Plackett-Burman 設(shè)計(jì)結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法篩選草烏甲素納米乳凝膠貼膏的處方

何雨曉,李麗云,孫文強(qiáng),丁江生*,周云龍

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500；2.云南省藥物研究所，昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650111

草烏甲素是從毛莨科烏頭屬植物滇西嘟拉（Aconitum bulleyanumDiels）中分離出的生物堿——滇西嘟拉堿甲（bulleyaconitine A），屬于二萜雙酯型生物堿，是一種強(qiáng)效鎮(zhèn)痛劑和抗炎劑，臨床上應(yīng)用廣泛，用于治療各種原因?qū)е碌穆蕴弁础┬蕴弁?、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis）、骨關(guān)節(jié)炎、肌纖維炎、頸肩痛、腰腿痛等［1-4］。草烏甲素口服后的首過效應(yīng)明顯，生物利用度低。草烏甲素具有劑量小、藥效強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但由于其毒性和刺激性較大，肝臟首過效應(yīng)較強(qiáng)，因此認(rèn)為經(jīng)皮給藥是其比較理想的給藥途徑［5］。

納米乳是一種潛在的載體系統(tǒng)，與傳統(tǒng)劑型相比，納米乳具有良好的增溶能力和熱力學(xué)穩(wěn)定性，可以透過皮膚進(jìn)行藥物的輸送［6］。此外，納米乳具有良好的生物相容性，可以遞送親水性和親脂性藥物，可以解決藥物的溶解性低、滲透性低和生物利用度低的問題［7-8］。凝膠貼膏原名巴布劑，是將親水性基質(zhì)與原料藥混合后均勻涂布于合適的背襯材料上制成的可產(chǎn)生局部作用或全身作用的薄片狀外用制劑，對(duì)皮膚有良好的生物相容性、親和性、透氣性、耐汗性和追隨性，生物利用度高［9］。凝膠貼膏主要用于風(fēng)濕和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，近年逐漸用于治療支氣管疾病、心血管疾病、癌癥等，成為經(jīng)皮給藥新劑型的研究熱點(diǎn)［10-11］。本研究以納米乳作為草烏甲素藥物載體，以初黏力、持黏力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并且結(jié)合凝膠貼膏的外觀、皮膚追隨性、涂布性、透布狀況等感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)、Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化草烏甲素納米乳凝膠貼膏的基質(zhì)處方，以期制備出膏體均勻性好、黏性較高、皮膚追隨性好、涂布性優(yōu)良的凝膠貼膏。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PL203 型電子天平（梅特勒托利多公司）；STX1202ZH 型電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］；TF2RJ-100-DLZS-SB-ZJD61 型真空乳化攪拌機(jī)（溫州不富機(jī)械有限公司）；MS-H280-Pro 磁力攪拌器（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；NANO 微射流均質(zhì)機(jī)［諾澤流體科技（上海）有限公司］；ZJ-122-B 型初黏性測(cè)試儀（濟(jì)南格瑞特測(cè)試儀器有限公司）；ZJ-050-B 型持黏性測(cè)試儀（濟(jì)南賽成電子科技有限公司）；ZJ-077-B 型小型實(shí)驗(yàn)用涂布機(jī)（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）。

1.2 試藥

草烏甲素（云南淶文生物科技有限公司）；油酸（山西晉湘輔料有限公司）；聚氧乙烯40 氫化蓖麻油（RH-40，北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司）；二乙二醇單乙醚（transcutol P，法國(guó)嘉法獅公司）；NP-700（亞什蘭集團(tuán)公司）；PVP-K90（重慶斯泰克瑞登梅爾材料技術(shù)有限公司）；酒石酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；高嶺土（上海亮江鈦白化工制品有限公司）；甘油（西安晉湘藥用輔料有限公司）；甘羥鋁（陜西天正輔料有限公司）。

2 方法

2.1 草烏甲素納米乳凝膠貼膏的制備

2.1.1 草烏甲素納米乳的制備 將草烏甲素溶于油酸，再與乳化劑RH40 和助乳化劑transcutol P 混合，用磁力攪拌器攪拌，并不斷滴加純化水，攪拌1 h，攪拌溫度為55 ℃，攪拌速度為1 000 r·min-1。加入高剪切乳化機(jī)以一定速度剪切45 次，形成初乳。剪切好的初乳通過微射流均質(zhì)機(jī)以28 000 psi 的壓力均質(zhì)8 次，最終形成草烏甲素納米乳。

2.1.2 草烏甲素納米乳凝膠貼膏的制備 取處方量的酒石酸和PVP-K90，加入少量純化水預(yù)先過夜溶脹，置于60 ℃水浴鍋中充分溶解，作為A 相；取處方量的甘油、NP-700、甘羥鋁、高嶺土混合，攪拌均勻，作為B 相；納米乳作為C 相；先將C 相與A 相混合，混合均勻后，邊攪拌邊加入B 相中，以約60 r·min-1的速度手動(dòng)攪拌均勻，立即用涂布機(jī)涂布，密封保存。

2.2 凝膠貼膏的評(píng)價(jià)指標(biāo)

參考2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）第四部通則及相關(guān)文獻(xiàn)，以初黏力、持黏力、感官評(píng)價(jià)的綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選草烏甲素納米乳凝膠貼膏的基質(zhì)處方。

2.2.1 初黏力[1,12]參照《中國(guó)藥典》2020年版第四部通則0952 第一法，用滾球斜坡停止法測(cè)定草烏甲素納米乳凝膠貼膏的初黏力。板上畫有2 條相隔10 mm的水平線，上線為鋼球起始位置的標(biāo)記，下線為凝膠貼膏固定的標(biāo)記，將凝膠貼膏剪成長(zhǎng)為8 cm、寬為5 cm 的片，除去蓋膜，上端用雙面膠固定在板上2 條水平線的下線位置，膏面向上。調(diào)節(jié)底座使鋼板表面與水平面呈30°傾斜，以從大到小的順序取鋼球從水平線的上線自由滾落。記錄凝膠貼膏能黏住的最大鋼球號(hào)，以所有凝膠貼膏中測(cè)得的最大值為100 分，其余以（測(cè)得值/最高值）×100 計(jì)分。

2.2.2 持黏力[13]取2.1.2 項(xiàng)下4.0 cm×6.5 cm 凝膠貼膏1 片，除去蓋膜，以4.0 cm×4.0 cm 為測(cè)試面積，黏貼于垂直放置的清潔不銹鋼板上，記錄凝膠貼膏完全從鋼板上脫落的時(shí)間，重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值。以脫落時(shí)間最長(zhǎng)的計(jì)為滿分（100 分），其余的以（測(cè)得值/最長(zhǎng)值）×100 計(jì)分。

2.2.3 感官評(píng)價(jià)[14]以透布程度、涂展性、均勻性、皮膚追隨性為主觀考察指標(biāo)，各指標(biāo)的滿分均為25 分，總分為100 分。透布程度：肉眼觀察凝膠貼膏涂布一定時(shí)間后，無透布者為滿分（25 分）。涂展性：用涂布機(jī)涂布時(shí)，膏體不聚集成塊或斷條，易涂布，為滿分（25 分）。均勻性：制備的膏體均勻、無塊斑，為滿分（25 分）。皮膚追隨性：將成型的凝膠貼膏貼于手腕的背部，用力甩10 下不脫落者為滿分（25 分），分?jǐn)?shù)依據(jù)甩手次數(shù)的減少而降低。凝膠貼膏感官評(píng)分的具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：以感官評(píng)分、初黏力和持黏力的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.5、0.1。綜合評(píng)分=感官評(píng)分×0.4+初黏力×0.5+持黏力×0.1。

表1 凝膠貼膏感官評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Sensory scoring standard of the gel paste

2.4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)

用單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選各個(gè)因素的范圍，用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對(duì)所有因素進(jìn)行12 次實(shí)驗(yàn)，以2.1.2項(xiàng)下的綜合評(píng)分為指標(biāo)，因素和水平見表2。

表2 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)的因素和水平Tab.2 Factors and levels in Plackett-Burman design

2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

以Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，確定3 個(gè)顯著因素以選定爬坡的方向，并選擇合理步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)出最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的最佳路徑。

2.6 Box-Behnken 優(yōu)化設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以（A）甘油、（B）酒石酸、（C）純化水為因素，綜合評(píng)分作為響應(yīng)值，用Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，因素和水平見表3。

表3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的因素和水平Tab.3 Factors and levels in Box-Behnken design

2.7 數(shù)據(jù)分析

做3 次平行實(shí)驗(yàn)，用Design Expert 13.0 軟件對(duì)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)

對(duì)表3所列的Packett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，可以得到回歸模型方程：綜合評(píng)價(jià)=68.65-0.216 7A-0.3B+4.92C-3.0D+0.966 7E+1.0F-0.633G+0.433H，R2=0.996 8，表明模型顯著，擬合良好。

Plackett-Burman 設(shè)計(jì)結(jié)果見表4 和表5。由表5可知，8 個(gè)影響因子的顯著性排序?yàn)镃（甘油）＞D（酒石酸）＞F（純化水）＞E（PVP-k90）＞G（高嶺土）＞H（納米乳）＞B（甘羥鋁）＞A（NP-700），且C（甘油）、D（酒石酸）、F（純化水）3 個(gè)因素在8 個(gè)因素中最顯著。因此，確定以甘油、酒石酸和純化水作為最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)因素。

表4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.4 Results of Plackett-Burman design

表5 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析Tab.5 Significance test of the results of Plackett-Burman test

3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表6。由表6 可知，第4組實(shí)驗(yàn)的綜合評(píng)分最高，由此篩選出甘油的用量為35～45 g，酒石酸的用量為0.25～0.35 g、純化水的用量為35～45 g。

表6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab.6 Design and results of the steepest ascent experiment

3.3 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)分析

用Design Expert 13.0 軟件進(jìn)行Box-Behnken 數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表7。

表7 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Experimental results of Box-Behnken design

3.3.1 模型擬合和方差分析 用Design Expert 13.0軟件對(duì)表7 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸并進(jìn)行方差分析，得到的二次多元回歸模型方程為綜合評(píng)分=93.12+4.237 5A-4.825B+4.712 5C+1.475AB-0.2AC+5.375BC-11.335A2-8.41B2-4.085C2，R2＝0.980 5，表明該模型的擬合度良好，可對(duì)凝膠貼膏的性能進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。二次回歸方差分析的結(jié)果見表8。

由表8 可知，模型的整體水平達(dá)到極顯著水平（P＜0.000 1），表明該二次方程的模型具有極顯著意義，失擬值=0.943 1＞0.05，表明失擬項(xiàng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)際值和預(yù)測(cè)值不擬合發(fā)生的概率很低，表明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)性好，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、可靠。模型中A、B、C、BC、A2、B2具有顯著性，表明各個(gè)自變量與因變量之間不是線性關(guān)系，而是相互影響的關(guān)系。在各影響因素中，因素B和C對(duì)響應(yīng)值的影響最大，其次是因素A。

各因素對(duì)草烏甲素納米乳凝膠貼膏綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖1。響應(yīng)面圖和等高線圖可直觀地反映各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值。由圖1 可見，圖1-B、圖1-C 響應(yīng)面曲線較陡，表明因素B和C之間具有顯著性的交互作用，與方差分析的結(jié)果一致。等高線的形狀反映了各個(gè)影響因素之間交互作用的強(qiáng)弱，圖形越趨近于橢圓，表示2 個(gè)因素之間的交互作用越具有顯著性。由圖1 可見，因素B、C之間的交互作用最顯著。以響應(yīng)值最大為優(yōu)化目標(biāo)篩選最優(yōu)的基質(zhì)處方，得到的最優(yōu)處方條件為A＝40.877，B＝0.294，C＝42.491，即甘油40.877 g、酒石酸0.294 g、純化水 42.491 g，綜合評(píng)分為94.937 分。

圖1 各因素對(duì)草烏甲素納米乳凝膠貼膏綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour map of various factors to the comprehensive score of bulleyaconitine A nanoemulsion gel paste

3.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照最優(yōu)處方制備了3 批草烏甲素納米乳凝膠貼膏，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2 和表9。所制備的凝膠貼膏表面平整，無透布現(xiàn)象，皮膚追隨性好，黏性適中，綜合評(píng)分與預(yù)測(cè)值（94.937 分）接近，表明該方法穩(wěn)定、可靠，預(yù)測(cè)性良好。

圖2 草烏甲素納米乳凝膠貼膏外觀及涂展性和黏性Fig.2 Appearance， spread and viscosity of kusnezocin A nano emulsion gel paste

表9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（n=3）Tab.9 Results of the validation test （n=3）

4 討論

在草烏甲素納米乳凝膠貼膏基質(zhì)處方的篩選過程中，由于影響凝膠貼膏基質(zhì)的因素較多，故需要開展多次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。本研究以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合Plakett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)、Box-Behnken響應(yīng)面法減少了篩選的步驟。Plackett-Burman 設(shè)計(jì)能用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)篩選并確定對(duì)結(jié)果影響比較顯著的因素，避免在后期的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中由于部分因素不顯著而浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)資源，其已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、質(zhì)量控制和食品科學(xué)等領(lǐng)域［15-16］。響應(yīng)面法的原理是基于多項(xiàng)式數(shù)學(xué)關(guān)系的生成和響應(yīng)在實(shí)驗(yàn)域上的映射來選擇最佳公式。Box-Behnken 設(shè)計(jì)是一種可用于配方統(tǒng)計(jì)優(yōu)化的發(fā)散型RSM 設(shè)計(jì)。該設(shè)計(jì)提供了一種比常規(guī)劑型優(yōu)化技術(shù)更有效的方法，因?yàn)樗s短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間、降低了實(shí)驗(yàn)成本［17-18］。與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及均勻設(shè)計(jì)比較，Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化更適合處方配比復(fù)雜、各因素之間存在交互作用的凝膠貼膏處方的設(shè)計(jì)。因此，本研究以Plackett-Burman 設(shè)計(jì)選擇顯著因子，以爬陡坡實(shí)驗(yàn)篩選出因素范圍，以Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化、篩選出最優(yōu)的處方，用最優(yōu)處方制備的凝膠貼膏膏體均勻平整，黏性適中，并且可以反復(fù)貼揭，沒有殘留，用涂布機(jī)涂布時(shí)有很好的涂展性，未出現(xiàn)透布的現(xiàn)象。

在研究的過程中發(fā)現(xiàn)以下幾個(gè)問題：①凝膠貼膏的含水量會(huì)影響凝膠貼膏的黏性，通常建議含水量為30%～60%［19］，并且在制劑保存的時(shí)候要密封保存，選擇合適的包材進(jìn)行包裝，防止其由于過度吸濕或者過度干燥導(dǎo)致膏體的性能發(fā)生改變。②納米乳的添加量對(duì)凝膠貼膏的基質(zhì)也有影響，因?yàn)榧{米乳本身就具有黏性，納米乳的添加量過多會(huì)導(dǎo)致膏體過黏，無法涂布。③膏體的攪拌時(shí)間和攪拌速度是凝膠貼膏制備過程中很重要的影響因素。攪拌時(shí)間過長(zhǎng)、交聯(lián)反應(yīng)過度會(huì)導(dǎo)致膏體硬度過大不易涂布［20］；攪拌時(shí)間過短、交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間過短，則無法形成膠團(tuán)；攪拌速度過快，容易造成膏體中的氣泡過多，且會(huì)導(dǎo)致剪切力過大，使膏體內(nèi)部各物質(zhì)的鏈接被破壞從而導(dǎo)致黏性下降；攪拌的速度過慢，則基質(zhì)較難混勻［21］。攪拌的時(shí)間一般控制在10～20 min，且攪拌時(shí)應(yīng)順著同一個(gè)方向［22］，攪拌時(shí)如果出現(xiàn)氣泡可以用真空泵或者真空干燥箱去除氣泡［23-24］。④交聯(lián)時(shí)環(huán)境條件（如溫度、相對(duì)濕度）也會(huì)對(duì)膏體性能產(chǎn)生影響。溫度高時(shí)，膏體相對(duì)較軟，成形較快，容易混合均勻，但是會(huì)影響膏體的黏性并且容易透布；溫度低時(shí)，膏體攪拌會(huì)很困難，并且很難混合均勻，攪拌的溫度一般控制在50～60 ℃［25］。