• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    冷藏凡納濱對蝦肌肉軟化的生化特性及生物標記物

    2024-01-26 08:19:26徐德峰廖威龍李彩虹廖建萌
    廣東海洋大學學報 2024年1期
    關鍵詞:肌原纖維糖酵解對蝦

    徐德峰,廖威龍,李彩虹,廖建萌,李 欣

    (1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東 湛江 524088;2.廣東醫(yī)科大學海洋醫(yī)藥研究院,廣東 湛江 524023;3.湛江市食品藥品研究所,廣東 湛江 524000;4.桂林理工大學化學與生物學院,廣西 桂林 541000)

    作為全球海洋養(yǎng)殖業(yè)重要支柱,凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei,俗稱南美白對蝦)不僅在全球對蝦總產(chǎn)量中占據(jù)主導地位(約占80%),而且其在食品安全和營養(yǎng)供給方面的作用日益凸顯。據(jù)2023年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒數(shù)據(jù),凡納濱對蝦海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達到134.28萬t,淡水養(yǎng)殖達到75.83萬t[1],已成為我國優(yōu)質食物蛋白質的重要來源[2]。雖然凡納濱對蝦市場需求日益增長,但肌肉軟化問題一直是影響其商品價值的主要因素。對蝦肌肉組織柔嫩,在冷藏過程中極易發(fā)生以肌肉軟化為代表的質構品質劣變,4 ℃冷藏條件下貨架期僅為72 h,嚴重影響其感官品質和商品價值[3-5]。針對這一問題,本研究致力于探明冷藏對蝦肌肉軟化背后的生化機制及其生物標記物,深化品質劣變的理論認知,為鮮活對蝦質量保真提供理論指導。

    肌肉軟化是一系列復雜生化事件的結果,肌纖維是維持肌肉硬度等質構品質的主要物質基礎,而內源酶誘導的肌纖維降解是肉品質構劣化的關鍵生物學過程。研究發(fā)現(xiàn),畜禽動物死后初期,細胞有氧呼吸停止而無氧呼吸增強,糖原消耗使乳酸累積,細胞內質子梯度增大,形成的跨膜質子梯度可間接激活Na+或Ca2+交換蛋白,促進胞外Ca2+內流,并誘導肌漿內質網(wǎng)Ca2+瞬間大量釋放;與此同時,ATP水平、Ca2+-ATP酶、輕鏈蛋白激酶、磷酸酶、蛋白激酶活性也發(fā)生相應變化,上述生化因子相互作用直接影響到肌肉軟化進程。但比較后發(fā)現(xiàn),豬、牛、雞等動物在貯藏期間的pH 值、Ca2+濃度、ATP 水平、代謝酶活性等生化因子的變化規(guī)律并不一致,這可能是因為不同動物肌肉品質劣化進程取決于無氧代謝啟動后生物標記物的演替速度,相互間具有物種特異性[6-8]。Xu 等[9]發(fā)現(xiàn)對蝦在冷藏期間揮發(fā)性鹽基氮TVB-N 含量快速增加,肌纖維間隙增大,肌肉內膜破裂,肌肉快速軟化;Peng 等[10]強調內源性酶在對蝦死后加速肌肉軟化過程中的潛在作用。Bouskila等[11]發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸異構酶(G6PI)參與糖酵解或糖異生途徑,可催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的相互轉化產(chǎn)生能量使肌肉收縮。以上研究均指明肌肉軟化與生化代謝之間的密切關聯(lián)。然而,目前關于對蝦冷藏期間肌肉軟化與生化代謝因子間相關性的研究尚未見報道。

    本研究通過監(jiān)測凡納濱對蝦冷藏期間肌肉生化因子水平和磷酸化調控酶活性,分析其與質構指標的相關性,探明肌肉軟化相關的生化關系,進而識別生物標記物,以期為對蝦冷藏期間質構劣化的早期預警與靶向監(jiān)控提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要藥品試劑

    蒽酮(分析純AR),上?;瘜W試劑公司;苯甲磺酰氟(PMSF,AR),碧云天生物技術有限公司;ATP含量測定試劑盒、超微量Ca2+-ATP 酶試劑盒、酸性及堿性磷酸酶(ACP、AKP)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司;BCA 蛋白濃度測定試劑盒,飛凈生物科技有限公司。

    1.2 主要儀器設備

    PHS-3E型雷磁pH儀,上海儀電科學儀器股份有限公司;TMS-PRO質構儀,美國FTC公司;Varioskan全自動酶標儀,塞默飛世爾科技中國有限公司。

    1.3 原料

    鮮活凡納濱對蝦,體質量(12.26±1.52)g,體長(8.25 ± 1.43)cm,購于廣東省湛江市麻章區(qū)東南水產(chǎn)品市場,充氧后2 h 內?;钸\輸至廣東海洋大學食品科技學院水產(chǎn)品?;盍魍▽嶒炇疫M行預處理。選取無表面損傷且存活狀況良好的個體,自來水清洗后加冰塊使其猝死,用自來水洗凈體表,每6尾作為一組,裝入聚乙烯塑料保鮮袋,4 ℃冷藏120 h,每12 h取出一組測定相關指標。

    1.4 方法

    1.4.1 質構分析(TPA)參照王偉等[12]法測定質構指標。將對蝦去頭、剝殼,放到測試臺中間,選取第二腹節(jié)進行質地多面分析。選用直徑為50 mm 的P50 平底柱形探頭,測前速度2.00 mm/s,測試速度1.00 mm/s,測后速度1.00 mm/s,壓縮程度50%。測定硬度、彈性、內聚力、咀嚼性、剪切力等參數(shù)。

    1.4.2 肌原纖維蛋白提取 參照Lametsch 等[13]法稍修改。選取多尾蝦的第二腹節(jié),切碎,稱100 mg 碎肉于組織勻漿管中,加入緩沖液(1 mL裂解緩沖液,10 μL PMSF,10 μL蛋白酶抑制劑和10 μL磷酸酶抑制劑)混合,在4 ℃、3 000 r/min 條件下勻漿2 min,冰上裂解30 min,在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心5 min,收集上清液保存于-80 ℃的冰箱中待用。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

    1.4.3 肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)測定 參照Wu等[14]法,將蛋白溶液質量濃度調至(0.5 ± 0.05)mg/mL,記錄波長540 nm 處的光密度,其平均值乘以200 即為MFI。

    1.4.4 無氧條件下各生化因子指標測定 pH值測定參照Salih 等[15]法進行。糖原含量、乳酸含量、ATP含量、酸性與堿性磷酸酶(ACP、AKP)活性、Ca2+-ATP酶活性測定使用南京建城生物工程研究所生產(chǎn)的相關試劑盒,按照說明書依次測定。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    各指標平行測定3 次,數(shù)據(jù)用平均值± 標準偏差表示,采用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,多重比較采用單因素方差分析,使用Origin 8.5 和GraphPad Prism 8.0作圖。

    2 結果與分析

    2.1 冷藏期間對蝦肌肉質構與纖維斷裂情況變化

    質構特性能夠反映凡納濱對蝦的新鮮程度[16]。由圖1(A)可知,隨著冷藏時間的增加,對蝦肌肉硬度呈下降趨勢,在冷藏72 h 后硬度迅速降至(2947±113)g。由圖1(B)可知,彈性與硬度呈相同變化趨勢,從初始的1.42±0.05降至120 h的0.66±0.01;由圖1(C)可知,對蝦內聚力在冷藏期間持續(xù)下降,由初始的0.62±0.02,降至120 h時的0.32±0.01,而咀嚼性從最初的(2524±127)g降至120 h的(504±51)g(圖1(D))。說明冷藏時間延長顯著影響凡納濱對蝦肌肉的硬度、彈性、內聚力和咀嚼性,直接指示其新鮮度下降。研究發(fā)現(xiàn),在冷藏條件下,羊肉和鱸(Lateolabrax japonicus)魚肉的硬度隨冷藏時間增加而上升,而對蝦的肌肉質構指標則呈下降趨勢[17,18]。這表明不同物種在冷藏后肌肉質構指標的變化具有顯著差異。對蝦死后,特定蛋白酶從肝胰腺遷移到肌肉,加速肌原纖維蛋白的降解,導致肌肉快速軟化,通過蛋白質組學分析揭示了蛋白酶促進死后肌肉代謝的作用,這可能是對蝦短暫尸僵期和快速軟化的原因[10]。MFI是反映對蝦肌肉完整性的一個重要指標[19]。由圖1(E)可知,對蝦肌肉MFI隨著冷藏時間的增加而增大。對蝦初始MFI 為21.63 ± 0.29,36 h 時升至62.13 ± 3.40,表明24 h 后肌肉纖維快速降解。進一步分析發(fā)現(xiàn),MFI 與對蝦質構相關指標均顯著負相關(P<0.01)(圖1(F-I)),說明肌原纖維碎片化與質構品質劣變存在一定的因果關系。MFI 增加表明肌原纖維完整性受到破壞,可能源于細胞內結構降解酶活性增加而引起結構蛋白斷裂,使蛋白質網(wǎng)狀結構強度降低,肌原纖維中的粗絲加速降解,表現(xiàn)出肌肉組織軟化[20]。李曉等[21]研究發(fā)現(xiàn),0 ℃貯藏凡納濱對蝦,質構指標均與貯藏時間呈負相關;Sun 等[22]發(fā)現(xiàn)在微凍條件下,對蝦在10 d時MFI呈顯著上升,與本研究趨勢一致,而與本研究MFI 顯著上升出現(xiàn)時間上的差異,可能是因為微凍低溫貯藏抑制了對蝦體內生物化學反應,延緩了對蝦品質劣化。

    圖1 冷藏對蝦主要質構指標和MFI的動態(tài)變化及其相關性Fig.1 Dynamic variation on primary textural indexes and MFI of refrigerated prawn,and the correlation between MFI and each index

    2.2 冷藏對蝦肌肉組織生化代謝變化

    在對蝦死后,機體會啟動細胞凋亡過程,伴隨內源酶的激活可引起各種生化代謝發(fā)生規(guī)律變化[23]。由圖2 可知,對蝦冷藏24 h 內pH 值下降,之后明顯增加(圖2(A));肌肉糖原質量分數(shù)在初期24 h內快速下降,由最初的(0.35±0.02)降至(0.28±0.02)g/100g,而后緩慢下降(圖2(B))。在氧氣供應不足的環(huán)境下,細胞會啟動無氧糖酵解代謝途徑,將糖原分解為乳酸,并在此過程中不斷積累,導致細胞環(huán)境酸化,這與pH 值的變化相符,提示細胞內酸堿平衡受到無氧糖酵解的影響[24]。由圖2(C)可知,丙酮酸質量摩爾濃度先快速上升至峰值,由(1.30±0.15)mmol/100g升至36 h的(2.85±0.08)mmol/100g,之后持續(xù)下降,提示細胞代謝類型發(fā)生變化。Chen等[25]指出糖原和乳酸作為糖酵解反應的底物和產(chǎn)物,其含量變化直接反映糖酵解水平和速率。在前24 h 內,糖原被快速分解產(chǎn)生丙酮酸后,在細胞缺氧的環(huán)境下乳酸質量摩爾濃度快速增加(圖2(D)),由(0.06 ± 0.01)mmol/g 升 至24 h 時 的(0.23 ±0.01)mmol/g,之后快速下降,直至120 h 時的(0.09±0.01)mmol/g,表明冷藏前24 h大多數(shù)丙酮酸轉變成乳酸。王源源等[26]研究干露對克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)成蝦存活、相關代謝酶及組織結構的影響,發(fā)現(xiàn)其代謝酶活性變化趨勢與本研究類似,說明冷藏初期細胞代謝模式轉變?yōu)闊o氧呼吸。

    圖2 冷藏對蝦糖酵解過程各指標變化Fig.2 Changes of each index related to glycolysis process

    鑒于物質代謝與能量代謝的密切相關性,進一步考察冷藏過程中對蝦肌肉中ATP 的含量變化。由圖2(E)可以看出,新鮮對蝦肌肉中ATP 質量摩爾濃度為(339.88±8.44)μmol/g,48 h 降至(53.55±1.39)μmol/g,僅為初始值的15%,72 h 時ATP 消耗完畢。通常,乳酸堆積造成pH 值下降,使肌漿網(wǎng)的Ca2+滯留能力下降,Ca2+大量釋放至細胞外,促使肌原纖維間Ca2+濃度增加,進而激活ATP 酶使ATP 迅速降解[27]。磷酸果糖激酶(PFK)是肌肉糖酵解最重要的限速酶。在糖酵解反應中,PFK 催化的反應為不可逆反應,PFK 對糖酵解的驅動有著至關重要作用[28]。由圖2(F)可知,在冷藏至24 h 時,PFK 活性顯著下降至(20.82±0.32)U/mg,之后逐步降至(11.13±0.10)U/mg。林珩迅等[29]發(fā)現(xiàn),ATP含量降低可能導致糖酵解途徑中所需的能量供應不足,限制PFK 的催化活性。此外,ATP 的降低也可能引起代謝途徑中其他關鍵酶的活性下降,如磷酸己糖激酶(PGK)和磷酸甘油醛-3-脫氫酶(GAPDH),進一步影響肌肉組織中的代謝類型[30]。

    2.3 對蝦冷藏過程中磷酸酶和Ca2+-ATP 酶活性變化

    ACP、AKP 參與磷酸基團的代謝,與蛋白質代謝有關[31]。由圖3 可知,ACP 和AKP 活性從0 h 至60 h 基本不變,72 h 后開始上升,其中ACP 活性在120 h 升至(26.57±1.53)U/g,AKP 活性升至(1.46±0.10)U/g。此外,肌原纖維蛋白是水產(chǎn)品中最重要的結構和功能蛋白,其中肌球蛋白占肌原纖維蛋白的55%~60%[32],而肌球蛋白穩(wěn)定性與Ca2+-ATP 酶活性有關,Ca2+-ATP 酶活性越高,肌肉蛋白質越穩(wěn)定[33]。如圖3(B)所示,冷藏期間對蝦肌肉Ca2+-ATP酶活性不斷下降,由初始(0.54±0.01)降至120 h 時(0.15±0.01)U/mg,下降近乎4 倍,間接反映肌原纖維的解離降解。通常,ATP 快速下降使Ca2+-ATP 酶可利用的能量不足,影響鈣泵功能,誘導肌漿內質網(wǎng)Ca2+大量釋放,從而激活酸性或堿性磷酸酶的活性,促進蛋白質分解[34]。

    圖3 磷酸酶和Ca2+-ATP酶活性變化Fig.3 Changes in phosphatase and Ca2+-ATPase activity

    2.4 冷藏對蝦肌肉軟化與各生化指標間的相關性

    各指標間相關性見圖4。對蝦冷藏期間,質構指標與MFI 指數(shù)間顯著負相關(P<0.05),與Ca2+-ATP 酶活性顯著正相關(P<0.05),其生化規(guī)律可能是對蝦死后肌肉代謝減緩,Ca2+-ATP酶活性下降,細胞內Ca2+濃度升高,打破細胞內的鈣離子平衡,激活鈣蛋白酶參與肌原纖維降解,隨后肌原纖維碎片化增加和質構特性劣變,尤其是硬度和彈性指標快速下降。在各指標中Ca2+-ATP 酶活性與硬度相關性最強(R2=0.98),可能是因為Ca2+-ATP 酶在細胞內鈣離子調控和能量代謝中的關鍵作用,Ca2+-ATP 酶是一種負責細胞內鈣離子平衡的酶,其活性直接影響細胞內的Ca2+濃度[35]。當Ca2+-ATP 酶驅動Ca2+從細胞質或其他細胞區(qū)域轉運到內質網(wǎng),導致細胞質中的游離Ca2+減少,內質網(wǎng)Ca2+濃度相對升高,觸發(fā)肌肉細胞中的肌鈣蛋白與肌動蛋白的結合,引發(fā)肌肉的收縮反應[36]。同時可以看出,質構指標與磷酸酶活性表現(xiàn)出負相關關系,其原因可能是冷藏后期微生物繁殖使細胞結構破裂,細胞內核酸、磷脂和堿性磷酸鹽等細胞成分不斷釋放和聚集,間接誘導ACP或AKP激活,從而加速蛋白質降解。這一過程會破壞對蝦肌肉的結構,導致肌肉組織松散,失去原有的緊密結構。Ca2+-ATP酶活性與磷酸酶活性呈顯著負相關(P<0.05),Ca2+-ATP 酶活性下降通常與細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關,其活性下降被視為一種細胞應激反應,應激響應通常涉及MAP激酶(MAPK)通路,從而通過磷酸化下游目標蛋白來改變其活性或定位[37-40]。

    圖4 凡納濱對蝦冷藏過程中各指標相關性分析Fig.4 Correlation analysis of various indexes during cold storage of Litopenaeus vannamei

    鑒于物質代謝與能量代謝的密切相關性,進一步分析糖代謝相關生化因子與肌原纖維降解的相關性有助于探明肌肉軟化的生物標記物。由圖4可見,MFI 指數(shù)與pH、糖原含量顯著負相關性(P<0.05),這是因為在對蝦冷藏過程中,肌肉內源酶的活性變化會影響肌原纖維降解,能量代謝速率減緩從而導致酸堿平衡失調。從生化代謝角度分析,ATP 是細胞內能量的主要供應者,其通過釋放高能磷酸鍵來提供能量給各種生化反應。糖原作為能量儲存分子被降解成丙酮酸、乳酸和ATP,酸性物質堆積使pH 值下降,反過來影響PFK 的催化活性,導致糖酵解速率降低。另外,PFK 是一種依賴于ATP的酶,當ATP 水平較低時,PFK 催化反應所需的高能磷酸鍵就會減少,PFK 的催化速率會受阻,進一步降低糖酵解速率,與經(jīng)典Michaelis-Menten 動力學理論相一致,說明PFK 驅動的糖酵解可能是觸發(fā)和加速肌肉快速軟化的關鍵前期生化事件。能量代謝是維持細胞生存和功能的基礎,其與對蝦肌肉的質構特性密切相關[41]。ATP含量與質構指標之間顯著正相關性(P<0.05),ATP 在肌肉收縮機制中起著關鍵作用,新鮮對蝦中ATP 含量較高,可以維持收縮狀態(tài),從而使肌肉保持一定的結構穩(wěn)定性和彈性。隨著冷藏時間的推移,ATP 生成減少而消耗增多,造成Ca2+-ATP酶轉移Ca2+的能力下降,從而使細胞內鈣離子濃度升高,最終激活鈣蛋白酶并降解肌原纖維,增加肌原纖維碎片化的程度。綜上所述,Ca2+-ATP 酶在各指標間相關性最強,可作為冷藏對蝦以肌肉軟化為代表的質構劣化的生物標記物。

    2.5 Ca2+-ATP酶驅動肌肉軟化的可能機制

    基于細胞內生化代謝路徑及其生物學效應,分析Ca2+-ATP 酶驅動肌肉軟化的可能機制,提出如下科學假說(圖5)。

    圖5 Ca2+-ATP酶驅動冷藏對戲肌肉軟化的可能機制Fig.5 Potential mechanisms of muscle softening driven by Ca2+-ATPase in shrimp during cold storage

    在4 ℃冷藏初期,由于對蝦死亡而呼吸終止,細胞失去氧氣供應,無氧呼吸取代有氧呼吸,對蝦肌肉中的糖原通過糖酵解和無氧呼吸生成丙酮酸和少量ATP,隨后丙酮酸被氧化為乙酰輔酶A,轉運到線粒體進行三羧酸循環(huán)(TCA 循環(huán)),最終轉化為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2),通過電子傳遞鏈進行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,而Ca2+-ATP 酶在細胞內維持Ca2+濃度平衡起著關鍵作用,其通過消耗ATP主動轉運Ca2+,將細胞內的Ca2+從低濃度區(qū)域(通常是細胞質或細胞膜內側)轉運到高濃度區(qū)域(如內質網(wǎng)、細胞外區(qū)域)。隨著能量代謝減緩,ATP 生成速率降低,導致Ca2+-ATP 酶的鈣泵功能受阻,影響Ca2+的正常轉運,使內質網(wǎng)釋放的Ca2+在肌肉細胞內大量積累,導致細胞內Ca2+異常升高,進而激活鈣蛋白酶并降解肌原纖維蛋白和細胞骨架蛋白,引起肌肉軟化。

    3 結論

    本研究發(fā)現(xiàn),對蝦冷藏初期肌肉質構品質指標快速下降,且與肌原纖維碎片化密切相關。伴隨著糖原含量快速下降,丙酮酸和乳酸累積,且ATP含量急劇降低,PFK 活性受抑制,導致糖酵解速率減緩。冷藏24 h 之后,ACP 和AKP 活性快速增加,促使肌原纖維蛋白去磷酸化,影響肌原纖維的結構穩(wěn)定性,從而觸發(fā)和加速肌肉快速軟化。冷藏初期,對蝦質構快速劣化受關鍵內源酶的協(xié)同激活,PFK 驅動的糖酵解可能是觸發(fā)和加速肌肉快速軟化的關鍵前期生化事件,其中Ca2+-ATP酶是生物標記物。

    猜你喜歡
    肌原纖維糖酵解對蝦
    非編碼RNA在胃癌糖酵解中作用的研究進展
    對蝦養(yǎng)殖弱勢群體的管理
    對蝦吃料慢的原因分析和處理
    對蝦免疫增強劑研究進展
    對蝦常見環(huán)境性疾病的防治
    糖酵解與動脈粥樣硬化進展
    放射對口腔鱗癌細胞DNA損傷和糖酵解的影響
    18F-FDG PET/CT中病灶糖酵解總量判斷局部晚期胰腺癌放射治療的預后價值
    肌原纖維蛋白與大豆分離蛋白復合體系乳化性的研究
    TG酶協(xié)同超高壓處理對雞胸肉中肌原纖維蛋白凝膠品質的影響
    啪啪无遮挡十八禁网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品国产高清国产av | 热99re8久久精品国产| 久久久久精品人妻al黑| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 又紧又爽又黄一区二区| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品 国内视频| 欧美在线黄色| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| 不卡一级毛片| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品久久电影中文字幕 | 亚洲av成人一区二区三| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 美女视频免费永久观看网站| 91老司机精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品 国内视频| 99热只有精品国产| 在线视频色国产色| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美国产精品va在线观看不卡| 黄色丝袜av网址大全| x7x7x7水蜜桃| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本a在线网址| 国产精品一区二区在线观看99| 精品久久久久久,| 在线观看舔阴道视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲伊人色综图| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美中文综合在线视频| 亚洲五月天丁香| 捣出白浆h1v1| 亚洲第一av免费看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 最新的欧美精品一区二区| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产色视频综合| 90打野战视频偷拍视频| 成年动漫av网址| 黑人操中国人逼视频| 777米奇影视久久| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩三级视频一区二区三区| av中文乱码字幕在线| 在线观看免费视频日本深夜| 久久精品国产综合久久久| 国产精品一区二区在线不卡| 女人精品久久久久毛片| a在线观看视频网站| 黄频高清免费视频| 在线天堂中文资源库| 国产av一区二区精品久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费不卡黄色视频| 男女床上黄色一级片免费看| 一级a爱片免费观看的视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 女性被躁到高潮视频| 国精品久久久久久国模美| www.精华液| 久久这里只有精品19| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 大香蕉久久网| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品久久久av美女十八| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频 | 99re在线观看精品视频| 一级黄色大片毛片| 亚洲国产欧美网| 久久影院123| 精品久久久久久电影网| 午夜精品在线福利| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线免费观看的www视频| 国产真人三级小视频在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久精品区二区三区| 香蕉久久夜色| 一级毛片精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 中出人妻视频一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜福利免费观看在线| 精品乱码久久久久久99久播| 三上悠亚av全集在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 免费在线观看日本一区| 日韩欧美在线二视频 | 亚洲国产欧美网| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 91国产中文字幕| 精品久久久久久久毛片微露脸| 三上悠亚av全集在线观看| 人人妻人人澡人人看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 最近最新免费中文字幕在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一进一出抽搐动态| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一级黄色大片毛片| 男男h啪啪无遮挡| 夫妻午夜视频| 在线av久久热| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 黄频高清免费视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产在线一区二区三区精| 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 怎么达到女性高潮| 亚洲成国产人片在线观看| 99riav亚洲国产免费| 国产伦人伦偷精品视频| 91精品三级在线观看| 亚洲av美国av| 在线永久观看黄色视频| 99re在线观看精品视频| 在线视频色国产色| 久久久久久久国产电影| 水蜜桃什么品种好| 亚洲国产精品合色在线| 在线观看舔阴道视频| 黄片播放在线免费| 男女高潮啪啪啪动态图| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美日韩一级在线毛片| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 免费观看a级毛片全部| 久久精品成人免费网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 99国产综合亚洲精品| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲熟妇熟女久久| 国产免费现黄频在线看| 国产成人精品在线电影| 成人免费观看视频高清| 男女免费视频国产| cao死你这个sao货| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲九九香蕉| 久久精品国产亚洲av高清一级| av网站免费在线观看视频| 丝袜人妻中文字幕| 后天国语完整版免费观看| 国产av又大| 国产国语露脸激情在线看| 视频区图区小说| e午夜精品久久久久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 成人国语在线视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 中文字幕最新亚洲高清| xxx96com| 黑人操中国人逼视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| av电影中文网址| 激情在线观看视频在线高清 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 1024视频免费在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 欧美日韩一级在线毛片| 无人区码免费观看不卡| aaaaa片日本免费| 国产单亲对白刺激| 黄色丝袜av网址大全| 真人做人爱边吃奶动态| 一级毛片女人18水好多| netflix在线观看网站| 成年版毛片免费区| 国产精品1区2区在线观看. | 在线观看免费视频网站a站| 精品国产一区二区三区四区第35| 1024香蕉在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 久久久国产欧美日韩av| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品1区2区在线观看. | 999久久久国产精品视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久亚洲精品不卡| 另类亚洲欧美激情| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 国产亚洲欧美在线一区二区| 丝袜人妻中文字幕| 精品久久久久久电影网| 视频区图区小说| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产男女内射视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲专区字幕在线| 中文亚洲av片在线观看爽 | 1024视频免费在线观看| 成年人黄色毛片网站| 一区在线观看完整版| 一进一出抽搐动态| 免费不卡黄色视频| 正在播放国产对白刺激| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 下体分泌物呈黄色| 国产亚洲一区二区精品| ponron亚洲| 无遮挡黄片免费观看| 国产一区二区激情短视频| 亚洲黑人精品在线| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 欧美精品av麻豆av| netflix在线观看网站| 欧美成人午夜精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 99re6热这里在线精品视频| а√天堂www在线а√下载 | 岛国在线观看网站| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲少妇的诱惑av| 两个人免费观看高清视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精华一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文字幕高清在线视频| 美国免费a级毛片| 麻豆成人av在线观看| 国产一区二区三区视频了| 午夜福利一区二区在线看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲午夜理论影院| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 电影成人av| 热99re8久久精品国产| 欧美中文综合在线视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 久热爱精品视频在线9| 男人舔女人的私密视频| 免费黄频网站在线观看国产| 99热只有精品国产| 一个人免费在线观看的高清视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 高清av免费在线| 91精品国产国语对白视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| av线在线观看网站| 亚洲,欧美精品.| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产成人av教育| 美女扒开内裤让男人捅视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日本黄色视频三级网站网址 | 久久这里只有精品19| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲国产欧美网| 亚洲欧美激情在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久精品人人爽人人爽视色| 一区二区三区精品91| 亚洲avbb在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 极品教师在线免费播放| 又大又爽又粗| 精品欧美一区二区三区在线| 99国产精品99久久久久| 老汉色∧v一级毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 老鸭窝网址在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 嫩草影视91久久| 国产精品国产av在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 成年人午夜在线观看视频| 日韩欧美国产一区二区入口| videosex国产| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美国产精品一级二级三级| 香蕉久久夜色| 国产成人欧美| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 免费在线观看完整版高清| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美乱妇无乱码| 国产男女内射视频| 一本综合久久免费| 日韩免费av在线播放| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 51午夜福利影视在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美最黄视频在线播放免费 | 在线播放国产精品三级| 无限看片的www在线观看| 亚洲伊人色综图| 岛国毛片在线播放| 久久久国产成人免费| 国产精品一区二区在线不卡| av不卡在线播放| av中文乱码字幕在线| 一二三四社区在线视频社区8| 18在线观看网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产亚洲精品一区二区www | 欧美精品一区二区免费开放| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日韩黄片免| 国产不卡av网站在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品久久久久久久久久免费视频 | 搡老乐熟女国产| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲av美国av| 黄色片一级片一级黄色片| 精品高清国产在线一区| 午夜免费成人在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 两人在一起打扑克的视频| av电影中文网址| 五月开心婷婷网| 99香蕉大伊视频| 亚洲av片天天在线观看| 18禁观看日本| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲,欧美精品.| 国产精品偷伦视频观看了| 丰满迷人的少妇在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 99在线人妻在线中文字幕 | 欧美成人午夜精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 成年人黄色毛片网站| 99国产精品99久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 51午夜福利影视在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品一品国产午夜福利视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 91大片在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| bbb黄色大片| 757午夜福利合集在线观看| 久久久精品免费免费高清| 中文欧美无线码| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲片人在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 国产成人av激情在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 午夜久久久在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| x7x7x7水蜜桃| 亚洲色图av天堂| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜老司机福利片| 国产在视频线精品| 国产精品国产av在线观看| 久久九九热精品免费| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 999久久久国产精品视频| 一夜夜www| 在线播放国产精品三级| 国产一区二区三区视频了| 久久香蕉国产精品| 免费在线观看亚洲国产| www日本在线高清视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品国产一区二区久久| 757午夜福利合集在线观看| 另类亚洲欧美激情| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 午夜91福利影院| 亚洲片人在线观看| 午夜精品在线福利| 久久精品国产综合久久久| 精品久久久久久,| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精华一区二区三区| 无人区码免费观看不卡| 国产亚洲欧美98| 精品无人区乱码1区二区| tocl精华| 日韩欧美在线二视频 | 一个人免费在线观看的高清视频| 99久久综合精品五月天人人| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久久国产精品麻豆| 免费在线观看黄色视频的| 欧美乱色亚洲激情| av视频免费观看在线观看| 成年人黄色毛片网站| 美女福利国产在线| 国产xxxxx性猛交| 男人的好看免费观看在线视频 | 一二三四社区在线视频社区8| 久99久视频精品免费| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲精品一二三| 午夜老司机福利片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 两个人免费观看高清视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 看黄色毛片网站| 国产高清激情床上av| 成人黄色视频免费在线看| 国产亚洲精品一区二区www | 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲午夜理论影院| 在线永久观看黄色视频| 一级作爱视频免费观看| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲九九香蕉| 淫妇啪啪啪对白视频| tube8黄色片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美精品高潮呻吟av久久| 中文欧美无线码| 女性被躁到高潮视频| www.999成人在线观看| 国产精品免费大片| 少妇粗大呻吟视频| 大型av网站在线播放| 国产1区2区3区精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 99热网站在线观看| 9热在线视频观看99| 国产三级黄色录像| 亚洲综合色网址| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 欧美黑人精品巨大| 两人在一起打扑克的视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 91av网站免费观看| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲片人在线观看| 99久久国产精品久久久| 久热爱精品视频在线9| 老司机影院毛片| 精品第一国产精品| 一a级毛片在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 天堂俺去俺来也www色官网| 黄频高清免费视频| 99精品在免费线老司机午夜| 国产主播在线观看一区二区| 久9热在线精品视频| 国产乱人伦免费视频| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲片人在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲精品在线美女| 国产成人精品久久二区二区91| 丁香六月欧美| 欧美激情 高清一区二区三区| 老司机福利观看| 国产野战对白在线观看| 麻豆国产av国片精品| 欧美成人午夜精品| 在线看a的网站| 一级毛片精品| 国产高清激情床上av| 操美女的视频在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产激情欧美一区二区| 国产精品国产av在线观看| 中出人妻视频一区二区| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲人成电影观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产欧美亚洲国产| 久久午夜综合久久蜜桃| 男女午夜视频在线观看| 一区在线观看完整版| 久久国产精品影院| 在线看a的网站| 国产在视频线精品| 老司机影院毛片| 亚洲精品av麻豆狂野| 在线免费观看的www视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 曰老女人黄片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久国产亚洲av麻豆专区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产精品免费大片| 色在线成人网| 视频区图区小说| 丝袜在线中文字幕| 黄片大片在线免费观看| 国产精品1区2区在线观看. | 成年人黄色毛片网站| 一二三四在线观看免费中文在| 久久99一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 女人被狂操c到高潮| 麻豆乱淫一区二区| 黄频高清免费视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产精品永久免费网站| 国产在线观看jvid| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜福利免费观看在线| 看免费av毛片| 亚洲视频免费观看视频| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美黑人精品巨大| 国产精品久久电影中文字幕 | 香蕉丝袜av| 在线观看舔阴道视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品国产av在线观看| 多毛熟女@视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 天堂中文最新版在线下载| 怎么达到女性高潮| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 1024香蕉在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 久热这里只有精品99| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品亚洲成国产av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 动漫黄色视频在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 日韩中文字幕欧美一区二区| 视频在线观看一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲成人国产一区在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久精品国产清高在天天线| 午夜久久久在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美久久黑人一区二区| www.999成人在线观看| 窝窝影院91人妻| 久久久国产精品麻豆| 一级毛片精品| 国产精品一区二区在线观看99| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲九九香蕉| 成年人午夜在线观看视频| 交换朋友夫妻互换小说| 一级黄色大片毛片| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美日韩黄片免| bbb黄色大片| 精品亚洲成国产av| 99久久综合精品五月天人人| 久热这里只有精品99| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品免费一区二区三区在线 | 亚洲中文字幕日韩| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久国产成人免费| 91字幕亚洲| 欧美黄色淫秽网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人国语在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 视频区图区小说| 99国产极品粉嫩在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲五月色婷婷综合| 国产av又大| 日本五十路高清| 国产精品久久电影中文字幕 |