抗禽白血病的研究進(jìn)展

王樂成，余春林，王 珍，楊朝武，蘭 茜，王海威

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；3.西南大學(xué)，重慶 400715）

禽白血?。ˋvian leukemia，AL）是禽白血病病毒（Avian leukemia virus，ALV）感染引起的一類高傳染性疾病的統(tǒng)稱[1]。ALV 的感染通常會(huì)造成組織不同程度的癌變以及機(jī)體的免疫抑制[2,3]。根據(jù)ALV 囊膜蛋白的抗原差異、宿主范圍差異、基因組結(jié)構(gòu)特征將ALV 分為了A～K 11 個(gè)亞群。在這11 個(gè)亞群中，ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-D、ALV-E、ALV-J、ALV-K 是感染雞的亞群，其中ALV-E 是內(nèi)源性ALV，ALV-J 是我國目前主要流行的亞群，特別是在我國地方品種雞上[4-6]。幾乎每只雞的基因組上都有ALV-E 基因組的片段或全部，ALV-E 在基因組上的存在被認(rèn)為是某種外源性ALV 感染后在基因組上的殘留[7]。ALV-E 的致病性很弱，并且只有極少部分位點(diǎn)具有完整的ALV-E 基因組片段，所以相對(duì)而言ALV-E 的流行情況并不嚴(yán)重，但ALV-E 對(duì)外源ALV 的感染影響較大。ALV 的主要傳播方式是水平傳播和垂直傳播，由于ALV-E的存在，它還有一種較為特殊的傳播方式——遺傳性傳播。

ALV 屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科正反轉(zhuǎn)錄病毒亞科α反轉(zhuǎn)錄病毒屬成員，具有禽C 型反轉(zhuǎn)錄病毒的特征。ALV 粒子大體呈球形，直徑80～120nm，平均直徑90nm。從外向內(nèi)分別是外膜、中間膜和內(nèi)部中心電子密集核。ALV 基因組的結(jié)構(gòu)和其他反轉(zhuǎn)錄病毒類似，從5' 端至3' 端分別是：5' 端LTR、gag、pol、env、3'端LTR。LTR 具有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性，ALV 引起腫瘤的主要原因是因?yàn)锳LV 插入到調(diào)控細(xì)胞增殖分裂相關(guān)的基因附近，LTR 讓這些基因表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖引起癌變。Gag 基因主要編碼ALV 的衣殼蛋白，gag編碼的p27 蛋白由于其在亞群內(nèi)的高保守性以及亞群間的高特異性被用于開發(fā)檢測(cè)ALV 的ELISA 試劑盒；pol基因主要編碼病毒的整合酶和反轉(zhuǎn)錄酶，是病毒整合到宿主基因組的關(guān)鍵基因；env基因編碼病毒的囊膜蛋白，囊膜蛋白不僅是ALV 分類的重要依據(jù)，其編碼的gp85 表面蛋白還是介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵位點(diǎn)[5]。目前關(guān)于ALV 抗病育種的相關(guān)研究大多是圍繞阻止ALV 病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行的。

通過基因編輯技術(shù)研究抗ALV 雞，或許是防治ALV 感染的有效手段。自從雞被人類馴化以來，人類對(duì)其產(chǎn)蛋量、產(chǎn)肉量、蛋品質(zhì)、肉品質(zhì)等進(jìn)行了專門的遺傳選擇，使這些性狀有了較大改善。由于人們對(duì)抗病性狀的認(rèn)識(shí)時(shí)間相對(duì)較短，并且抗病性狀屬于域性狀，遺傳機(jī)制復(fù)雜，所以導(dǎo)致了針對(duì)某些疾病的抗病育種工作難以短時(shí)間內(nèi)見到成效。本文從ALV 受體、內(nèi)源性ALV（ALV-E）對(duì)外源性ALV 感染的影響以及近些年通過高通量測(cè)序技術(shù)找到的與抗ALV 感染相關(guān)基因入手，對(duì)ALV 抗病育種進(jìn)行了綜述以期為今后的ALV 抗病育種工作帶來一定參考。

1 抗禽白血病相關(guān)研究綜述

1.1 ALV 受體研究進(jìn)展

禽白血病病毒致病的前提是ALV 進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖，ALV 能非特異性的吸附到細(xì)胞膜上，但是ALV 能否進(jìn)入細(xì)胞取決于細(xì)胞膜上ALV 的特異性受體。ALV 囊膜蛋白（env）與特異性受體結(jié)合后，引起受體構(gòu)象變化，進(jìn)而導(dǎo)致病毒與宿主細(xì)胞膜的融合。不同的ALV 亞群進(jìn)入細(xì)胞依賴的受體不同，感染雞的ALV 亞群的受體所對(duì)應(yīng)的基因分別是Tva（ALV-A）、Tvb（ALV-B）、Tvc（ALV-C）、chNHE1（ALV-J）。

1.1.1 ALV-A 受體研究進(jìn)展

A 亞型禽白血病病毒的受體基因編碼的蛋白屬于低密度脂蛋白受體家族，介導(dǎo)“鈷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-維生素B12”復(fù)合體的吸收[8]。編碼該受體蛋白的基因在某些位點(diǎn)發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞對(duì)ALV-A 產(chǎn)生抗性，自然界中普遍存在對(duì)ALV-A有抗性的雞。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Tva 基因存在6 個(gè)自然的抗性位點(diǎn)，分別是Tvar1、Tvar2、Tvar3、Tvar4、Tvar5和Tvar6。Tvar1是堿基序列第619 位的C 突變?yōu)镚 造成[9]；Tvar2是堿基序列305～306 位間插入CTCG 造 成[10]；Tvar3、Tvar4、Tvar5和Tvar6是Tva第1 個(gè)內(nèi)含子不同位點(diǎn)的缺失突變導(dǎo)致終止密碼子TGA 提早出現(xiàn)，干擾了mRNA 的剪切[11]，這些突變最終導(dǎo)致了缺陷型Tva 蛋白產(chǎn)生。在對(duì)Tva 蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，其49～71 位的殘基是介導(dǎo)ALV-A 進(jìn)入的最小功能結(jié)構(gòu)域[12]。其中，L55和W69 是介導(dǎo)ALV-A 進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵殘基，把L55 和W69取代后，消除了Tva 與ALV-A 囊膜蛋白間的相互作用，使Tva 無法識(shí)別ALV-A[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)，我國特有的ALV-K 也通過Tva 受體進(jìn)入細(xì)胞，在DF1 細(xì)胞中將Tva 基因敲除后，DF1 細(xì)胞表現(xiàn)出了明顯的ALV-K 抗性[13]。然而目前并沒有關(guān)于ALV-K 的自然抗性位點(diǎn)的報(bào)道，但Li 等[14]研究指出，介導(dǎo)ALV-K 進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵Tva 殘 基是E53、L55、H59 和G70。

1.1.2 ALV-B/D/E 受體研究進(jìn)展

B/D/E 亞型禽白血病病毒的受體基因編碼的蛋白屬于腫瘤壞死因子受體（Tumor necrosis factor receptor,TNFR）家族，但是目前并不了解雞Tvb 蛋白的具體功能。根據(jù)TNFR 家族特性猜測(cè)雞Tvb 蛋白是一種功能性死亡受體，并發(fā)現(xiàn)Tvb蛋白的胞質(zhì)側(cè)含有“Death Domain”，可以通過激活caspase 途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。Brojatch 等[16]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用ALV-B 對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行攻毒時(shí)雞胚成纖維細(xì)胞會(huì)發(fā)生死亡。Tvb 蛋白在細(xì)胞外側(cè)含有3 個(gè)與ALV-B/D/E 感染相關(guān)的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域（CRD1、CRD2、CRD3）。目前鑒定到了7 個(gè)經(jīng)典的與ALV-B/D/E 抗性相關(guān)的等位基因，分別是Tvbs1、Tvbs3、Tvbr、Tvbr2、Tvbr3、Tvbr4和Tvbr5。Tvbs1編碼的受體蛋白對(duì)ALV-B/D/E 易感，Tvbs3編碼的受體蛋白對(duì)ALV-B/D 易感，而對(duì)ALV-E 具有抗性。Tvbs1和Tvbs3的主要區(qū)別在于CRD2 結(jié)構(gòu)域中的第62 位殘基，其中Tvbs1是Cys，而Tvbs3是Ser[17,18]。這種突變改變了CRD2 的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致宿主對(duì)ALV-E產(chǎn)生抗性。Tvbr編碼的蛋白對(duì)ALV-B/D/E 具有抗性，Tvbr抗性的產(chǎn)生是因?yàn)槠鹗济艽a子下游第172 位的“C”被“T”取代，導(dǎo)致終止密碼子提早出現(xiàn)，使CRD1 結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變[18]。Tvbr2對(duì)ALV-B/E 抗性的產(chǎn)生是因?yàn)镃DR3 結(jié)構(gòu)域第125位半胱氨酸被絲氨酸取代導(dǎo)致[19]。Tvbr3對(duì)ALV-B/D/E 抗性的產(chǎn)生是因?yàn)槠鹗济艽a子下游第298 位的“C”被“T”取代，導(dǎo)致終止密碼子提早出現(xiàn)，產(chǎn)生了截?cái)嗟腡vb 蛋白[20]。據(jù)李昕鍵[21]報(bào)道，Tvbr4和Tvbr5對(duì)ALV-B/D/E 的抗性是因?yàn)椴迦胪蛔兯?，Tvbr4是在Tvb 基因組第3667～3668 位插入了“AG”，致使CRD2 結(jié)構(gòu)域從第98 位氨基酸出現(xiàn)移碼，并在CRD3 結(jié)構(gòu)域的第131 位氨基酸終止；Tvbr5是在Tvb 基因組第3736-3737 位間插入“A”，導(dǎo)致CRD3 結(jié)構(gòu)域第190 位氨基酸提前出現(xiàn)終止密碼。

1.1.3 ALV-C 受體研究進(jìn)展

相對(duì)其他幾個(gè)亞群，與ALV-C 受體相關(guān)的研究較少。Tvc 編碼的蛋白屬于免疫球蛋白超家族，目前并不知曉Tvc 蛋白在雞上的具體作用，但該蛋白在細(xì)胞外側(cè)含有2 個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（IgV 和IgC），這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是ALV-C 進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域[5]，特別是IgV 結(jié)構(gòu)域的第48 位的色氨酸和第105 位的酪氨酸被認(rèn)為是受體-病毒相互作用的決定因素[22]。

1.1.4 ALV-J 受體研究進(jìn)展

J 亞型禽白血病病毒的受體基因是雞鈉氫離子交換體（Chicken Na+/H+exchanger type 1,chNHE1），負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞的酸堿平衡，屬于管家蛋白。chNHE1 基因編碼的蛋白定位在細(xì)胞膜上，該蛋白跨膜12 次，有6 個(gè)胞外環(huán)，5 個(gè)胞內(nèi)環(huán)。目前在全球范圍內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)任何雞種或某一家系對(duì)ALV-J 具有抗性，這或許也是ALV-J 在我國流行的原因。chNHE1 的第一個(gè)胞外環(huán)被認(rèn)為是ALV-J 與chNHE1 相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)chNHE1 的第一個(gè)胞外環(huán)的第38 位色氨酸缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)ALV-J 產(chǎn)生抗性[23,24]。這或許能為我們開展ALV-J 抗病育種帶來便利。然而，最近有報(bào)道指出，ALV-J 的受體蛋白還有雞膜聯(lián)蛋白A2（chANXA2）[25]以及雞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（chGRP78）[26]，不 過chANXA2 和chGRP78 可能是介導(dǎo)ALV-J 感染的次要受體[5]。Mo 等[27]研究表明，慢羽雞dPRLR 基因編碼的蛋白可能也是ALV-J 的受體，dPRLR 是慢羽雞特異性表達(dá)的基因。

1.2 ALV-E 對(duì)ALV 易感性的研究進(jìn)展

脊椎動(dòng)物基因組上存在大量的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous retroviruses，ERVs）位點(diǎn)[28]，這些ERVs 可能是在進(jìn)化過程中外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后在宿主基因組上的殘留[29]。ERVs 在基因組上通常是有缺陷的，他們有的不能正常轉(zhuǎn)錄，有的僅能表達(dá)部分病毒基因，不過也有少量ERVs 能正常表達(dá)[28]。在雞上，ERVs 約占基因組的3%，而ALV-E 是在禽上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)ERVs[29]。以前通常認(rèn)為ERVs 是基因組上無效甚至有害的DNA 片段，但目前已經(jīng)有研究表明，ERVs 的存在可以對(duì)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生復(fù)雜影響[5]。

雞的基因組上有大量的內(nèi)源性ALV（ALV-E）位點(diǎn)，即ev 位點(diǎn)，但絕大多數(shù)的ev 位點(diǎn)均有缺陷，缺少自我復(fù)制所必須的基因或只含有“LTR”，僅有少部分相對(duì)完整的ev 位點(diǎn)，如ev7、ev9、ev21 等[30]。Ev 位點(diǎn)的存在對(duì)雞的抗病性狀、繁殖性狀和生長(zhǎng)性狀均有影響[31]。早期的研究發(fā)現(xiàn)ev21 與慢羽基因完全連鎖，慢羽白來航雞對(duì)ALV 易感性的增加、病死率的上升被認(rèn)為與ev21密切相關(guān)，但是直到現(xiàn)在仍不清楚其中的具體機(jī)制[5,31]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)ev21 在某些雞種上與慢羽基因并不呈完全連鎖，例如，慢羽雄性太行雞ev21 的陽性率為86.1%，慢羽雌性太行雞ev21 的陽性率為78.9%[32]。除了ev21 的存在影響ALV 的易感性外，Smith 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，ev6 陽性雞對(duì)ALV-A 的易感性和感染ALV-A 后的致瘤率都顯著高于ev6 陰性雞。此外，擁有完整ev 位點(diǎn)的雞在接種馬立克疫苗或感染馬立克病毒后發(fā)生淋巴細(xì)胞白血病的概率會(huì)增加[34]。含有某些ev 位點(diǎn)的雞對(duì)ALV 具有易感性，可能與這些ev 位點(diǎn)所轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA 有關(guān)，如ALV-J感染后，ERV-L 家族編碼的可以與免疫球蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合的Lnc-LTR5B 減少，進(jìn)而促進(jìn)ALV-J在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[35]。Ev 位點(diǎn)的存在除了可以促進(jìn)ALV 感染外，還可以抵抗ALV 感染，例如，ev1 編碼的Lnc-ALVE1-AS1 可以通過激活TLR3 通路激活先天性免疫反應(yīng)來阻止病毒感染[36]；ALV-J 感染后，ev1 可以通過促進(jìn)OAS、PKR 和IFN-β、IFN-γ 的表達(dá)，來抑制外源性病毒的復(fù)制[37]。總體來看，ev 位點(diǎn)的存在有好也有壞，不過不含ev 位點(diǎn)雞[38]的成功培育表明，ev 位點(diǎn)的缺失并不影響雞的生存，這為將來較好的利用ev 位點(diǎn)提供了參考。

1.3 利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得的與ALV 抗感染相關(guān)基因

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的日漸成熟，近年來發(fā)現(xiàn)了許多與ALV 感染相關(guān)的非編碼RNA。ALV-miRNA-p19-01 通過與特異性雙磷酸酶6 的正向結(jié)合調(diào)控ERK2 活性來促進(jìn)ALV-J 的復(fù)制[39]。Yu 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，gga-miR-148a-5p 可以靶向PDPK1 抑制ALV-J 感染的CEF 細(xì)胞的增殖，從而在一定程度上減小ALV-J 感染后雞患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。Yang 等[41]發(fā)現(xiàn)Circ_PIAS1 通過上調(diào)miR-183的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響ALV-J 感染，不過miR-183 通過何種途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡還有待研究。DF1 細(xì)胞感染ALV-J 后，lnc-ALVE1-AS1 的表達(dá)降低，但過表達(dá)lnc-ALVE1-AS1 后可以顯著抑制ALV-J 的復(fù)制。除了非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)也找到了大量與ALV 感染相關(guān)的差異基因，然而在這些差異基因里面只有少數(shù)被了解。Yan 等[42]通過RNA-seq 找到了515 個(gè)ALV-J 易感雞和正常雞的差異基因，但僅發(fā)現(xiàn)TGFB2 的過表達(dá)能促進(jìn)ALV-J 的復(fù)制。張會(huì)永等[43]通過RNA-seq 在感染和未感染ALV-J 的汶上蘆花雞的肝臟組織中找到了76 差異基因，但是這些基因在ALV-J 感染中起著什么作用還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，ATAC-seq、scRNA-seq、meRIP-seq、GWAS 等高通量測(cè)序技術(shù)也被用于探究ALV 的致病原因，伴隨著這些技術(shù)的應(yīng)用，產(chǎn)生了大量的數(shù)據(jù)，但是大多試驗(yàn)僅挖掘了其中的部分信息，其中能用于抗病育種的數(shù)據(jù)可能被忽視了。

1.4 基因編輯技術(shù)在ALV 抗病育種上的應(yīng)用

規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR）技術(shù)被認(rèn)為是培育ALV-J 抗性雞的重要技術(shù)，雖然CRISPR 技術(shù)在生產(chǎn)基因編輯哺乳動(dòng)物上已經(jīng)很成熟，但在禽類上的運(yùn)用卻相對(duì)落后，主要原因是禽類胚胎細(xì)胞難以獲得以及獲得后難以對(duì)其進(jìn)行操作[44]。Lavioir 等[45]成功實(shí)現(xiàn)對(duì)雞原始生殖細(xì)胞（Primordial Germ Cells，PGC）的體外培養(yǎng)以及個(gè)體間移植后，為雞的基因編輯帶來了可能。PGC 是精子和卵子的前體，可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)，將它轉(zhuǎn)入受體雞后，受體雞可以產(chǎn)生相應(yīng)配子。基因編輯雞培育的第一步是獲得供體雞的PGC，這些PGC 可以是剛分離的也可以是在體外培養(yǎng)的；第二步是將CRISPR 系統(tǒng)導(dǎo)入PGC；第三步是將經(jīng)過編輯的PGC 移植到受體雞；第四步是產(chǎn)生F1 代的嵌合體雞；第五步是通過F1 代嵌合體雞間的交配獲得純和個(gè)體[46]。Anna 等[47]通過CRISPR／Cas9 成功在雞PGC 中敲除了ALV-J 受體chNHE1 胞外環(huán)的W38 位點(diǎn)，并成功獲得了敲除個(gè)體，同時(shí)敲除個(gè)體對(duì)ALV-J 表現(xiàn)出了抗性，這意味著通過CRISPR 技術(shù)培育ALV-J 抗性雞是可行的，為ALV 抗病育種奠定了一定的基礎(chǔ)。CRISPR 基因編輯技術(shù)雖然已經(jīng)較為成熟，但還存在著一些亟需解決的問題。除倫理、道德、法律、動(dòng)物福利等問題外，限制CRISPR 技術(shù)應(yīng)用的最大障礙是脫靶效應(yīng)[48]。脫靶效應(yīng)是Cas9 切割與靶標(biāo)DNA 片段相似的位點(diǎn)造成，這可能會(huì)導(dǎo)致一些災(zāi)難性的后果。另外，限制CRISPR 技術(shù)在家禽中運(yùn)用的另一技術(shù)問題是CRISPR／Cas 系統(tǒng)在禽類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率低[49]。家禽業(yè)目前正在經(jīng)歷一場(chǎng)基因編輯革命，雖然其中還存在一些問題，相信在將來會(huì)實(shí)現(xiàn)通過對(duì)家禽基因組的精確編輯快速獲得目標(biāo)性狀[50]。

2 小結(jié)

在ALV 流行的背景下，培育抗ALV 感染品系雞似乎成了解決ALV 流行問題的關(guān)鍵。宿主可通過阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞和病毒進(jìn)入細(xì)胞后阻止其繁殖來抵抗感染。本文首先對(duì)近年來發(fā)現(xiàn)的禽白血病病毒受體及其相關(guān)的抗性位點(diǎn)進(jìn)行了描述。在感染雞的幾類ALV 中，除了ALV-J 沒有在自然界中找到抗性雞外，其它幾類ALV 都在自然群體中找到了抗性雞，并找到了相關(guān)抗/易感位點(diǎn)。雖然沒找到抗ALV-J 感染雞，但卻找到了與ALV-J 易感性相關(guān)的受體蛋白相關(guān)位點(diǎn)。在高通量測(cè)序技術(shù)普及的背景下，我們對(duì)近年來利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的與抗ALV 感染的相關(guān)分子進(jìn)行了綜述，發(fā)現(xiàn)了一些與ALV 感染相關(guān)的分子，這些分子可能會(huì)在將來的抗ALV 感染新品種培育中起關(guān)鍵作用。利用基因編輯技術(shù)是一種能極大縮短育種年限的技術(shù)，特別是在培育抗ALV-J 感染的雞種上，因?yàn)槟壳安]有找到抗ALV-J 感染的自然雞群，并且ALV-J 也是在我國地方雞種上廣泛流行的ALV。