柴胡疏肝散對(duì)卒中后抑郁大鼠行為學(xué)及腦區(qū)5-HT2A、BDNF 表達(dá)的影響

賈 奎，馮 龍，黃晨杰，李金耀

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100）

近年來，腦血管病發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重影響人們身心健康。卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）繼發(fā)于腦卒中，是其重要的并發(fā)癥，具有發(fā)病率高、臨床癥狀改善率低等特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)主要包括情緒低落、失眠多夢(mèng)、快感缺失、興趣喪失、學(xué)習(xí)記憶能力下降、運(yùn)動(dòng)功能減退。PSD 可加快卒中后并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，延緩甚至阻斷腦卒中的康復(fù)，如何早期干預(yù) PSD 的發(fā)生具有重要意義［1-2］。

研究表明，PSD 的發(fā)生主要由原發(fā)內(nèi)源性機(jī)制學(xué)說中的神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)因子介導(dǎo)［3-4］。作為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)受體的5-HT2A 是一種抑制受體，激活其表達(dá)可降低神經(jīng)元興奮性，其受體所在神經(jīng)元在受到細(xì)胞水腫、壞死及凋亡的影響后會(huì)造成腦干與大腦皮質(zhì)通路障礙，進(jìn)而影響腦內(nèi)情感調(diào)節(jié)，該因子也常用作衡量PSD 發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)［5］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育、分化、功能維持以及可塑性的作用，大腦中BDNF 含量降低常提示神經(jīng)元營養(yǎng)供給的缺失，對(duì)神經(jīng)元生長及功能分化有不可逆轉(zhuǎn)的加速作用［6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)關(guān)于柴胡疏肝散治療PSD 的靶點(diǎn)研究較少［7-9］。本研究通過檢測(cè)柴胡疏肝散干預(yù)PSD 大鼠抑郁樣行為及額前皮質(zhì)與紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 表達(dá)變化，驗(yàn)證其對(duì)PSD 大鼠抑郁樣行為的改善及干預(yù)PSD發(fā)生發(fā)展的作用，探索柴胡疏肝散治療PSD 的靶點(diǎn)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)成年雄性SD 大鼠54 只，體質(zhì)量（250±10）g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （魯）2019-0003］，飼養(yǎng)于室溫25 ℃、相對(duì)濕度55%條件下，自由攝食進(jìn)水，自然晝夜節(jié)律光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)EC-022-094）。

1.2 藥物 柴胡疏肝散由醋柴胡12 g、川芎9 g、陳皮9 g、醋香附9 g、麩炒枳殼9 g、赤芍9 g、炙甘草3 g 組成，購自中國北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司； 鹽酸氟西汀膠囊（規(guī)格20 mg／片，國藥準(zhǔn)字H19980114）購自上海上藥中西制藥有限公司。

1.3 試劑 RNA 提取液、Servicebio ? RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix （None ROX）、β-actin 抗體 （貨號(hào)G3013、G3330、G3320、GB12001，武漢賽維爾生物科技有限公司）； GAPDH 抗體、5-HT2A 抗體、BDNF 抗體 （貨號(hào)ab8245、ab66049、ab108319，英國Abcam 公司）。

1.4 儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（新加坡Life 公司）； 全波長酶標(biāo)儀（美國MD 公司）； 倒置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)（德國卡爾蔡司公司）； 曠場(chǎng)、Morris 水迷宮器材及行為學(xué)軟件SMAR3.0 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型建立 實(shí)驗(yàn)前測(cè)定大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)（sucrose prefererce test，SPT）、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open-field test，OFT）及Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)（water maze test，WMT）基線值，篩選評(píng)分相近的54 只入組。隨機(jī)分成空白組（9 只）、假手術(shù)組（9 只）、PSD 組（36 只），其中PSD 組分為模型組、柴胡疏肝散組、氟西汀組、聯(lián)合用藥組，每組9 只。PSD 組參照Longa 線栓法復(fù)制大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occusion，MCAO）模型，采用經(jīng)右側(cè)頸總支動(dòng)脈分叉處插入線栓，栓塞時(shí)長1.5 h，以阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈血流，制備大腦缺血再灌注 （ischemia／reperfusion，I／R）模型 （即腦卒中模型）。假手術(shù)組大鼠麻醉并暴露頸總動(dòng)脈后不予處理并縫合切口，空白組不做處理。術(shù)后24 h 選取評(píng)分≥1 分且＜4 分（按照Longa 標(biāo)準(zhǔn)）的腦卒中模型大鼠，于術(shù)后第2 天，參照慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激 （chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型制備方法建立PSD 大鼠模型，①禁食20 h； ②禁飲17 h； ③45 ℃斜置鼠籠17 h；④持續(xù)照明17 h； ⑤電擊足底（電壓60 mV，間隔5 s 刺激1 次，每次持續(xù)10 s，共20 次）； ⑥4 ℃游泳5 min； ⑦水平搖晃5 min； ⑧行為約束2 h；⑨夾尾1 min。為避免大鼠對(duì)單一或有規(guī)律的應(yīng)激刺激產(chǎn)生耐受性，PSD 組采用多種不可預(yù)知的刺激方法交替進(jìn)行，并采用單籠飼養(yǎng)，以上9 種應(yīng)激每天隨機(jī)采取1 種，共刺激4 周。

2.2 給藥 術(shù)后第28 天（即PSD 模型建立完成）開始給予藥物灌胃處理，模型組給予生理鹽水； 柴胡疏肝散組給予2 mg／kg 柴胡疏肝散混懸液； 氟西汀組給予12.5 mg／kg 氟西汀混懸液； 聯(lián)合用藥組給予柴胡疏肝散2 mg／kg＋氟西汀12.5 mg／kg 混懸液，灌胃體積5 mL／kg，每天固定時(shí)間灌胃1 次，連續(xù)4 周。

2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開始后，每周固定時(shí)間對(duì)大鼠進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測(cè)及卒中后抑郁行為學(xué)評(píng)分，包括蔗糖偏好率、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn) 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)是反映大鼠快感缺失的一種實(shí)驗(yàn)，其損害是臨床PSD 的一個(gè)基本特征。蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)開始前禁食禁水20 h，并孤養(yǎng)每只大鼠，給予鼠籠左側(cè)1 瓶1%蔗糖水、右側(cè)1 瓶純水，監(jiān)測(cè)1 h 內(nèi)2 瓶水的消耗量。蔗糖偏好率＝ ［蔗糖水消耗量／ （蔗糖水消耗量＋純水消耗量）］×100%。

2.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)反映了大鼠探索未知的興趣高低，其損害也是臨床PSD 的一個(gè)基本特征。實(shí)驗(yàn)開始前1 h，將大鼠置于測(cè)試實(shí)驗(yàn)室以適應(yīng)環(huán)境。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置為長100 cm、寬100 cm、高40 cm、內(nèi)空的立柱體敞箱，以大鼠5 min 內(nèi)運(yùn)動(dòng)距離作為曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)得分。

2.3.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)用來衡量大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其損害也是臨床PSD 的一個(gè)基本特征。該實(shí)驗(yàn)裝置為一直徑約2 m 的圓柱恒溫游泳池，水深25 cm，水溫（24 ±1）℃，分為A 區(qū)、B 區(qū)、C 區(qū)、D 區(qū)及平臺(tái)。在大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周時(shí)間段內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行Morris 水迷宮訓(xùn)練，每個(gè)區(qū)作為一個(gè)階段的訓(xùn)練，每個(gè)階段訓(xùn)練3 次，A區(qū)、B 區(qū)、C 區(qū)、D 區(qū)共計(jì)4 個(gè)區(qū)域，總計(jì)訓(xùn)練4 d。實(shí)驗(yàn)記錄大鼠5 min 內(nèi)越過平臺(tái)的次數(shù)，作為Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)活動(dòng)得分。

2.4 RT-qPCR 法檢測(cè)大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNFmRNA 表達(dá) 采用RNA 抽提試劑盒提取腦組織額前皮質(zhì)與紋狀體區(qū)標(biāo)本總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后對(duì)5-HT2A和BDNF基因進(jìn)行半定量分析。PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火／延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線反應(yīng)條件為65 ℃升溫至95 ℃，每升溫0.5 ℃，采集1 次熒光信號(hào)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算5-HT2A、BDNFmRNA 相對(duì)表達(dá)。通過 Primer Bank 引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.5 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A 及BDNF 陽性細(xì)胞表達(dá) 各組大鼠選取額前皮質(zhì)與紋狀體區(qū)同一位置腦組織，于中性甲醛中固定24 h，石蠟包埋，作冠狀切片，每只大鼠選取3 張切片進(jìn)行5-HT2A 及BDNF 蛋白免疫組織化學(xué)法染色。于顯微鏡下觀察額前皮質(zhì)與紋狀體區(qū)5-HT2A 及BDNF 蛋白定位，通過Image pro plus 6.0 圖像分析軟件分析5-HT2A 及BDNF 陽性細(xì)胞表達(dá)。

2.6 Westren blot 法檢測(cè)大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A 及BDNF 蛋白表達(dá) 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后處死大鼠，將大腦迅速移除，并剝離出海馬組織，立即用液氮冷凍。按照蛋白免疫印跡法依次進(jìn)行組織總蛋白提取、蛋白濃度測(cè)定、蛋白變性、于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?隨后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、凝膠圖像分析；最后將膠片進(jìn)行掃描存檔，通過Alpha 軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，當(dāng)計(jì)量資料為正態(tài)分布時(shí)，以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性時(shí)，兩兩之間比較采用最小顯著差異法分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠體質(zhì)量及抑郁樣行為的影響 表2 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、蔗糖偏好率、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)距離、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)降低（P＜0.01），表明PSD 模型成功建立； 與模型組比較，柴胡疏肝散組、氟西汀組和聯(lián)合用藥組大鼠體質(zhì)量、蔗糖偏好率、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)距離、Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)均升高（P＜0.01），表明柴胡疏肝散逆轉(zhuǎn)了CUMS 誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為。

表2 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠體質(zhì)量及抑郁樣行為的影響（x±s，n＝9）Tab.2 Effects of Chaihu Shugan Powder on body weight and depression-like behaviors in PSD rats （±s，n＝9）

表2 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠體質(zhì)量及抑郁樣行為的影響（x±s，n＝9）Tab.2 Effects of Chaihu Shugan Powder on body weight and depression-like behaviors in PSD rats （±s，n＝9）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，**P＜0.01。

組別體質(zhì)量／g蔗糖偏好率／%運(yùn)動(dòng)距離／m穿越平臺(tái)次數(shù)／次空白組529.56±27.1679.00±5.1797.73±7.326.89±1.05假手術(shù)組534.67±69.3277.33±6.3195.86±11.077.22±1.30模型組383.67±25.54＃＃48.33±4.58＃＃47.49±12.21＃＃3.11±1.76＃＃柴胡疏肝散組449.78±33.53**72.89±4.60**84.30±8.46**5.89±1.05**氟西汀組445.44±30.62**76.67±3.43**82.14±9.85**5.33±1.12**聯(lián)合用藥組463.89±21.50**76.67±5.07**88.81±8.46**5.78±1.39**

3.2 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNFmRNA 表達(dá)的影響 如圖1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNFmRNA 表達(dá)均降低（P＜0.01）； 與模型組比較，柴胡疏肝散組、氟西汀組和聯(lián)合用藥組大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNFmRNA表達(dá)均升高（P＜0.01）。

圖1 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF mRNA 表達(dá)的影響（x±s，n＝3）Fig.1 Effects of Chaihu Shugan Powder on 5-HT2A and BDNF mRNA expressions in frontal cortex and striatum of PSD rats （x±s，n＝3）

3.3 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 陽性細(xì)胞表達(dá)的影響 如圖2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 陽性細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.01）； 與模型組比較，柴胡疏肝散組、氟西汀組和聯(lián)合用藥組大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 陽性細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量均升高 （P＜0.01）。

圖2 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 陽性細(xì)胞表達(dá)的影響（×200，x±s，n＝3）Fig.2 Effects of Chaihu Shugan Powder on the expressions of 5-HT2A and BDNF positive cells in frontal cortex and striatum of PSD rats （×200，x±s，n＝3）

3.4 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01）； 與模型組比較，柴胡疏肝散組、氟西汀組和聯(lián)合用藥組大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 蛋白表達(dá)均升高 （P＜0.01）。

圖3 柴胡疏肝散對(duì)PSD 大鼠額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 蛋白表達(dá)的影響（x±s，n＝3）Fig.3 Effects of Chaihu Shugan Powder on the protein expressions of 5-HT2A and BDNF in the frontal cortex and striatum of PSD rats （x±s，n＝3）

4 討論

作為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)受體之一的5-HT2A，源自于腦干中線中縫核的神經(jīng)元，并上升投射在皮質(zhì)、邊緣及中腦等區(qū)域，而紋狀體接受來自額前皮質(zhì)區(qū)的纖維投射，主要協(xié)調(diào)各種精細(xì)復(fù)雜的運(yùn)動(dòng)［10-15］。Mitazaki 等［16］通過對(duì)大鼠注射抗精神病藥物的研究發(fā)現(xiàn)，額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A 增加可改善神經(jīng)發(fā)育模型大鼠的行為缺陷。BDNF 對(duì)神經(jīng)元的生長發(fā)育起重要作用，能有效改善腦卒中患者的神經(jīng)功能，是維持神經(jīng)生存及正常生理功能所必需的蛋白質(zhì)［17-18］。Zhang 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，BDNF可作為預(yù)測(cè)腦卒中患者發(fā)生PSD 風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物。柴胡疏肝散由醋柴胡、川芎、陳皮、醋香附、麩炒枳殼、赤芍、炙甘草等中藥組成，具有疏肝氣、解郁結(jié)、化痰濁、通腦竅、安神志等多種功效，具有較好的對(duì)癥PSD 的作用。李倩等［20］研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散加減聯(lián)合經(jīng)顱電刺激對(duì)PSD 患者的治療效果較好，可減輕PSD 患者抑郁、焦慮程度，增強(qiáng)上肢運(yùn)動(dòng)能力，提高認(rèn)知功能。深入探討柴胡疏肝散是否通過增強(qiáng)5-HT2A 及BDNF 表達(dá)來改善卒中后抑郁樣行為，有助于明確其治療PSD的靶點(diǎn)。

PSD 臨床表現(xiàn)主要包括情緒低落、快感缺失、興趣喪失、學(xué)習(xí)記憶能力下降、運(yùn)動(dòng)功能減退、探索欲望減低等。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、蔗糖偏好率、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離、Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)減少，表明PSD 模型成功建立； 而柴胡疏肝散、氟西汀和聯(lián)合用藥后能提高體質(zhì)量、蔗糖偏好率、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離、Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)，表明這2 種藥物及其聯(lián)合用藥對(duì)大鼠行為學(xué)產(chǎn)生了良性影響，逆轉(zhuǎn)了CUMS 誘導(dǎo)的抑郁樣行為。本研究還發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散、氟西汀和聯(lián)合用藥組大鼠額前皮質(zhì)與紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNFmRNA 表達(dá)、陽性細(xì)胞表達(dá)和蛋白表達(dá)較模型組升高，結(jié)合行為學(xué)結(jié)果可知，這2 種藥物及其聯(lián)合用藥可能通過增加額前皮質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT2A 和BDNF 的表達(dá)進(jìn)而逆轉(zhuǎn)CUMS 誘導(dǎo)的抑郁樣行為。同時(shí)，單用柴胡疏肝散對(duì)于PSD 大鼠體質(zhì)量、抑郁樣行為及額前皮質(zhì)與紋狀體區(qū)5-HT2A、BDNF 表達(dá)的改善作用不弱于氟西汀和聯(lián)合用藥組，提示柴胡疏肝散具有較好的單用治療優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，柴胡疏肝散可通過干預(yù)PSD 大鼠模型腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT2A 及BDNF 蛋白因子的釋放改善卒中后抑郁樣行為，這可能為研究柴胡疏肝散對(duì)PSD 的作用機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究?jī)H為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，柴胡疏肝散是否具有改善PSD 患者抑郁癥狀仍有待于進(jìn)一步探討，本實(shí)驗(yàn)也需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并對(duì)研究方案進(jìn)行優(yōu)化。