基于藥物拼接的verubulin 衍生物的設計合成及活性評價

王曉鋒,王 明,張 晨,李 倩,尹東鋒

新疆軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 830000

微管是由α、β微管蛋白動態(tài)裝配而成的長絲狀管狀結構，廣泛存在于真核細胞中［1］。微管蛋白通過與不同的調節(jié)因子結合參與細胞形態(tài)維持、細胞增殖、物質運輸及信號轉導等過程，是抗腫瘤藥物的重要靶點之一［2-3］。，由于作用于微管蛋白秋水仙堿結合位點的化合物結構多樣，且能克服腫瘤細胞的耐藥性并破壞已形成的腫瘤血管［4］，故而逐漸成為研究的熱點。

verubulin（化合物1，結構見圖1）是最早發(fā)現(xiàn)含有喹唑啉結構的作用于微管蛋白秋水仙堿結合位點的微管聚集抑制劑，在體外對多種腫瘤細胞表現(xiàn)出很強的增殖抑制活性［5-9］。BANERJEE S 等［10］通過解析化合物1 的衍生物（2）（結構見圖1）與微管蛋白復合晶體的結構（PDB 編碼：6BR1），揭示了該類化合物的作用方式，為進一步進行結構修飾奠定了基礎。MP-HJ-1c（化合物3，結構見圖1）是新發(fā)現(xiàn)的另一類作用于微管蛋白秋水仙堿結合位點的化合物［11-12］，與1 及秋水仙堿［13］、康普瑞汀（CA-4）［14］的結合位點相比，其結構中的吡咯并［2，3-d］噻唑-5-甲酰胺基團，“伸入”微管蛋白β亞基更深的空腔中，與βN165、βE198 和βV236 形成氫鍵（PDB 編碼：5YZ3）。通過將6BR1 和5YZ3 進行疊合，設想在1 結構中喹唑啉環(huán)2 位引入吡咯并［2，3-d］噻唑-5-甲酰胺結構，由此設計了化合物4a 和4b（結構見圖1），對其分別進行了化學合成和初步體外活性評價。

圖1 化合物1～4 的結構Fig.1 Structure of compounds 1-4

1 儀器與材料

1.1 儀器

磁力攪拌器（德國IKA 公司）；RY-Ⅰ型熔點儀（天津市天分分析儀器廠）；AVANCE Ⅲ HD600 型超導核磁共振儀（德國BRUKER 公司）；JNM-ECA-400 型超導核磁共振儀（日本電子株式會社）；Xevo G2-XS QTOF 型高分辨質譜儀（沃特世公司）；分子模擬軟件Discovery Studio 3.0（Accelrys，San Diego，USA）。

1.2 試藥

5-噻唑甲醛（質量分數(shù)為98%）、疊氮乙酸乙酯（質量分數(shù)為98%）、5 mol·L-1乙醇鈉溶液（質量分數(shù)為99%）、氫氧化鋰（質量分數(shù)為98%）、N-Boc-甘氨酸（質量分數(shù)為98%）、N-Boc-β-丙氨酸（質量分數(shù)為98%）、2-氨基苯甲酰胺（質量分數(shù)為98%）、N，N-二異丙基乙基胺（質量分數(shù)為99%）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽［1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochlorid，EDCI·HCl，質量分數(shù)為98%］、1-羥基苯并三唑（1-hydroxybenzotriazole，HOBt，質量分數(shù)為99%）、三乙胺（質量分數(shù)為98%）、N，N-二甲基-4-氨基吡啶（質量分數(shù)為98%）、對甲苯磺酰氯（質量分數(shù)為99%）、N-甲基-4-甲氧基苯胺（質量分數(shù)為98%）、2-（7-氮雜苯并三氮唑）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯［2-（7-azabenzotriazol-1-yl）-N，N，N'，N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate，HATU，質量分數(shù)為98%］，均購自上海泰坦科技有限公司；無水硫酸鈉、氯化鈉、氯化銨、檸檬酸、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、三氟甲苯、無水乙醇、N，N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚均為分析純，均購自新疆安譜實驗器材有限公司；GF254 硅膠板和柱層析硅膠（200 目，青島海洋化工有限公司）。

2 方法與結果

2.1 化合物4a 和4b 的計算機輔助設計

本文所選用的復合晶體結構數(shù)據(jù)均來源于Protein Data Bank（www. rcsb. org），編號分別為6BR1和5YZ3。蛋白結構準備和分子對接所使用的軟件為Discovery Studio 3.0（DS3.0）。

2.1.1 蛋白結構6BR1 和5YZ3 的疊合 蛋白結構6BR1 和5YZ3 的預處理：保留晶體結構中1 個α、β二聚體及配體小分子和金屬離子，并保留6BR1 中的水分子675，將其余部分刪除。用Prepare Protein模塊進行蛋白結構準備，參數(shù)設置為默認值。用Molecular Overlay 模塊對準備好的蛋白進行一致性疊合，立體因素和靜電因素各按50%概率計算［15］。疊合結果顯示，二者相似度為0.946，化合物2 中的喹唑啉環(huán)和化合物3 中的苯環(huán)有一定程度的重疊，而四氫喹啉環(huán)和吡咯并［2，3-d］噻唑分別占據(jù)不同的結合位點，尤其是吡咯并［2，3-d］噻唑5-甲酰胺基團與βN165、βE198 和βV236 存在氫鍵相互作用（見圖2），表明在喹唑啉環(huán)2 位引入吡咯并［2，3-d］噻唑甲酰胺基團可能會增加其與微管蛋白的相互作用；同時考慮到化合物2 中的喹唑啉環(huán)與化合物3 中的苯環(huán)在走向上有一定的差異，因此在喹唑啉環(huán)和酰胺鍵之間引入了亞甲基或1，2-亞乙基形成一定的自由度，且化合物1 中的N-甲基-4-甲氧基苯環(huán)較化合物2 中的四氫喹啉環(huán)可能更有利于化合物與蛋白的誘導契合且易于合成，由此設計了化合物4a 和4b，并進行了分子對接。

圖2 化合物2 與微管蛋白結合位點（PDB：6BR1）和化合物3與微管蛋白結合位點（PDB：5YZ3）疊合示意圖Fig.2 Superimposition of the tubulin-2 （PDB：6BR1） and the tubulin-3 （PDB：5YZ3） complex structures

2.1.2 化合物4a 和4b 與蛋白結構5YZ3 的分子對接 以2.1.1 中準備好的5YZ3 為對接蛋白，結合位點是以化合物3 為中心、10? 為半徑的球形區(qū)域。使用Full Minimization 模塊對配體小分子進行了能量最小化，并添加了Chemistry at Harvard Macromolecular Mechamics （CHARMM）力場。用CDOCKER 模塊進行了分子對接，參數(shù)設置為默認值，主要包括隨機構象產(chǎn)生、構象優(yōu)化和模擬退火等。用In Situ Ligand Minimization 對CDOCKER 對接結果進行了能量最小化，球形區(qū)域內的氨基酸殘基設定為柔性。對接結果 用 Generalized Born with Molecular Volume（GBMV）溶劑模型計算結合能［15］。

首先用化合物3 驗證對接方法，結果顯示，最優(yōu)構象與復合晶體結構中配體構象的走向基本一致，RMSD 值為0.989 ?，結合能為-31.17 kcal·mol-1，表明對接方法效果較好。在化合物4a 和4b 的對接結果中，化合物4a 與化合物3 結構中的吡咯并［2，3-d］噻唑環(huán)有較好的重疊，分別與氨基酸殘基βN165 和βV236 形成1 個氫鍵，但未像化合物3 還與βE198 形成氫鍵（見圖3）；而化合物4b 由于連接鏈過長導致吡咯并［2，3-d］噻唑-5-甲酰胺基無法與微管蛋白形成有效相互作用?；衔?a 與蛋白的結合能為-27.93 kcal·mol-1。

圖3 4a 與微管蛋白（PDB 編碼：5YZ3）的分子對接示意圖Fig.3 Predicted binding mode of 4a with tubulin protein （PDB code：5YZ3）

2.2 化學合成

本實驗首先合成了化合物8，較文獻方法［16］在第一步用乙醇鈉溶液代替金屬鈉，操作更方便且提高了收率。對化合物8 與13 的脫Boc 產(chǎn)物進行縮合，得到目標產(chǎn)物4。在關鍵中間體13 的合成中，發(fā)現(xiàn)在氫氧化鈉的作用下，在室溫下即可由化合物11 生成化合物12，化合物12 與對甲苯磺酰氯（TsCl）原位生成對甲苯磺酸酯后，直接加入N-甲基-4-甲氧基苯胺反應即得化合物13。

2.2.1 合成路線 化合物4 的合成路線見圖4。

圖4 化合物4 的合成路線Fig.4 Synthetic route of compounds 4

2.2.2 化合物的合成及表征

2.2.2.1 化合物7 室溫下，將5-噻唑甲醛（564 μL，6.5 mmol）和疊氮乙酸乙酯（3.0 mL，26 mmol）溶于30 mL 無水乙醇中，在N2保護下冷卻到-10 ℃，滴加乙醇鈉（11.2 mL，32.5 mmol）至10 mL 無水乙醇溶液中，滴完后在0 ℃下攪拌5 h。將反應物倒入200 mL碎冰和250 mL 飽和氯化銨溶液中，析出固體物，抽濾，干燥，得到黃色固體物861 mg，即2-疊氮基-3-（5-噻唑基）丙烯酸乙酯，收率為59%。室溫下，將2-疊氮基-3-（5-噻唑基）丙烯酸乙酯（580 mg，2.59 mmol）溶于5 mL 干燥三氟甲苯中，在N2保護下滴加到10 mL沸騰的三氟甲苯中，滴完后回流4 h。減壓除去三氟甲苯，得到白色固體物442 mg，即化合物7。收率為87%；熔點為119～120 ℃；1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ（ppm） 10.80 （brs，1H），8.80 （s，1H），7.14（d，J=1.9 Hz，1H），4.41 （q，J=7.1 Hz，2H），1.41 （t，J=7.1 Hz，3H）；HR-ESI-MSm/z197.038 5 ［M+H］+（計算值為197.037 9，C8H9N2O2S）。

2.2.2.2 化合物8 將4H-吡咯［2，3-d］噻唑-5-羧酸乙酯（7，345 mg，1.76 mmol）懸浮于4 mL 四氫呋喃與8 mL 水的混合溶劑中，加入氫氧化鋰（337 mg，14.1 mmol），室溫下攪拌12 h。將反應物倒入約30 mL冰水中，用2 mol·L-1鹽酸調節(jié)pH 值至2，用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并有機相，用飽和氯化鈉溶液洗，加入無水硫酸鈉干燥過夜，減壓除去乙酸乙酯，得到淺粉色固體285 mg，即化合物8。收率為96%；熔點為230～234 ℃（ 碳化）；1H-NMR （600 MHz，d-DMSO）δ（ppm）δ12.66 （s，1H），9.03（s，1H），7.08（d，J=1.9 Hz，1H）；HR-ESI-MSm/z169.007 0［M+H］+（計算值為169.006 6，C6H5N2O2S）。

2.2.2.3 化合物11a 室溫下，將N-Boc-甘氨酸（1.92 g，11 mmol）溶于30 mL 二氯甲烷中，依次加入2-氨基苯甲酰胺（1.36 g，10 mmol）和N，N-二異丙基乙基胺（3.5 mL，20 mmol），冰浴冷卻至0 ℃后加入EDCI·HCl（2.88 g，15 mmol）和HOBt（2.03 g，15 mmol），繼續(xù)在該溫度下攪拌30 min 后，升溫至室溫，反應24 h。向反應物中加入100 mL 二氯甲烷，分別用50 mL 質量濃度為50 g·L-1的檸檬酸溶液、質量濃度為50 g·L-1的碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗，水相再用50 mL 二氯甲烷依次萃取1 遍，合并有機相，加入無水硫酸鈉干燥過夜，減壓除去乙酸乙酯，得到白色固體2.66 g，即化合物11a。收率為82%；熔點為150～153 ℃；HR-ESI-MSm/z294.144 7 ［M+H］+（計算值為294.144 8，C14H20N3O4）。

2.2.2.4 化合物11b 操作同11a。使用試劑NBoc-β-丙氨酸（2.08 g，11 mmol），2-氨基苯甲酰胺（1.36 g，10 mmol），N，N-二異丙基乙基胺（3.5 mL，20 mmol），EDCI·HCl（2.49 g，13 mmol），HOBt（1.49 g，11 mmol）反應，得到白色固體2.82 g，即化合物11b。收率為83%；熔點為158～161 ℃；HRESI-MSm/z330.143 1［M+Na］+（ 計算值為330.142 4，C15H21N3NaO4）。

2.2.2.5 化合物12a 室溫下，將2-（2-N-叔丁氧羰基氨基乙酰氨基）苯甲酰胺（11a，2.15 g，7.33 mmol）溶于10 mL 乙醇中，加入10 mL 質量濃度為50 g·L-1的氫氧化鈉溶液，室溫下攪拌10 h。將反應物倒入約100 mL 冰水中，用2 mol·L-1鹽酸調節(jié)pH 值至7，析出白色沉淀物，抽濾，干燥，得到白色固體1.85 g，即化合物12a。收率為92%；熔點為205～207 ℃；1HNMR （600 MHz，DMSO） δ 12.13 （s，1H），8.09 （d，J=7.2 Hz，1H），7.82～7.76 （m，1H），7.60（d，J=8.0 Hz，1H），7.48（t，J=7.2 Hz，1H），7.17（t，J=5.4 Hz，1H），4.09（d，J=6.0 Hz，2H），1.40（s，9H）；HR-ESI-MSm/z276.134 2 ［M+H］+（計算值為276.134 3，C14H18N3O3）。

2.2.2.6 化合物12b 操作同12a。使用試劑2-（3-N-叔丁氧羰基氨基丙酰氨基）苯甲酰胺（11b，0.85 g，2.77 mmol）反應得到白色固體0.74 g，即化合物12b。收率為92%；熔點為146～149 ℃。直接用于下一步反應。

2.2.2.7 化合物13a 室溫下，將2-（N-叔丁氧羰基氨基甲基）-4-羥基喹唑啉（12a，1.73 g，6.28 mmol）懸浮于60 mL 二氯甲烷中，依次加入三乙胺（1.76 mL，12.6 mmol）、N，N-二甲基-4-氨基吡啶（77 mg，0.63 mmol）和對甲苯磺酰氯（1.26 g，6.61 mmol），室溫下攪拌12 h。再向反應物中加入N-甲基-4-甲氧基苯胺（0.95 g，6.93 mmol），室溫下繼續(xù)攪拌12 h。將反應物倒入約50 mL 冰水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次50 mL，合并有機相，用飽和氯化鈉溶液洗，加入無水硫酸鈉干燥過夜，減壓除去乙酸乙酯，粗品經(jīng)柱色譜分離（乙酸乙酯∶石油醚=10%～20%），得到淡黃色固體1.61 g，即化合物13a。收率為65%；熔點為118～120 ℃；1H-NMR （600 MHz，d-DMSO）δ（ppm）δ7.68（d，J=8.4 Hz，1H），7.61（t，J=7.5 Hz，1H），7.21（d，J=8.4 Hz，2H），7.13～7.06（m，2H），7.00（d，J=9.0 Hz，2H），6.95（d，J=8.4 Hz，1H），4.29（d，J=6.0 Hz，2H），3.78（s，3H），3.52（s，3H），1.43（s，9H）；HR-ESI-MSm/z395.207 6 ［M+H］+（計算值為395.207 8，C22H27N4O3）。

2.2.2.8 化合物13b 操作同13a。使用試劑2-（N-叔丁氧羰基-2-氨基乙基）-4-羥基喹唑啉（12b，0.43 g，1.5 mmol）、三乙胺（0.56 mL，4.0 mmol）、N，N-二甲基-4-氨基吡啶（24 mg，0.2 mmol）和對甲苯磺酰氯（0.37 g，1.6 mmol）、N-甲基-4-甲氧基苯胺（0.22 g，1.6 mmol）反應得到淡黃色固體0.38 g，即化合物13b。收率為61%；熔點為106～108 ℃；1H-NMR（600 MHz，d-DMSO）δ（ppm）7.67（d，J=7.8 Hz，1H），7.59（t，J=7.8 Hz，1H），7.20（d，J=9.0 Hz，2H），7.07（t，J=7.2 Hz，1H），6.98（d，J=9.0 Hz，2H），6.96（d，J=8.4 Hz，1H），6.88（t，J=5.5 Hz，1H），3.78（s，3H），3.47～3.50（m，5H），2.95（t，J=7.3 Hz，2H），1.36（s，9H）；HR-ESI-MSm/z409.223 9 ［M+H］+（計算值為409.223 4，C23H29N4O3）。

2.2.2.9 化合物4a 將2-（N-叔丁氧羰基氨基甲基）-4-（N-甲基-4-甲氧基苯胺基）喹唑啉（13a，0.33 g，0.84 mmol）溶于5 mL 乙酸乙酯中，加入0.5 mL濃鹽酸，升溫至60 ℃攪拌6 h。向反應物中分別加入30 mL 乙酸乙酯和30 mL 水，分出水相，用質量濃度為50 g·L-1的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH 值至8，用乙酸乙酯萃取3 次，每次50 mL，合并有機相，用飽和氯化鈉溶液洗滌，加入無水硫酸鈉干燥過夜，減壓除去乙酸乙酯，得到褐色固體0.18 g，即化合物2-氨甲基-4-（N-甲基-4-甲氧基苯胺基）喹唑啉，收率為73%。將4H-吡咯［2，3-d］噻唑-5-甲酸（8，84 mg，0.5 mmol）溶于5 mLN，N-二甲基甲酰胺中，依次加入N，N-二異丙基乙基胺（0.22 mL，1.25 mmol）和HATU（285 mg，0.75 mmol），室溫下攪拌30 min，加入制備的2-氨甲基-4-（N-甲基-4-甲氧基苯胺基）喹唑啉（148 mg，0.5 mmol），繼續(xù)在室溫下攪拌24 h。將反應物倒入約50 mL 冰水中，析出固體物，抽濾，干燥，粗品經(jīng)柱色譜分離（甲醇-二氯甲烷，甲醇2.5%～5.0%），得到白色固體49 mg，即化合物4a。收率為22%；熔點為215～218 ℃；1H-NMR（600 MHz，d-DMSO）δ（ppm）12.49 （s，1H），8.95（s，1H），8.77（t，J=5.8 Hz，1H），7.69（d，J=7.6 Hz，1H），7.63～7.58（m，1H），7.25（t，J=3.6 Hz，1H），7.23～7.18（m，2H），7.08（ddd，J=8.3，6.9，1.2 Hz，1H），7.01～6.97（m，2H），6.97～6.93（m，1H），4.65（d，J=5.9 Hz，2H），3.79（d，J=6.8 Hz，3H），3.49（s，3H）；13C-NMR（150 MHz，DMSO）δ162.11，160.99，160.80，157.77，154.54，152.95，141.01，140.53，132.07，131.61，127.73，127.30（2*C），125.76，124.44，115.32（2*C），114.68，113.82，101.23，55.37，44.96，42.37；HR-ESI-MSm/z445.144 3 ［M+H］+（計算值為445.144 1，C23H21N6O2S）。

2.2.2.10 化合物4b 操作同4a。2-（N-叔丁氧羰基-2-氨基乙基）-4-（N-甲基-4-甲氧基苯胺基）喹唑啉（13b，0.41 g，1.0 mmol）經(jīng)脫Boc 保護得到褐色固體0.24 g，即化合物2-（2-氨基乙基）-4-（N-甲基-4-甲氧基苯胺基）喹唑啉，收率為78%。使用4H-吡咯［2，3-d］噻唑-5-甲酸（8，65 mg，0.39 mmol）、N，N-二異丙基乙基胺（0.17 mL，0.98 mmol）、HATU（225 mg，0.59 mmol）、2-（2-氨基乙基）-4-（N-甲基-4-甲氧基苯胺基）喹唑啉（120 mg，0.39 mmol）反應得到白色固體56 mg，即化合物4b。收率為31%；熔點為194～196 ℃；1H-NMR（400 MHz，d-DMSO）δ（ppm）12.39（s，1H），8.91（s，1H），8.34（s，1H），7.68（d，J=7.6 Hz，2H），7.61～7.57（m，1H），7.19（d，J=8.8 Hz，2H），7.10～7.03 （m，2H），6.98（d，J=8.8 Hz，2H），3.92～3.71（m，5H），3.49（s，3H），3.12（t，J=7.2 Hz，2H）；13C-NMR（100 MHz，d-DMSO）δ163.30，161.05，160.59，157.63，152.82，140.94，131.87，131.72，131.58，130.64，128.65，127.74，127.24（2*C），125.68，124.24，115.26（2*C），114.54，100.84，55.35，42.35，38.08，37.78；HRESI-MSm/z459.159 2 ［M+H］+（ 計算值為459.159 8，C24H23N6O2S）。

2.3 A549 腫瘤細胞增殖抑制活性的篩選

本實驗用磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）法［17-19］。取處于對數(shù)生長期的人肺癌A549 細胞接種于96 孔板中，密度約為1×105個·孔-1。37 ℃下培養(yǎng)24 h 后棄去上清液，空白組和對照組各加入100 μL 不含藥物的培養(yǎng)基，實驗組分別加入含陽性藥、化合物4a 和4b 的培養(yǎng)基，每組設置5 個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，用100 mL·L-1三氯乙酸在4 ℃下固定1 h，用純凈水洗滌5 次，風干。將存活的細胞在室溫下用4 g·L-1SRB 染色20 min，用10 mL·L-1乙酸洗滌5 次。將結合的SRB 溶解于10 mmol·L-1的Tris（緩沖液）中，用酶標儀測定540 nm 處的吸光度值，計算細胞生長抑制率。根據(jù)藥物濃度與抑制率作圖，計算GI50值，實驗平行3 次。陽性藥為紫杉醇。

經(jīng)測定，化合物4a 和4b 均有一定的體外腫瘤細胞增殖抑制活性，化合物4a 的活性強于4b，但均弱于紫杉醇。結果見表1。

表1 化合物4a、4b 抑制A549 細胞增殖的GI50值和抑制微管聚集的IC50值Tab.1 GI50 value against A549 and the IC50 value against tubulin polymerization of compounds 4a and 4b

2.4 體外微管蛋白聚集抑制活性的篩選

用循環(huán)離心法制備的豬腦微管蛋白進行活性測試［20-21］。將不同濃度的藥物與微管蛋白孵化后，在冰浴下加入GDP，轉移到0 ℃的比色杯中，隨后升溫至37 ℃，測定該過程中340 nm 處的吸光度值。與對照組比較，計算不同藥物濃度下的抑制率。根據(jù)藥物濃度與抑制率作圖，計算IC50值，實驗平行3 次。陽性藥為CA-4。

實驗結果顯示，4a 表現(xiàn)出了較弱的微管聚集抑制活性，但明顯弱于CA-4，4b 并未表現(xiàn)出明顯的微管聚集抑制活性。結果見表1。

3 討論

本實驗通過將化合物2、3 與微管蛋白的復合晶體結構進行疊合，利用“拼接”策略設計了化合物4a和4b，在合成4H-吡咯［2，3-d］噻唑-5-羧酸的基礎上，通過酰胺縮合、分子內成環(huán)、親核取代和酰胺縮合4 步反應合成了目標化合物，總收率分別為7.9%、11.3%，目標化合物結構經(jīng)1H-NMR、13C-NMR 和HR-ESI-MS 確證。

文獻報道的作用于秋水仙堿結合位點的化合物的微管聚集抑制活性與細胞增殖抑制活性一般相差上百倍，本文設計的化合物4a 和4b 在微管聚集抑制活性和細胞增殖抑制活性方面也表現(xiàn)出類似的特點，表明微管蛋白仍可能是化合物的主要作用靶點。化合物4a 的微管聚集抑制活性優(yōu)于4b，與分子對接的結果基本一致，表明計算機輔助設計結果具有一定的參考價值。但化合物4a 未表現(xiàn)出預期較化合物2、化合物3 更強的微管聚集抑制活性，可能與化合物分子結構中喹唑啉環(huán)和吡咯并［2，3-d］噻唑環(huán)間存在一定的剛性或連接鏈長度不合適有關，導致化合物4a 無法同時與化合物2、化合物3 相作用的所有氨基酸殘基形成相互作用。

盡管化合物4a 與化合物1、化合物2 相比腫瘤細胞增殖和微管聚集抑制活性差異較大，但腫瘤細胞增殖抑制活性卻僅略弱于化合物3 的活性更好的衍生物14（見圖5，A549 細胞IC50值為40 μmol·L-1）［12］。LI Y 等［22］報道了一類咔啉類化合物，其代表化合物15（見圖5）的結合位點與化合物3 基本重疊，機制研究發(fā)現(xiàn)化合物15 具有“分子膠水”的特征，能特異性誘導降解微管蛋白β亞基，在卵巢癌異種移植裸鼠模型中表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制活性，且無明顯的不良反應，表明可將化合物4a 作為先導化合物，進行深入的構效關系研究并開展類似的機制研究，得到具有臨床開發(fā)潛力的化合物。

圖5 化合物14 和15 的結構Fig.5 Structure of compounds 14 and 15

綜上所述，本研究通過藥物拼接的方法得到了一類新結構類型的verubulin 衍生物，其中化合物4a預期可占據(jù)微管蛋白秋水仙堿結合位點更廣泛的區(qū)域，這種基于復合晶體結構的分子“拼接”方法可為發(fā)現(xiàn)新型微管聚集抑制劑提供借鑒。