石蒜屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)學(xué)研究

付文佛，肖 濤，張永洪*

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.個(gè)舊市第十三中學(xué)，云南 個(gè)舊 661011)

石蒜屬Lycoris隸屬于石蒜科Amaryllidaceae，在全世界有20 余種，其中我國(guó)分布有15 種(含1 變種)，12 種為我國(guó)特有，主要分布于長(zhǎng)江流域至華東、華南、華中、西南等多個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)[1—3]。近年來，石蒜屬有7 個(gè)新類群被發(fā)現(xiàn)和命名，包括春曉石蒜L.chunxiaoensis[4]、秀麗石蒜Lycoris×jinzheniae[5]、長(zhǎng)葉石蒜L.longifolia[6]、海濱石蒜L.insularis[7]、武陵石蒜L.wulingensis[8]、秦嶺石蒜L.tsinlingensis[9]和湖北石蒜Lycoris×hubeiensis[10]。其中，秀麗石蒜在過去30年里一直被錯(cuò)誤地命名為乳白石蒜Lycoris×albiflora[5]。另外，秦衛(wèi)華等[11]于2021年發(fā)表了石蒜科一新屬，即守標(biāo)蒜屬Shoubiaonia， 僅有云南守標(biāo)蒜Shoubiaonia yunnanensis一種，該屬具有的先花后葉、3 裂柱頭和較多小苞片等特征能夠與石蒜屬物種區(qū)別開來。石蒜屬植物極具觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值。因其獨(dú)特的觀賞價(jià)值，被廣泛用作鮮切花、盆景觀賞以及地被植物[12]。目前，在石蒜屬植物內(nèi)發(fā)現(xiàn)80 余種生物堿成分，其中部分生物堿具有抗老年癡呆、抗腫瘤、抗病毒等生物活性，還能作用于心血管系統(tǒng)[13—17]。由于石蒜屬植物存在種間天然雜交和種內(nèi)形態(tài)具有較大變異等情況，使得石蒜屬的系統(tǒng)分類和物種鑒定存在一定的困難[18]。Traub 等[19]曾經(jīng)依據(jù)花型和雄蕊長(zhǎng)度，將石蒜屬分為整齊花亞屬 subgen.Symmanthus和石蒜亞屬subgen.Lycoris。徐炳聲等[20]結(jié)合《中國(guó)植物志》和Traub & Moldenke(1949)分類體系，于1995年重新整理了分布于東南亞的石蒜屬植物，將其合并為20 個(gè)種，仍然劃分為整齊花亞屬和石蒜亞屬。然而，近年來對(duì)石蒜屬物種基于形態(tài)分支分類和分子系統(tǒng)學(xué)研究的結(jié)果不支持傳統(tǒng)的石蒜屬分亞屬的分類處理[21—25]。迄今為止，對(duì)于石蒜屬的一些系統(tǒng)分類、鑒定和部分天然雜交種的分類與起源仍存在較多爭(zhēng)議。

被子植物葉綠體基因組大多具有典型的四分體結(jié)構(gòu)，即存在一對(duì)編碼相同基因但方向相反的重復(fù)區(qū)(Inverted Repeat，IR)，一般長(zhǎng)6～76 kbp。它們之間有一個(gè)大單拷貝區(qū)(Large Single-copy Region，LSC)和一個(gè)小單拷貝區(qū)(Small Single-copy Region，SSC)[26]。植物葉綠體基因組序列具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)葉綠體基因組含有大量的遺傳信息，為比較研究提供了一個(gè)良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[27]；(2)葉綠體DNA 的核苷酸置換率較為適中，使其被廣泛應(yīng)用；(3)由于葉綠體基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的分子進(jìn)化速度差異巨大，故適用于不同階層的系統(tǒng)學(xué)研究[28]；(4)葉綠體基因組較小，全基因組序列更容易測(cè)得，且各植物類群葉綠體基因組之間具有良好的共線性，為比較分析提供了便利；(5)葉綠體基因組一般為單親遺傳，不存在基因重組等問題[29]。因此，近年來葉綠體基因組在分子進(jìn)化及系統(tǒng)發(fā)育研究中被廣泛應(yīng)用，并在分析科、族、屬乃至于屬下種間的系統(tǒng)關(guān)系方面發(fā)揮了重要作用。此外，通過葉綠體基因組結(jié)構(gòu)比較能夠發(fā)現(xiàn)種間序列變異和識(shí)別高變異區(qū)與簡(jiǎn)單重復(fù)和散在重復(fù)序列等分子標(biāo)記位點(diǎn)，有助于物種的遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育分析[30—31]。

目前，對(duì)于石蒜屬的研究主要集中于繁殖和栽培技術(shù)、化學(xué)成分和藥理性質(zhì)以及育種等方面，而對(duì)其系統(tǒng)學(xué)方面的研究，多是基于葉綠體基因片段，少有利用葉綠體全基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究?；诖耍狙芯坷靡压嫉?7 條石蒜屬植物葉綠體全基因組序列，分析其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，并結(jié)合石蒜科其他屬物種的葉綠體全基因組序列進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，為石蒜屬的系統(tǒng)分類和種間親緣關(guān)系研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/organelle/)下載已公布的石蒜屬17 個(gè)物種葉綠體全基因組序列(表1)。

表1 石蒜屬17 個(gè)物種葉綠體基因組序列信息Table 1 Chloroplast genome information of 17 taxa of Lycoris

1.2 基因組基本信息分析

利用Geneious v2020.0.5 軟件對(duì)石蒜屬葉綠體基因組序列的基本信息[32]，包括序列長(zhǎng)度、四個(gè)分區(qū)長(zhǎng)度、GC 含量等情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。通過在線軟件OGDRAW 繪制石蒜屬植物的葉綠體基因組物理圖譜[33]。

1.3 簡(jiǎn)單重復(fù)序列和散在重復(fù)序列分析

使用在線工具M(jìn)ISA-web(https://webblast.ipkgatersleben.de/misa/index.php)對(duì)17 種石蒜屬植物的葉綠體基因組序列中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)進(jìn)行識(shí)別和統(tǒng)計(jì)，其參數(shù)設(shè)置為：?jiǎn)魏塑账帷?0 個(gè)重復(fù)單元，二核苷酸≥5 個(gè)重復(fù)單元，三核苷酸≥4 個(gè)重復(fù)單元，四、五、六核苷酸≥3 個(gè)重復(fù)單元[34]。借助線上軟件REPuter[35]統(tǒng)計(jì)散在重復(fù)序列(Interspersed repeat)。散在重復(fù)序列包括正向重復(fù)(Forward repeats)、反向重復(fù)(Reverser repeats)、回文重復(fù)(Palindromicp repeats)和互補(bǔ)重復(fù)(Complementc repeats)，其參數(shù)設(shè)置的最小長(zhǎng)度(Minimal Repeat Size)為30 bp，最多堿基錯(cuò)配(Hamming Distance)為3。

1.4 密碼子偏好性和IR 區(qū)邊界分析

利用軟件MEGA 7 對(duì)葉綠體基因組中蛋白編碼基因編碼的密碼子數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[36]，并計(jì)算相對(duì)同義密碼子使用度(RSCU)，再將分析好的數(shù)據(jù)利用TBtools 進(jìn)行可視化[37]。使用在線分析軟件IRscope對(duì)IR 區(qū)邊界進(jìn)行可視化分析[38]。

1.5 基因組比較及共線性分析

通過在線軟件mVISTA 并選用安徽石蒜L.anhuiensis的注釋文本為參考注釋[39]，選擇Shuffle-LAGAN 模式對(duì)全基因組序列進(jìn)行比較分析。使用軟件MAFFT v7.450 對(duì)所有的序列在默認(rèn)參數(shù)下進(jìn)行比對(duì)[40]，比對(duì)完成后利用Mauve 軟件進(jìn)行共線性分析[41]。

1.6 核苷酸多態(tài)性分析

將比對(duì)完成的序列通過DnaSPv5.10 進(jìn)行核苷酸多態(tài)性(Pi)分析[42]。將其參數(shù)設(shè)置為步長(zhǎng)(Step size)500 bp 和窗口大小(Window length)1000 bp。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了解石蒜屬植物在科內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育地位和屬內(nèi)的系統(tǒng)關(guān)系，選取石蒜屬17 個(gè)物種和石蒜科其他屬的物種(22 屬43 種)并以百合科滇百合Lilium bakerianum(NC_035592)、高山貝母Fritillariafusca(NC_060547)作為外類群基于葉綠體全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建。所有序列用MAFFT v7.450 軟件在默認(rèn)參數(shù)下進(jìn)行序列比對(duì)[40]。最佳核酸替代模型經(jīng)Modeltest v3.7 軟件基于Akaike Information Criterion(AIC)計(jì)算后均為General Time Reversible+Gamma distribution(GTR+G)模型[43]。選擇最大似然法(Maximumm likelihood，ML)和貝葉斯法(Bayesian inference，BI)進(jìn)行建樹。最大似然法使用RAxML v8.2.11 軟件，循環(huán)次數(shù)設(shè)為 1000(bootstrap:1000)[44]。貝葉斯分析利用MrBayes 3.2.6 軟件，設(shè)置運(yùn)行20 000 000 代[45]。

2 結(jié)果與分析

2.1 石蒜屬葉綠體基因組基本結(jié)構(gòu)特征

石蒜屬物種的葉綠體基因組表現(xiàn)為四分體環(huán)形結(jié)構(gòu)，即由大單拷貝(LSC)區(qū)、小單拷貝(SSC)區(qū)以及兩個(gè)反向重復(fù)(IR)區(qū)組成(圖1)。石蒜屬物種葉綠體基因組長(zhǎng)度差異不大，其基因組長(zhǎng)度在158 335～158 761 bp 之間，其中最長(zhǎng)的是血紅石蒜L.sanguinea，長(zhǎng)度為158 761 bp，最短的是石蒜L.radiata，長(zhǎng)度為158 335 bp，二者葉綠體基因組序列長(zhǎng)度差異僅426 bp；總GC 含量為37.7%～37.8%；LSC 區(qū)長(zhǎng)度86 431～86 613 bp，GC 含量35.8%～35.9%；SSC 區(qū)長(zhǎng)度18 160～18 555 bp，GC 含量31.8%～32.0%；IR 區(qū)長(zhǎng)度26 729～26 923 bp，GC含量42.9%～43.0%。石蒜屬17 個(gè)物種的基因數(shù)量存在差異。血紅石蒜、換錦花L.sprengeri、長(zhǎng)筒石蒜L.longituba和中國(guó)石蒜L.chinensis四個(gè)物種的基因數(shù)量為137；其余13 個(gè)物種的基因數(shù)量為133，ycf15 和ycf68 基因丟失，而在上述4 個(gè)物種中，這兩基因有兩個(gè)拷貝。ycf15 和ycf68 基因?yàn)椴痪幋a蛋白質(zhì)的假基因，因此17 種石蒜屬植物除了基因數(shù)目存在差異外，CDS、rRNA 基因、tRNA 基因數(shù)量相同，分別為87 個(gè)、38 個(gè)、8 個(gè)(表1)。17 種植物的葉綠體基因按照功能可分為四類：遺傳系統(tǒng)中用于自我復(fù)制的基因(76 個(gè))、光合系統(tǒng)基因(45 個(gè))、其他基因(6 個(gè))、未知功能基因(6～10 個(gè))。其中rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23、rps7、rps12、rps19、trnA-UGC、trnH-GUG、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR- ACG、trnV-GAC、rpl2、rpl23、ndhB、ycf1、ycf2 等20 個(gè)基因有兩個(gè)拷貝，其余為單拷貝基因(表2)。

圖1 石蒜屬葉綠體基因組圖譜Fig.1 Genome map for the plastomes of Lycoris

表2 石蒜屬植物葉綠體基因組的基因功能分類組成Table 2 Functional genes composition of the chloroplast genome of Lycoris

2.2 散在重復(fù)序列和簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

在石蒜屬17 個(gè)物種中檢測(cè)到的散在重復(fù)序列數(shù)量在41～57 個(gè)之間，共統(tǒng)計(jì)到810 個(gè)。其中，回文重復(fù)459 個(gè)、正向重復(fù)276 個(gè)、反向重復(fù)74 個(gè)、互補(bǔ)重復(fù)1 個(gè)(僅在中國(guó)石蒜)。散在重復(fù)序列主要位于LSC 區(qū)(39.38%)和IR 區(qū)(47.53%)，SSC 區(qū)最少(13.09%)(圖2A,B)。共統(tǒng)計(jì)出SSR 位點(diǎn)1191 個(gè)，在石蒜屬不同物種中數(shù)量差異不大(66～74 個(gè))。其中單核苷酸772 個(gè)、二核苷酸207 個(gè)、三核苷酸20個(gè)、四核苷酸118 個(gè)、五核苷酸73 個(gè)、六核苷酸1個(gè)(僅在忽地笑L.aurea中)。單核苷酸數(shù)量最多，且A/T 重復(fù)最多，僅在9 個(gè)物種中檢測(cè)到少量C/G 重復(fù)。SSR 主要分布在LSC 區(qū)(73.63%)，SSC 區(qū)(17.80%)和IR 區(qū)(8.56%)較少；在IR 區(qū)的分布最為均勻，每個(gè)物種都為6 個(gè)，在LSC 區(qū)和SSC 區(qū)的分布無較大差異(圖2C,D)。

圖2 石蒜屬植物葉綠體基因組重復(fù)序列分析Fig.2 Repeat sequence analysis of the chloroplast genome of Lycoris

2.3 密碼子偏好性分析

石蒜屬17 個(gè)物種的密碼子數(shù)量在26448 個(gè)(忽地笑)～26740 個(gè)(中國(guó)石蒜和長(zhǎng)筒石蒜)之間，17個(gè)石蒜屬物種之間無較大差異。色氨酸(Try)和甲硫氨酸(Met)只由一個(gè)密碼子編碼，其他氨基酸都由2～6 個(gè)同義密碼子編碼。相對(duì)同義密碼子使用度(RSCU)能說明密碼子使用是否偏好及偏好性強(qiáng)弱：RSCU>1 表明密碼子使用頻率較高；RSCU=1表明密碼子無使用偏好性；RSCU＜1 表明密碼子使用頻率較低[46]。共有31 個(gè)密碼子的RSCU 值大于1，說明其密碼子的使用頻率較高，而其中29個(gè)密碼子的第三位堿基為A 或U，只有編碼亮氨酸(Leu)的UUG 和編碼絲氨酸(Ser)的UCC 第三位堿基為C 或G，這表明17 個(gè)石蒜屬植物偏好A或U 結(jié)尾的密碼子；共有31 個(gè)密碼子的RSCU 值＜1，說明其密碼子使用頻率較低；甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)的RSCU 值為1，密碼子使用無偏好性(圖3)。

圖3 石蒜屬物種的密碼子偏好性分析Fig.3 The relative synonymous codon usage analysis of Lycoris species

2.4 葉綠體基因組比較及共線性分析

利用mVISTA 軟件對(duì)石蒜屬植物進(jìn)行葉綠體基因組比對(duì)，結(jié)果顯示其葉綠體基因組不存在重排和倒置，具有很高的保守性(圖4)。非編碼區(qū)的變異頻率高于編碼區(qū)；LSC 和SSC 區(qū)變異較大，IR 區(qū)變異較小，IR 區(qū)相對(duì)更為保守；rRNA 基因基本沒有發(fā)生變異，其保守度更高。共線性分析沒有檢測(cè)到基因重排和倒置現(xiàn)象，也表明石蒜屬17 個(gè)物種的葉綠體基因組相對(duì)保守(圖5)。

圖4 利用mVISTA 對(duì)石蒜屬17 個(gè)物種葉綠體基因組的可視化分析(Shuffle-LAGAN 模式)Fig.4 Visual comparison of chloroplast genomes of 17 Lycoris species by mVISTA(the comparisonresult in Shuffle-LAGAN mode)

2.5 IR 邊界分析

對(duì)石蒜屬植物17 個(gè)葉綠體基因組的LSC/IRb(JLB)、IRb/SSC(JSB)、SSC/IRa(JSA)、IRa/LSC(JLA)邊界進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。17 個(gè)葉綠體基因組的邊界分布的基因類型相同，只在基因的位置和大小上有所區(qū)別。在JLB 邊界分布的基因?yàn)閞pl22 和rps19，只有忽地笑的rpl22 基因跨過JLB 邊界，其余物種的rpl22 基因全部位于LSC區(qū)；石蒜和香石蒜L.incarnata的rps19 基因跨過JLB 邊界，其余物種的rps19 基因全部位于IRb 區(qū)。在JSB 邊界分布的基因?yàn)閥cf1 和ndhF，ycf1 基因均跨過JSB 邊界；14 個(gè)物種的ndhF 基因跨過JSB邊界，只有忽地笑、換錦花和玫瑰石蒜的ndhF 基因完全位于SSC 區(qū)。在JSA 邊界處分布的基因?yàn)閥cf1 和trnN，ycf1 基因橫跨JSA 邊界，trnN 基因全部位于IRa 區(qū)。JLA 邊界位于rps19 基因和psbA基因之間。

圖6 石蒜屬植物葉綠體基因組LSC、SSC 和IR 區(qū)邊界的比較Fig.6 Comparison of LSC,SSC and IR region boundaries in the chloroplast genome of Lycoris

2.6 核苷酸多態(tài)性分析

利用 DnaSP(DNA Sequences Polymorphism v5.10.01)軟件對(duì)17 個(gè)石蒜屬植物葉綠體基因組的核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析。Pi 值的范圍為0～0.009。核苷酸多態(tài)性Pi 值大于0.006 的基因被認(rèn)為是高變基因和基因間隔區(qū)，折線圖中幾個(gè)峰值所對(duì)應(yīng)數(shù)值高的基因和基因間隔區(qū)為：trnG-UCC(0.00641)、atpF-atpH(0.00659)、psbC-trnS-UGA-psbZ(0.00957)、trnG-GCC-psbZ(0.00718)、rpl32(0.00807)、trnLUAG-rpl32-ccsA(0.00819)、rps15-ycf1(0.00641)、ycf1(0.00634，0.00621)等(圖7)。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用葉綠體全基因組序列基于最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)構(gòu)建的進(jìn)化樹整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大體一致，只有少數(shù)分支支持率和后驗(yàn)概率存在差異且絕大多數(shù)的分支都獲得很高的支持率(圖8)。從葉綠體全基因組序列的系統(tǒng)樹來看，石蒜科形成單系類群，這與部分前期研究結(jié)果一致。石蒜屬與水仙屬Narcissus、全能花屬Pancratium、雪片蓮屬Leucojum、秋雪片蓮屬Acis和箭藥蓮屬Lapiedra等形成的分支構(gòu)成姐妹分支。在石蒜屬17 個(gè)物種中，處于最基部的物種是淡黃石蒜L.flavescens、血紅石蒜、換錦花和玫瑰石蒜。石蒜屬形成一個(gè)單系分支(BS=100，PP=1)，并分為六個(gè)小的分支，其中安徽石蒜、長(zhǎng)筒石蒜、江蘇石蒜Lycoris×houdyshelii、稻草石蒜L.straminea為第一個(gè)分支(Clade Ⅰ)，安徽石蒜和江蘇石蒜親緣關(guān)系最近(BS=94，PP=0.97)；朝鮮石蒜L.sanguineavar.koreana和濟(jì)州石蒜Lycoris×chejuensis以較高的支持率(BS=100，PP=1)聚為姐妹分支形成Clade Ⅱ；第三個(gè)分支(Clade Ⅲ)包括鹿蔥L.squamigera、猥島石蒜L.uydoensis和陜西石蒜L.shaanxiensis，其中鹿蔥和猥島石蒜形成姐妹分支，但支持率相對(duì)較低(BS=54)；中國(guó)石蒜和石蒜形成姐妹分支并獲得強(qiáng)烈支持(BS=100，PP=1)，與香石蒜共同形成第四個(gè)分支(Clade Ⅳ)；忽地笑單獨(dú)形成第五個(gè)分支(Clade Ⅴ)；淡黃石蒜和血紅石蒜以及換錦花和玫瑰石蒜均以較高的支持率形成姐妹分支(BS=100，PP=1)，共同組成Clade Ⅵ。

圖8 基于最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)的石蒜屬葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of the chloroplast genomes of Lycoris based on maximum-likelihood(ML)and bayesian inference(BI)

3 討論

石蒜屬物種間的葉綠體基因組全長(zhǎng)最大差僅為426 bp，LSC 區(qū)、SSC 區(qū)、IR 區(qū)序列長(zhǎng)度差分別為182 bp、395 bp、194 bp。由此可見，石蒜屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)保守。SSR 分子標(biāo)記有著多態(tài)性豐富、通用性強(qiáng)、分率高、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[51—52]，本研究共統(tǒng)計(jì)出SSR 位點(diǎn)1191 個(gè)，在整個(gè)基因組中都有分布，可應(yīng)用于石蒜屬植物種質(zhì)資源鑒定、分子育種和群體遺傳等方面的研究。植物葉綠體基因組中普遍存在IR 區(qū)邊界的收縮和擴(kuò)張[53—54]。石蒜屬屬內(nèi)物種序列總長(zhǎng)度和IR 區(qū)長(zhǎng)度都相差不大，可見其IR 區(qū)擴(kuò)張或收縮幅度微小，對(duì)其葉綠體基因組長(zhǎng)度的影響較小。序列比對(duì)和共線性分析顯示不存在重排和倒置，表明石蒜屬葉綠體全基因組具有很高的保守性。根據(jù)石蒜屬葉綠體基因組的核苷酸多態(tài)性(Pi)篩選出以下高變基因和基因間隔區(qū)：trnG-UCC、atpF-atpH、psbC-trnS-UGA-psbZ、trnGGCC-psbZ、rpl32、trnL-UAG-rpl32-ccsA、rps15-ycf1。這些高變位點(diǎn)可為石蒜屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析和群體遺傳研究提供可參考的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

Traub 等[19]基于花形和雄蕊長(zhǎng)度將石蒜屬分為兩個(gè)亞屬，然而基于葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果并不支持該處理。例如，整齊花亞屬的換錦花和血紅石蒜與石蒜亞屬的淡黃石蒜和玫瑰石蒜聚為一支，類似的情況在每個(gè)分支里都有出現(xiàn)。傳統(tǒng)的亞屬間區(qū)別形態(tài)特征在每個(gè)分支里都存在交叉，部分形態(tài)特征極為相似的物種也未聚類在一起，如香石蒜和陜西石蒜、稻草石蒜和江蘇石蒜等，這與Zhang等[55—56]的結(jié)論相似。此外，鄧傳良等[25]和袁菊紅[57]認(rèn)為雄蕊與花被片的位置關(guān)系可將石蒜屬劃分為兩個(gè)大類群，但在本研究中，雄蕊明顯伸出花被外的玫瑰石蒜、石蒜、稻草石蒜、江蘇石蒜與雄蕊不伸出或略伸出于花被外的換錦花、香石蒜、陜西石蒜、長(zhǎng)筒石蒜等均未形成單系類群。因此，基于雄蕊與花被片的位置關(guān)系對(duì)石蒜屬植物屬下物種進(jìn)行分類仍值得商榷。

基于葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，17個(gè)石蒜屬物種所在分支可分為六個(gè)小的分支類群。安徽石蒜、江蘇石蒜、長(zhǎng)筒石蒜和稻草石蒜組成Clade Ⅰ，其中安徽石蒜和長(zhǎng)筒石蒜形態(tài)極為相似，染色體數(shù)目均為2n＝16，核型均為2n＝16＝6 m＋10 t[58]，且系統(tǒng)發(fā)育樹顯示二者的親緣關(guān)系很近。因此，本研究支持安徽石蒜作為長(zhǎng)筒石蒜的變種或是以長(zhǎng)筒石蒜為母本的雜交種的觀點(diǎn)[21]。江蘇石蒜、稻草石蒜也與長(zhǎng)筒石蒜聚在Clade Ⅰ中，表明這三個(gè)物種具有較近的親緣關(guān)系，這在一定程度上驗(yàn)證了江蘇石蒜和稻草石蒜可能是雜交起源的觀點(diǎn)[47]。

朝鮮石蒜和濟(jì)州石蒜以100%的支持率組成Clade Ⅱ，二者主要分布于朝鮮和韓國(guó)，因此它們親緣關(guān)系較近可能與其分布有關(guān)。朝鮮石蒜是血紅石蒜的變種，但二者并未形成姊妹群關(guān)系，其系統(tǒng)學(xué)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

鹿蔥、猥島石蒜和陜西石蒜組成Clade Ⅲ，并得到100%的支持率，說明三個(gè)物種的親緣關(guān)系很近。有研究認(rèn)為石蒜屬中2n=27(如鹿蔥)是由2n=16的未減數(shù)配子和2n=22 的正常配子雜交得到的[48]。但在本研究中，鹿蔥并未與染色體數(shù)為16 或22 的物種聚在一起，不支持鹿蔥起源于長(zhǎng)筒石蒜(2n=16)和換錦花(2n=22)的雜交的觀點(diǎn)[47]。猥島石蒜在1996年被作為淡黃石蒜的變種發(fā)表，即L.flavescensvar.uydoensisM.Kim[49]，但在葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹中，兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，未形成姊妹群關(guān)系，其系統(tǒng)關(guān)系有待深入研究。張鵬翀等[50]通過核型分析認(rèn)為，陜西石蒜也是雜交種，可能是中國(guó)石蒜與未減數(shù)分裂或四倍體石蒜的雜交后代，但本研究中陜西石蒜并未與中國(guó)石蒜或石蒜聚在一起。目前，關(guān)于陜西石蒜的資料較少，未來需要更多資料以明確該種的起源和系統(tǒng)位置。

中國(guó)石蒜、石蒜和香石蒜以100%的支持率組成Clade Ⅳ，表明石蒜和香石蒜的親緣關(guān)系很近，這與部分學(xué)者的研究結(jié)果相似[21—22,59]，但中國(guó)石蒜的系統(tǒng)位置不一樣。香石蒜核型較為復(fù)雜，盡管其與石蒜的親緣關(guān)系較近，但二者的染色體數(shù)目和核型都不相同。因此，香石蒜是否起源于石蒜或二者有較為相近的共同祖先還不能確定。

忽地笑未與其他石蒜屬物種顯示較近的親緣關(guān)系，而是單獨(dú)聚為一支(Clade Ⅴ)，與利用RAPD 分析得到的結(jié)論一致[24]，這可能與忽地笑分布范圍較廣、染色體數(shù)目和核型多樣，且具有特有的染色體基數(shù)有關(guān)。

淡黃石蒜、血紅石蒜、換錦花和玫瑰石蒜組成Clade Ⅵ，并獲得100%的支持率。徐炳聲等[20]認(rèn)為淡黃石蒜可能是朝鮮石蒜和中國(guó)石蒜的雜種，玫瑰石蒜是二倍體石蒜和換錦花的雜種。在本研究中，換錦花和玫瑰石蒜也以100%支持率形成姐妹分支，支持玫瑰石蒜是換錦花與二倍體石蒜雜種的觀點(diǎn)，且換錦花可能是玫瑰石蒜的母本。

綜上所述，基于葉綠體全基因組序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹不支持石蒜屬基于花冠是否整齊劃分亞屬的傳統(tǒng)處理，基于雄蕊與花被片的位置關(guān)系對(duì)石蒜屬進(jìn)行亞屬劃分的處理也值得商榷。建議取消對(duì)石蒜屬屬下亞屬的劃分，或者未來利用更多的形態(tài)學(xué)特征(如花粉粒、葉微形態(tài)等)并結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)資料再對(duì)石蒜屬物種進(jìn)行屬下分類處理。雜交起源是石蒜屬物種形成和分化的一個(gè)重要途徑，本研究支持安徽石蒜、江蘇石蒜、稻草石蒜、玫瑰石蒜等物種雜交起源的觀點(diǎn)，并揭示其可能的母本。對(duì)石蒜屬葉綠體全基因組的系統(tǒng)學(xué)研究，不僅有助于更深入地認(rèn)識(shí)石蒜屬物種的系統(tǒng)演化與雜交起源，同時(shí)，也為雜交品種的培育和選擇提供參考。