谷胱甘肽酵母水解物對(duì)干露脅迫下凡納濱對(duì)蝦肝胰腺糖代謝相關(guān)基因的影響

陳建東，張 玲，程 濤，胡祥娜，楊 凡，易建華，楊志龍，李兆文，譚北平，遲淑艷，曹愛(ài)巧

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518055；3.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443003)

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對(duì)蝦，有生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩和適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，已成為全球最主要的養(yǎng)殖甲殼類動(dòng)物之一。在捕撈和無(wú)水運(yùn)輸時(shí)，凡納濱對(duì)蝦會(huì)遭遇干露。干露是對(duì)蝦在自然環(huán)境、繁殖或運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程常見(jiàn)的問(wèn)題[3]，但會(huì)造成對(duì)蝦的低氧脅迫，引起氧化應(yīng)激，擾亂內(nèi)源性穩(wěn)態(tài)，對(duì)肝胰腺組織細(xì)胞造成損傷[4]，導(dǎo)致對(duì)蝦死亡和肉質(zhì)下降[5]。因此，提高對(duì)蝦抵御干露脅迫的能力對(duì)于提高鮮蝦產(chǎn)品品質(zhì)有重要意義。

谷胱甘肽，L-γ-谷氨酰-L-胱氨酰甘氨酸，是一種三肽類物質(zhì)，普遍分布在活細(xì)胞中[6]，主要有還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）兩種形式[7]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛。研究表明，飼料中添加GSH 可提高草魚（Ctenopharyngodon idella）[8]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[9]、虹鱒（Oncorhynchusmykiss）[10]、吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）[11]、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[12]和凡納濱對(duì)蝦[13]的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力及免疫力。酵母水解物含有β-葡聚糖、GSH、核苷酸和甘露寡糖等免疫刺激物質(zhì)[14]，作為原料或飼料添加劑可改善養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、非特異性免疫及緩解炎癥[15-17]。添加16.2 g/kg 的酵母水解物可使凡納濱對(duì)蝦獲得最佳的生長(zhǎng)；添加到50 g/kg也不會(huì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，并可有效提高對(duì)副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的抵抗力[18]；補(bǔ)充酵母水解物還可提高凡納濱對(duì)蝦消化酶活性以及抵抗低鹽脅迫的能力[14,19]。本研究探討富含谷胱甘肽的酵母水解物在凡納濱對(duì)蝦飼料中的使用效果，主要關(guān)注其對(duì)干露脅迫下的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺糖代謝相關(guān)基因的影響，為谷胱甘肽酵母水解物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼料配制

以基礎(chǔ)飼料（魚粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.7%）為對(duì)照組，在基礎(chǔ)飼料中分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%的比例添加谷胱甘肽酵母水解物（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的GSH，安琪酵母股份有限公司），分別記為G0、G0.3、G0.5、G0.7、G0.9、G1.1。飼料原料粉碎后過(guò)孔徑180 μm 的篩，所有原料混勻，制成粒徑為1.0、1.5 mm 的顆粒飼料，自然風(fēng)干至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約10%，分裝密封后置于-20 ℃冰箱中存放待用。實(shí)驗(yàn)飼料組分和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table l Mass fraction of ingredient of experimental diets%

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用商品飼料飼喂實(shí)驗(yàn)蝦（湛江國(guó)聯(lián)水產(chǎn)種苗科技有限公司），暫養(yǎng)2 周后，禁飼24 h，挑選出活力強(qiáng)、規(guī)格均勻、初始體質(zhì)量（0.24±0.01）g 的幼蝦，隨機(jī)分配于6 個(gè)處理組，每處理3 重復(fù)（0.3 m3玻璃鋼桶），每桶30 尾蝦。投喂實(shí)驗(yàn)飼料養(yǎng)殖4 周。每天7:00、11:30、16:30、21:00 各投喂1次，每天投喂40 min 后檢查攝食情況，根據(jù)對(duì)蝦攝食情況及天氣情況調(diào)整投喂量。養(yǎng)殖期間每天換水量近50%，水溫28～31 ℃，鹽度10～12 g/L，pH 值7.5～8.3，溶氧質(zhì)量濃度大于5 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度小于0.03 mg/L。

1.3 樣品采集及分析

在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有蝦禁飼24 h，計(jì)數(shù)、稱質(zhì)量，計(jì)算凡納濱對(duì)蝦的增重率（WGR）、特定生長(zhǎng)率（SGR）和飼料系數(shù)（FCR）。每個(gè)重復(fù)取4 尾對(duì)蝦的肝胰腺組織于RNA later中，檢測(cè)干露脅迫前凡納濱對(duì)蝦肝胰腺相關(guān)基因的表達(dá)。

從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取對(duì)蝦10 尾，在陰暗處（室溫26 ℃，濕度85%）干露30 min。取4 尾對(duì)蝦肝胰腺組織于RNA later中，檢測(cè)干露脅迫后凡納濱對(duì)蝦肝胰腺相關(guān)基因的表達(dá)。

1.4 肝胰腺相關(guān)基因的表達(dá)分析

用Trizol Reagent（TransGen Biotech，中國(guó)）提取肝胰腺的總RNA，用分光光度計(jì)（ND-2000，Nano-Drop Technologies，Wilmington，美國(guó)）評(píng)估RNA 質(zhì)量。將合格的RNA 作為反轉(zhuǎn)錄模板，使用Evo M-MLV RT Mix 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）合成cDNA。用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒II（湖南艾科瑞生物工程有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（Roche LightCycler?480），分析缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1α）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）、己糖激酶（HK）、果糖磷酸激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脫氫酶（LDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、蘋果酸脫氫酶（MDH）和細(xì)胞色素氧化酶（CCO）等基因的相對(duì)表達(dá)。10 μL 反應(yīng)體系包含cDNA 模板1 μL，正反向引物各0.5 μL，2 × SYBR?Green Pro Taq HS Premix II 5 μL，無(wú)菌雙蒸水3 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。用β-actin作參考基因，2-ΔΔCT方法用于計(jì)算基因的表達(dá)水平。用于qRT-PCR分析的引物見(jiàn)表2。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)，先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析，若組間差異顯著，再用Tukey’s 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，同一處理組干露脅迫前后進(jìn)行t-檢驗(yàn)，顯著性水平α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 谷胱甘肽酵母水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

由圖1 所示，各處理組之間的凡納濱對(duì)蝦增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明飼料中添加不同水平谷胱甘肽酵母水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響。

圖1 谷胱甘肽酵母水解物水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響Fig.1 Effect of glutathione yeast hydrolysate on growth performance of Litopenaeus vannamei

2.2 干露脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺HIF-1α 表達(dá)的影響

如圖2所示，在干露脅迫前，各處理組之間的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺HIF-1α基因的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）。在干露脅迫后，G0 組的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺HIF-1α基因的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。

圖2 在干露脅迫前后凡納濱對(duì)蝦肝胰腺HIF-1α基因的表達(dá)Fig.2 Expression of hepatopancreatic HIF-1α genes in Litopenaeus vannamei before and after air exposure

2.3 干露脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺糖酵解關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

如圖3 所示，關(guān)于對(duì)蝦肝胰腺GLUT1基因表達(dá)，在干露脅迫前，G0 組顯著低于G0.5 和G0.9 組（P＜0.05）；在干露脅迫后，各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）；同一處理組在干露脅迫前后均未呈現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。干露脅迫前后各處理對(duì)蝦肝胰腺HK和PFK基因的表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。G0 組對(duì)蝦肝胰腺PFK基因表達(dá)在干露脅迫后顯著上調(diào)（P＜0.05）。在干露脅迫前，各處理組間對(duì)蝦肝胰腺PK基因的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0 組對(duì)蝦肝胰腺PK基因的表達(dá)量顯著高于G1.1組（P＜0.05），但與其他處理組相比差異不顯著（P＞0.05）。在干露脅迫前，各處理組間對(duì)蝦肝胰腺LDH基因的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0 組對(duì)蝦肝胰腺LDH基因顯著上調(diào)（P＜0.05），且顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

2.4 干露脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

如圖4所示，關(guān)于對(duì)蝦肝胰腺SDH基因的表達(dá)，在干露脅迫前，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0 和G1.1 組均下調(diào)（P＜0.05），G0組表達(dá)量顯著低于G0.3、G0.5和G0.7組（P＜0.05）。肝胰腺M(fèi)DH基因的表達(dá)，在干露脅迫前，各處理組差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0組顯著下調(diào)（P＜0.05），且顯著低于G0.3、G0.5、G0.7 和G0.9組（P＜0.05）。對(duì)蝦肝胰腺CCO基因的表達(dá)，在干露脅迫前，G0 組低于G0.3 和G0.7 組（P＜0.05），但與其他組相比差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0、G0.3和G1.1組均顯著下調(diào)（P＜0.05），G0組的表達(dá)量顯著低于G0.5和G0.7組（P＜0.05）。

圖4 在干露脅迫前后凡納濱對(duì)蝦肝胰腺SDH、MDH和CCO基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of hepatopancreatic SDH,MDH and CCO genes in Litopenaeus vannamei before and after air exposure

3 討論

一般來(lái)說(shuō)，能量代謝是細(xì)胞和生物體的主要生理過(guò)程。環(huán)境脅迫可影響機(jī)體能量代謝乃至生存。無(wú)水運(yùn)輸時(shí)的干露脅迫是甲殼類動(dòng)物養(yǎng)殖中的典型脅迫，會(huì)導(dǎo)致其脫水及缺氧，甚至死亡[20]。在缺氧環(huán)境下水生動(dòng)物會(huì)由有氧呼吸代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧呼吸代謝，產(chǎn)生能量以維持機(jī)體正常生命活動(dòng)[21]，但無(wú)氧代謝途徑產(chǎn)生能量效率較低，不能提供足夠的能量來(lái)維持有氧消耗。缺氧可導(dǎo)致甲殼類動(dòng)物行為、生理、細(xì)胞和分子層面的變化，具體取決于缺氧的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度[22]。

肝胰腺是對(duì)蝦主要能量代謝器官[23]。HIF-1 由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的異二聚體，在肝胰腺調(diào)節(jié)能量供應(yīng)和消除缺氧引起的有害物質(zhì)方面發(fā)揮重要作用。HIF-1α 感知細(xì)胞中的氧氣[24]，對(duì)于維持正常的細(xì)胞功能以應(yīng)對(duì)缺氧至關(guān)重要[25]。干露脅迫會(huì)誘導(dǎo)日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）肝胰腺HIF-1α基因的表達(dá)[26]；HIF-1α基因的高表達(dá)意味著凡納濱對(duì)蝦耐缺氧的能力較差[27]。在干露脅迫前，各處理組間凡納濱對(duì)蝦肝胰腺HIF-1α基因的表達(dá)無(wú)顯著差異，干露脅迫引起凡納濱對(duì)蝦的缺氧應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)基礎(chǔ)飼料組的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺HIF-1α基因的顯著上調(diào)，而谷胱甘肽酵母水解物處理組的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺HIF-1α基因表達(dá)未發(fā)生顯著變化。干露脅迫誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生增加，引起氧化應(yīng)激[28]，機(jī)體為抵御氧化應(yīng)激需要消耗大量ATP，從而使ATP 含量迅速降低[29]。機(jī)體為維持能量供應(yīng)消耗大量氧氣以加快能量代謝，產(chǎn)生ATP，從而導(dǎo)致肝胰腺中的氧氣含量迅速降低，誘導(dǎo)HIF-1α基因上調(diào)。GSH 為抗氧化劑，其巰基官能團(tuán)可與自由基反應(yīng)，緩解機(jī)體產(chǎn)生ATP 來(lái)抵御氧化應(yīng)激，減少氧氣消耗。GSH 還有維護(hù)電子傳遞、保持有氧呼吸代謝速率的功能[30]。因此，本研究凡納濱對(duì)蝦攝食富含谷胱甘肽的酵母水解物，有效地減少了凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的氧化應(yīng)激，使其仍可維持較強(qiáng)的有氧呼吸代謝，因而未顯著誘導(dǎo)HIF-1α基因的上調(diào)，從而提高凡納濱對(duì)蝦耐缺氧能力。

HIF-1α 還是重要的轉(zhuǎn)錄分子，HIF-1α 可誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦PFK[31]及LDH[32]基因的上調(diào)，HIF-1α 高表達(dá)的細(xì)胞中糖酵解水平明顯增加[33]。無(wú)水?；钸\(yùn)輸時(shí)的干露狀態(tài)也會(huì)使凡納濱對(duì)蝦的糖酵解加快[34]。HK、PFK和PK是糖酵解關(guān)鍵限速酶，均受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[34]。缺氧可誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺PFK基因的表達(dá)[31]，本研究中，干露脅迫可誘導(dǎo)基礎(chǔ)飼料組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺PFK基因的顯著上調(diào)，增強(qiáng)干露脅迫條件下凡納濱對(duì)蝦的糖酵解途徑。然而，谷胱甘肽酵母水解物處理組的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺HK、PFK及PK基因未發(fā)生顯著的上調(diào)，其肝胰腺HIF-1α基因同樣未受到干露的顯著影響，表明谷胱甘肽酵母水解物可較好地維持凡納濱對(duì)蝦的有氧呼吸代謝。

SDH 和MDH 是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞能量代謝中起重要作用[35]。本研究中，各處理組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺SDH和MDH基因表達(dá)在干露脅迫前無(wú)顯著差異；但干露脅迫后，基礎(chǔ)飼料組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺SDH和MDH基因顯著下調(diào)，三羧酸循環(huán)減弱，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%～0.9%谷胱甘肽酵母水解物可減緩凡納濱對(duì)蝦肝胰腺SDH和MDH基因因干露脅迫誘導(dǎo)的下調(diào)。此外，SDH 還是電子傳遞鏈的起始酶[21]，影響氧化磷酸化，反映有氧呼吸代謝的水平。在干露脅迫條件下中華絨螯蟹的肝胰腺SDH 活性下降[36]，阻礙了電子傳遞，影響氧化磷酸化，降低有氧呼吸代謝水平。細(xì)胞色素氧化酶（CCO）是電子傳遞鏈的末端酶，是有氧呼吸的限速酶[37]。干露脅迫誘導(dǎo)基礎(chǔ)飼料組的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺CCO基因的顯著下調(diào)，阻礙了電子傳遞，降低有氧呼吸代謝速率，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%～0.9%谷胱甘肽酵母水解物可減緩因干露脅迫誘導(dǎo)的SDH和CCO基因的下調(diào)，維持電子傳遞，使凡納濱對(duì)蝦保持較強(qiáng)的有氧呼吸代謝，產(chǎn)生能量，抵御干露脅迫。

LDH 是糖酵解途徑的末端酶，還是連接三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在無(wú)氧條件下，LDH 的誘導(dǎo)表達(dá)可催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，并產(chǎn)生少量ATP 為機(jī)體提供能量，是無(wú)氧呼吸代謝的關(guān)鍵酶[38-39]。干露脅迫可誘導(dǎo)基礎(chǔ)飼料組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺LDH基因的表達(dá)顯著上調(diào)，增強(qiáng)機(jī)體的無(wú)氧代謝途徑，表明凡納濱對(duì)蝦依賴糖酵解途徑補(bǔ)償干露脅迫引起的能量供應(yīng)不足。無(wú)氧代謝途徑增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦的肝胰腺和肌肉產(chǎn)生大量的乳酸[39-40]，降低肌肉細(xì)胞的pH 值，低pH 激活A(yù)TP 酶，加速ATP 的分解，直到ATP 完全消失[41]。若ATP 分解速率超過(guò)合成速率，會(huì)導(dǎo)致肌原纖維中肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白無(wú)法分離，形成不可擴(kuò)展的肌動(dòng)球蛋白，導(dǎo)致肌肉僵硬[41]，最終影響肌肉品質(zhì)。GSH 可降低缺氧脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞LDH 活性[42]，添加谷胱甘肽酵母水解物處理組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺LDH基因的表達(dá)在干露脅迫前后無(wú)顯著差異，這說(shuō)明添加谷胱甘肽酵母水解物有助于凡納濱對(duì)蝦維持較強(qiáng)的有氧呼吸代謝，維持基本的生理代謝，更好地抵御干露脅迫。

本研究主要在基因表達(dá)層面關(guān)注谷胱甘肽酵母水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦干露急性應(yīng)激條件下肝胰腺能量代謝的變化，未能進(jìn)一步觀察肝胰腺結(jié)構(gòu)上的變化。此外，由于缺少凡納濱對(duì)蝦血清生化相關(guān)指標(biāo)導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)一步探討代謝基因表達(dá)的變化與生化響應(yīng)的關(guān)聯(lián)，這是本研究的不足之處。

4 結(jié)論

干露脅迫下，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中的HIF-1α、PFK和LDH基因顯著上調(diào)，有氧呼吸代謝相關(guān)基因（SDH、MDH和CCO）顯著下調(diào)，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的有氧呼吸代謝減弱，無(wú)氧呼吸代謝增強(qiáng)。攝食含有適量谷胱甘肽酵母水解物的飼料可使凡納濱對(duì)蝦在干露脅迫的條件下仍維持較強(qiáng)的有氧代謝，為機(jī)體提供能量，抵御干露脅迫。