷Rg1、丙二酰人參皂苷Re、20 （S）-人參皂苷Rg2。綜上所述，原人參三醇型皂苷在4 個(gè)產(chǎn)地中的含量由高到低依次為遼寧、吉林、黑龍江、山東。

圖5 不同產(chǎn)地西洋參原人參三醇型皂苷含量柱形圖Fig.5 Histogram of protopanaxatriol-type saponin content of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.4.3 其他 4 個(gè)產(chǎn)地西洋參樣品中鑒定出差異皂苷類化合物，齊墩果烷型4 個(gè)，分別為人參皂苷Ro、屏邊三七皂苷R2、竹節(jié)人參皂苷Ⅳ、竹節(jié)人參皂苷Ⅱ； 奧克梯隆型2 個(gè)，分別為越南人參皂苷R1、24 （R）-擬人參皂苷F11； C-17 側(cè)鏈變異型3個(gè)，分別為西洋參皂苷L11、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rg5，見圖6。在4 個(gè)產(chǎn)地中，C-17 側(cè)鏈變異型皂苷含量遠(yuǎn)低于其他類型皂苷，吉林和黑龍江產(chǎn)西洋參的齊墩果烷型皂苷含量相近且較高。在奧克梯隆型皂苷中，山東產(chǎn)西洋參越南人參皂苷R1含量最高，遼寧產(chǎn)西洋參24 （R）-擬人參皂苷F11含量最高。綜上所述，山東、吉林、遼寧、黑龍江地區(qū)西洋參皂苷存在一定差異，地理位置，環(huán)境條件的不同可能是導(dǎo)致差異的主要原因。

圖6 不同產(chǎn)地西洋參齊墩果烷型、奧克梯隆型、C-17 側(cè)鏈變異型皂苷含量柱形圖Fig.6 Histogram of oleanolane-type，oxytetracycline-type and C-17 side chain variant saponin content of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

4 討論

西洋參作為名貴中藥材，近年來市場(chǎng)需求增大。目前，國內(nèi)西洋參主產(chǎn)于東北及華東地區(qū)。西洋參種植由山東、吉林等傳統(tǒng)產(chǎn)地大規(guī)模向新產(chǎn)區(qū)擴(kuò)展，其盲目引種及擴(kuò)大產(chǎn)區(qū)，致使藥材的質(zhì)量下降，因此，建立一種快速區(qū)分不同產(chǎn)地西洋參的方法對(duì)其質(zhì)量控制具有重要意義。

本研究通過UHPLC-Q-Orbitrap／MS 技術(shù)，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)不同產(chǎn)地西洋參進(jìn)行分析，4 個(gè)不同產(chǎn)地西洋參有很好的分離度，表明不同產(chǎn)地可引起西洋參相關(guān)成分發(fā)生顯著變化。為了消除組內(nèi)差異的影響，采用OPLS-DA 對(duì)山東、吉林、黑龍江、遼寧產(chǎn)的西洋參兩兩組合分別進(jìn)行分析，結(jié)果表明所分析的數(shù)據(jù)沒有過度擬合。研究發(fā)現(xiàn)4 個(gè)產(chǎn)地樣本之間主要代謝物人參皂苷類成分存在差異，各產(chǎn)地西洋參皂苷類成分種類相近但含量有所不同，遼寧產(chǎn)西洋參皂苷含量較為突出。OPLS-DA 篩選得到28 個(gè)差異化合物，包括原人參二醇型13 個(gè)、原人參三醇型6 個(gè)、齊墩果烷型4 個(gè)、奧克梯隆型2個(gè)、C-17 側(cè)鏈變異型3 個(gè)，原人參二醇型和原人參三醇型皂苷在4 個(gè)產(chǎn)地相對(duì)含量由高到低依次為遼寧、吉林、黑龍江、山東。主要差異性成分的表征可為不同產(chǎn)地西洋參差異研究提供基礎(chǔ)。本研究只收集了4 個(gè)產(chǎn)地的西洋參樣品，但還未收集到市面上所有產(chǎn)地的西洋參樣品，在西洋參產(chǎn)地后續(xù)的研究中，可以考慮盡可能的收集更多產(chǎn)地的西洋參。使覆蓋面更廣，以期早日建立涵蓋所有西洋參產(chǎn)地的差異性皂苷數(shù)據(jù)庫。

綜上所述，本研究揭示了國內(nèi)主要西洋參產(chǎn)地中皂苷成分的差異性，為西洋參不同產(chǎn)地鑒別、應(yīng)用及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。