食品級微生物發(fā)酵中藥研究進展

鄭嘉馨，張 建，蔣倍嫻，章玉麗，胡錦余，趙 廷

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100)

在近年新冠(COVID-19)疫情的防控和救治中，中醫(yī)藥發(fā)揮了巨大作用[1]，如參黃顆粒綜合治療危重癥和重癥COVID-19[2]、中醫(yī)藥調(diào)控腸道菌群防治COVID-19[3]、國家衛(wèi)生委員會批準的“三味中藥三方”治療COVID-19[4]，再次將中藥推向醫(yī)療前沿。

食品級微生物發(fā)酵中藥歷史悠久。三千年前周朝《尚書?說命》中記載：“若做酒醴，爾維曲蘗”[5]；東漢時期張仲景的《金匱要略》中記載神曲是由新鮮青篙、蒼耳等發(fā)酵而成，“行脾胃滯氣，散腑風冷”[6]。傳統(tǒng)中藥加工常采用蒸、煮、炒、熬等方法，這些方法加工深度不足，使中藥有效物質(zhì)難以得到充分利用[7]。傳統(tǒng)的中藥發(fā)酵技術(shù)存在菌種和發(fā)酵環(huán)境不可控，以及菌種篩選技術(shù)落后、發(fā)酵過程調(diào)控參數(shù)不穩(wěn)定、發(fā)酵機理不明確、量效評價較主觀等問題。因此，近年來研究人員將微生態(tài)學、發(fā)酵工程技術(shù)、組學分析技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)與中藥傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)有機結(jié)合，以建立相對可控、智能化的現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)[6]。本文對食品級微生物在中藥發(fā)酵中的應(yīng)用及技術(shù)開發(fā)研究進行綜述，為運用食品級微生物發(fā)酵中藥提供參考。

1 食品級微生物發(fā)酵中藥技術(shù)

1.1 菌種

中藥多采用單一菌種發(fā)酵，也有多菌種混合發(fā)酵。單菌種發(fā)酵具有定向分解某種有效成分并提高其效價的特點，同時可以修飾毒性結(jié)構(gòu)達到脫毒目的。因此，國內(nèi)外學者常采用單一的菌種對中藥進行定向催化和改造[5]，如：布拉氏酵母菌Saccharomyces cerevisiaevar.boulardii發(fā)酵山藥[8]、乳酸菌發(fā)酵枸杞[8]、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis發(fā)酵黃芪[9]、黑曲霉發(fā)酵蕎麥[10]等。多菌種混合發(fā)酵較復(fù)雜，多種酶系互相增益，使中藥生物轉(zhuǎn)化率提高[5]。藥用真菌和益生菌的組合已成為中藥微生物發(fā)酵菌種的主流[9]。研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌Lactobacillus plantarum與安琪甜酒曲混合發(fā)酵薏米比甜酒曲單菌種發(fā)酵的酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮含量分別提高9.5%、328.81%和51.61%，同時抗氧化活性增強，DPPH 和ABTS 自由基清除率分別從67.03%和52.36%提升至76.22%和63.16%[8]。且通過共育模式的人參皂苷總產(chǎn)量和次要人參皂苷產(chǎn)量明顯提高[10]。

用于中藥發(fā)酵的菌有：細菌、真菌、藥食兩用菌等。發(fā)酵細菌具有結(jié)構(gòu)簡單、發(fā)酵形式多樣、代謝產(chǎn)物豐富、敏感、易改良的特點；發(fā)酵真菌具有種類豐富、培養(yǎng)環(huán)境簡單、次生代謝產(chǎn)物豐富、能產(chǎn)生具較強分解作用酶的特點，是中藥發(fā)酵的重要菌種。藥食兩用菌，顧名思義就是可用于養(yǎng)生、食療的菌，很多本身用作中藥，具有藥性平和、不良反應(yīng)較少等特點。發(fā)酵菌的代表菌種及其應(yīng)用領(lǐng)域見表1。

1.2 發(fā)酵類型

現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)按發(fā)酵形式可分為固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵和雙向發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵歷史悠久，操作簡單、成本低，不需嚴格的無菌環(huán)境，但發(fā)酵速度慢；液態(tài)發(fā)酵的工藝要求較高，進行工業(yè)化大規(guī)模液體發(fā)酵培養(yǎng)時多數(shù)中藥易被雜菌污染，需做好滅菌工作；雙向發(fā)酵是以藥用真菌為發(fā)酵菌種，中藥或藥渣為菌生長提供營養(yǎng)，并產(chǎn)生各種酶分解轉(zhuǎn)化營養(yǎng)，生成藥性菌質(zhì)體(圖1)，它具有發(fā)酵組合多、生產(chǎn)條件可控、可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)、前景好的優(yōu)點，但也存在不同組合機理不明，缺乏科學的理論依據(jù)等問題，如紅曲霉–金釵石斛[20]，故雙向發(fā)酵技術(shù)仍需進一步研究。

表 1 食品級微生物發(fā)酵中藥應(yīng)用實例Table 1 Application of food-grade microbial fermentation of traditional Chinese medicine

圖 1 雙向發(fā)酵技術(shù)Fig.1 Bidirectional fermentation diagram

2 食品級微生物發(fā)酵中藥機理及作用

中藥經(jīng)食品級微生物發(fā)酵能產(chǎn)生多種酶(纖維素酶、果膠酶等)，使其有效成分盡可能完全釋放，或產(chǎn)生新的活性成分，藥效增強，且毒副作用降低。發(fā)酵過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和藥效成分協(xié)同增效產(chǎn)生高級醇等，改善口感。發(fā)酵還可能產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，如抗生素等。此外，利用藥渣發(fā)酵還具有節(jié)約藥材、保護環(huán)境的作用。

2.1 有效成分提取率提高及藥效增強

中藥原料多為植物，其藥理活性成分分布在細胞內(nèi)，而胞內(nèi)的纖維和膠質(zhì)使藥效成分不易釋放。但食品級微生物中的多種酶可降解中藥細胞壁組分，使藥效成分釋放，從而使有效成分提取率和藥效加大。有研究比較不同菌種對降解煙梗細胞壁組分(果膠、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)的影響發(fā)現(xiàn)，乳酸菌降解纖維素效果最好，使其質(zhì)量分數(shù)從20.83%降至15.90%；芽孢桿菌分解木質(zhì)素和半纖維素效果明顯，使其質(zhì)量分數(shù)分別從10.91%和10.66%降至5.55%和7.40%；發(fā)酵4 d 后，鼠李糖乳桿菌降解果膠效果最好，果膠降解率可達87.75%[28]。

發(fā)酵的菌株及其代謝產(chǎn)物與藥物可發(fā)生協(xié)同增效，如紅曲菌發(fā)酵黃精，提升了降血脂的功能[29]；金釵石斛與紅曲霉聯(lián)合發(fā)酵，比單獨紅曲霉發(fā)酵代謝產(chǎn)物的抗氧化性或金釵石斛的抗氧化性均有不同程度的提高[20]；陳皮、山楂和白芷聯(lián)合補充劑與糯米混合，莫納可林K 含量比不加藥的高41.18%[30]。

2.2 改善口感

一些具有強大藥效的中藥因口感不佳制約了其推廣應(yīng)用，而食品級微生物發(fā)酵可改善口感。中藥發(fā)酵產(chǎn)生多種高級醇、具香味酯、有機酸等風味成分，使產(chǎn)品口感和風味均有提升[28,30]。如紅曲菌發(fā)酵黃精，改善了生黃精口感上的麻味及對咽喉的刺激性；乳酸菌發(fā)酵枸杞，使醛還原或氧化為醇或酸，從而使酯類產(chǎn)量增加，達到去除枸杞汁的異味、豐富風味的效果，發(fā)酵后枸杞汁的活菌數(shù)均在107CFU·mL–1以上。枸杞汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵處理能顯著提高生物活性物質(zhì)含量，特別是副干酪乳桿菌Lactobacillusparacasei。此外，發(fā)酵還導(dǎo)致枸杞汁酚類物質(zhì)積累明顯增加，并產(chǎn)生68 種揮發(fā)性化合物，其中包括20 種醇類物質(zhì)、18 種酯類物質(zhì)、10 種脂肪酸和10 種脂肪酸。值得注意的是，發(fā)酵后醛類物質(zhì)含量顯著降低，而酯類物質(zhì)含量顯著增加，表明乳酸菌可用于降低枸杞汁的腥味，提升口感[31]。薄荷汁發(fā)酵前后比較顯示，各部分發(fā)酵液香氣有所下降，但發(fā)酵后薄荷汁更為緩和，沖擊力較低，消費者接受度更高，且甜味均較為明顯。發(fā)酵處理的薄荷根、莖、葉總酚和總黃酮含量顯著提高；感官評價表明，僅葉部和根莖部位顏色差異顯著，這為開發(fā)薄荷的發(fā)酵功能性產(chǎn)品提供了新思路[11]。

2.3 產(chǎn)生新的活性成分

食品級微生物生長代謝可分泌蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、半纖維素酶、纖維素酶等數(shù)十種胞外酶，這些酶使特定藥效分子基團發(fā)生羥化、脫氧、磷酸化等反應(yīng)，進而修飾中藥成分結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生新的活性成分。使用嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵鬼針草莖、葉，其總黃酮中某些成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化[32]；靈芝子實體水提取物與嗜酸乳桿菌和短雙歧桿菌體外發(fā)酵，主要靈芝酸成分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，例如靈芝酸A(GA)轉(zhuǎn)變?yōu)殪`芝酸C，促進其免疫刺激活性[13]。植物乳桿菌MG5276發(fā)酵黃芪，發(fā)酵前未檢出的毛蕊異黃酮和芒柄花素在發(fā)酵后能檢出[33]；川芎嗪是中藥川芎的有效成分，液質(zhì)色譜分析川芎發(fā)現(xiàn)川芎嗪含量低于檢測限(0.1 ng·mL–1)，而枯草芽孢桿菌LB5 發(fā)酵后川芎嗪產(chǎn)量為1.0268 mg·mL–1。初步研究表明，川芎嗪是枯草芽孢桿菌LB5 通過分泌蛋白代謝，消耗川芎中的糖產(chǎn)生的，而非川芎本身的次生代謝產(chǎn)物[34]。

2.4 毒副作用降低

一些中藥具有較強的生物活性，同時毒副作用也較大，經(jīng)食品級微生物發(fā)酵后，產(chǎn)生的系列酶將中藥所含大分子有毒物質(zhì)(如生物堿)分解和轉(zhuǎn)化，使其毒性降低或消除。醋炙法及煎湯(分別以金錢草、綠豆、白芍、甘草各自煎湯)炒炙法制備的雷公藤炮制品均能使被雷公藤生品降低的小鼠血清睪酮水平顯著逆轉(zhuǎn)69.9%、122.4%、75.2%、101.4%、106.6%，說明以上炮制對雷公藤誘導(dǎo)的小鼠生殖毒性均具有減毒作用[35]。靈芝雙向發(fā)酵雷公藤，并對發(fā)酵產(chǎn)生的靈雷菌質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)接種量10 mL·100 mL–1、發(fā)酵30 d 得到的靈雷菌質(zhì)(N2-G30)在3.75 μg·mL–1質(zhì)量濃度下表現(xiàn)出減毒持效的作用，相比于雷公藤，可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 細胞釋放促炎因子TNF-α 和IL-6，并減輕對人正常肝細胞增殖的抑制作用。通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析雷公藤發(fā)酵前后的主要成分含量變化，結(jié)果顯示，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷酚內(nèi)酯含量增加，雷公藤內(nèi)酯甲含量降低，這些成分的含量變化與N2-G30 的減毒持效作用有關(guān)[36]。

2.5 節(jié)約藥材，保護環(huán)境

中藥生產(chǎn)中的藥渣主要成分為纖維素、半纖維素及未提取完全的有效成分、無機元素等，一般通過填埋、燃燒等方式處理，這樣既造成資源浪費和環(huán)境破壞。藥渣經(jīng)食品級微生物發(fā)酵可降解纖維素、半纖維素等，使中藥材的利用率大大提高，降本增效，并緩解藥渣對環(huán)境造成的破壞。青蒿藥渣經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后，可作為中藥飼料添加劑[37]。以中藥殘渣水解物為底物發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素，利用木糖駒形氏桿菌Taonellamepensis合成細菌纖維素，細菌纖維素產(chǎn)量最高達0.866 g·L–1[38]。研究發(fā)現(xiàn)，以厚樸藥渣為原料，接種黃孢原毛平革菌Phaner-ochaete chrysosporium進行固相發(fā)酵，可利用酶解厚樸藥渣中的木質(zhì)素，提高藥渣中銅離子的去除率，以實現(xiàn)中藥藥渣的資源化利用。隨著木質(zhì)素酶活性的提高，發(fā)酵改性后的厚樸渣的銅離子去除率顯著提高，且在第14 天達最大值，是初始值的3.15 倍[39]。

3 食品級微生物發(fā)酵中藥的應(yīng)用

3.1 醫(yī)療保健領(lǐng)域

飲食性肥胖與脂代謝、糖代謝和膽固醇代謝紊亂，以及氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、腸道微生物群異常和慢性低度炎癥等密切相關(guān)[40]。以總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇水平評估益生菌干預(yù)的效果，發(fā)現(xiàn)益生菌有緩解超重或肥胖成年人血脂異常的潛力[41]。從發(fā)酵處理的高脂飼料喂食的肥胖大鼠中取得的脂肪組織質(zhì)量顯著降低，肥胖相關(guān)的生物標志物(總膽固醇、促炎細胞因子等)大大減少，說明發(fā)酵物可以調(diào)節(jié)脂肪生成、脂質(zhì)代謝、微生物群等，使之具有強大的抗肥胖潛力，為控制肥胖和研發(fā)肥胖相關(guān)代謝紊亂的新型治療劑提供了可能[42]。

在調(diào)節(jié)腸道健康方面，乳桿菌發(fā)酵人參對大鼠腸道菌群、免疫力、抗生素相關(guān)性腹瀉產(chǎn)生積極影響[43]。通過對體外發(fā)酵氣體、短鏈脂肪酸、pH 和菌群豐度的評價，表明靈芝寡糖對腸道菌群具有良好的調(diào)節(jié)作用[4]。細菌培養(yǎng)試驗表明，植物乳桿菌發(fā)酵中藥均能降低小鼠腹瀉指數(shù)，恢復(fù)腸道菌群，顯示出比中醫(yī)藥或聯(lián)合植物乳桿菌更大的優(yōu)勢[44]。

在滅菌消炎方面，食品級微生物可調(diào)節(jié)口腔微生物生態(tài)，重建“健康”微生物組[45]，如益生菌輔助劑可減少牙周病原菌種，且使牙周組織和深牙周袋內(nèi)危害大的病原菌數(shù)量減少[46]；通過腸黏膜屏障受損模型小鼠實驗對發(fā)酵液進行分析，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌發(fā)酵靈芝改善了腸道菌群失調(diào)，炎癥得到緩解，結(jié)腸損傷減輕[47]；發(fā)酵枸杞通過發(fā)揮抗炎和抗氧化的作用，改善高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟功能及其脂質(zhì)代謝[48]。從九味抗炎藥發(fā)酵混合物中分離出一種新型酒精酸鹽，具有降低小鼠炎癥因子TNF-α和IL-1β 表達的作用[49]。

在抗氧化、抗腫瘤方面，新型益生菌發(fā)酵山楂葛根較傳統(tǒng)山楂葛根配方具有更高的活性成分濃度和抗氧化活性，對心血管疾病患者有一定的健康益處[50]。乳酸乳球菌KC24 發(fā)酵水培人參，其抗氧化性增加且可作為具有抗炎作用的功能性材料應(yīng)用于功能性食品和醫(yī)藥行業(yè)[51]。與天然冬蟲夏草相比，發(fā)酵蟲草菌粉富含蛋白質(zhì)、多肽、甾體化合物、核苷類衍生物、多糖類等活性成分，可明顯增強機體對腫瘤細胞的抑制作用[52]。桑黃通過液體發(fā)酵，其生物活性物質(zhì)桑黃總?cè)铺崛∥锞哂锌咕涂鼓[瘤活性，有助于篩選新型真菌衍生的抗癌和抗菌化合物[53]。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵的胡枝子可作為白血病和肺癌的潛在治療藥物[16]。目前，中藥發(fā)酵的研制大多處于開發(fā)階段，臨床及工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用還有待進一步發(fā)展，大宗中藥發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)具有較大發(fā)展空間。

3.2 化妝品行業(yè)

目前食品級微生物發(fā)酵中藥應(yīng)用于化妝品的主要功能為祛痘、抗氧化、抗衰老。采用酵母、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、混合菌發(fā)酵鐵皮石斛，其活性成分、抗氧化活性、酪氨酸酶抑制率和紫外線B 吸收等指標均優(yōu)于非發(fā)酵組，說明發(fā)酵中藥具有作為功能性化妝品原料的潛力[54]。通過絲狀真菌斜臥青霉Penicilliumdecumbens酵黃芩提取物4 d，發(fā)現(xiàn)91.0%漢黃芩苷被轉(zhuǎn)化為漢黃芩素，提取物的抗痤瘡活性增強，可應(yīng)用于抗痤瘡化妝品開發(fā)[55]。臨床研究表明，使用 1% 發(fā)酵黑參的乳膏配方可顯著減少眼部皺紋，提亮膚色，適用于抗皺、煥采化妝品開發(fā)[56]。乳酸菌和雙歧桿菌發(fā)酵富硒綠豆，形成富含多酚、多肽和γ-氨基丁酸的發(fā)酵液，可明顯清除自由基、抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素合成、上調(diào)水通道蛋白3 的表達，可應(yīng)用于抗氧化、美白、保濕化妝品開發(fā)[57]。曲霉固態(tài)發(fā)酵三七的抗氧化和抗衰老的標志代謝物原人參二醇(PPD)和原人參三醇(PPT)含量在4 d 發(fā)酵期內(nèi)倍增，同時PPD 和PPT 顯著改善了人真皮層纖維細胞中 I 型膠原蛋白、原纖維蛋白-1 和彈性蛋白的表達，可應(yīng)用于抗氧化、抗衰老化妝品開發(fā)[58]。近年來，隨著天然有效活性成分產(chǎn)品的不斷開發(fā)，以及追求健康美容的觀念深入人心，發(fā)酵型中藥也在不斷進入美容行業(yè)并占領(lǐng)高端市場。

3.3 農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖領(lǐng)域

中藥渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生大量的酶、活性肽、寡糖、有機酸等生物活性成分，可對動物腸道菌群起有利調(diào)節(jié)作用，增強畜禽抗病能力和促進生長發(fā)育等，在農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有突出的應(yīng)用價值[59]。隨著超級病菌的出現(xiàn)，抗生素的濫用問題引起全球人民關(guān)注，我國自2020年7月1日起，停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。因此，發(fā)酵中藥或可代替抗生素應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。添加解淀粉芽孢桿菌DSM25840 或枯草芽孢桿菌DSM25841 對仔豬生長、健康、免疫、腸道功能和微生物譜有積極影響，可減少斷奶仔豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的感染，減少腹瀉和影響?zhàn)つまD(zhuǎn)錄組譜[60]。在蛋雞日糧中添加3‰植物乳桿菌發(fā)酵黃芪，能明顯提高蛋雞的產(chǎn)蛋率、抗氧化能力、免疫狀態(tài)、腸道微生物群豐度，且對卵子質(zhì)量基本無影響[61]。健康雞粉及其發(fā)酵產(chǎn)物對肉雞前腸微生物群落具有調(diào)節(jié)作用[62]。在飼料中添加益生菌和中藥多糖能改善羔羊生長性能、血液指標、瘤胃發(fā)酵和細菌組成，與對照相比，益生菌處理提高了羔羊體內(nèi)血糖和免疫球蛋白G 濃度，增加瘤胃微生物蛋白含量但瘤胃液pH 下降[63]。由此可見，可食用菌發(fā)酵中藥添加至家禽飼料中，對家禽疾病預(yù)防有一定的作用，可在一定程度上代替獸藥，減輕過度使用抗生素的負面影響。

4 展望

傳統(tǒng)的單一菌種對單一中藥發(fā)酵具有局限性，目前已開展中藥多菌種發(fā)酵的研究。未來在中藥發(fā)酵研制中，應(yīng)將人工智能、大數(shù)據(jù)與生物技術(shù)相結(jié)合，運用高效低耗的低溫干燥等技術(shù)，通過互聯(lián)網(wǎng)和人工智能實現(xiàn)量化、直觀化觀察發(fā)酵過程，對微生物代謝網(wǎng)絡(luò)進行解析，以明確發(fā)酵機理；同時利用人工智能深度學習等智能技術(shù)對重要發(fā)酵微生物群落進行科學設(shè)計，實現(xiàn)工業(yè)智能化發(fā)酵；通過高通量篩選技術(shù)解析微生物群落結(jié)構(gòu)，選育優(yōu)良菌種；建立和完善中藥發(fā)酵質(zhì)量評價體系。食品級微生物發(fā)酵中藥具有廣闊前景，可在醫(yī)療保健、化妝品、畜牧業(yè)等領(lǐng)域進行深層次開發(fā)。