柚皮素對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護機制及作用靶點研究進展

胡中強 楊悅 李明闊 李琛

缺血性腦卒中是卒中最常見的類型,起病急進展快,因其高發(fā)病率、高致死致殘率,往往預(yù)后不良且給家庭造成較重的經(jīng)濟負擔(dān)[1],早期診斷積極的治療對于改善缺血性腦卒中病人后期的神經(jīng)功能具有十分重要的意義。目前,缺血性腦卒中的超早期治療主要是通過靜脈溶栓以盡早恢復(fù)缺血腦組織血供,改善神經(jīng)細胞缺血缺氧狀態(tài),減輕神經(jīng)細胞損傷進而改善神經(jīng)功能。然而,在缺血區(qū)腦組織血供恢復(fù)的同時,往往會出現(xiàn)神經(jīng)功能一過性恢復(fù)后損傷不減反增、病情惡化的現(xiàn)象,即腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,I/R損傷)[2]。近年來,腦缺血再灌注損傷的相關(guān)機制吸引越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,成為目前研究的熱點話題之一。最新研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機制主要與神經(jīng)細胞炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、氮化應(yīng)激、酸中毒、線粒體功能障礙、Ca2+超載、細胞凋亡、能量代謝障礙、血腦屏障破壞、興奮性氨基酸過度釋放等因素密切相關(guān)[3,4],而各種機制之間相互作用、相互疊加,產(chǎn)生瀑布樣級聯(lián)反應(yīng),進一步放大再灌注神經(jīng)細胞損傷加重神經(jīng)功能缺失。近年研究表明,積極的缺血后處理對于減輕缺血再灌注損傷顯得十分重要[5]。因此,如何減輕或避免缺血性腦卒中再灌注損傷,減輕神經(jīng)細胞損傷,改善神經(jīng)功能損傷,改善患者預(yù)后,提高生活質(zhì)量顯得極為重要。柚皮素(Naringenin,4,5,7-三羥基黃酮,NAR)是一種天然存在的二氫黃酮類化合物,一般以柚皮苷的形式存在于如葡萄柚、橘子、檸檬等蕓香科植物中,是傳統(tǒng)中藥枳實、枳殼中的重要有效成分,自然界中來源廣泛,而且可以通過血腦屏障,在神經(jīng)系統(tǒng)臨床用藥中具有一定的先天優(yōu)勢[6-8]。常溫下,柚皮素的水溶性和脂溶性很低,導(dǎo)致其口服生物利用率較低[9],在體內(nèi)較難產(chǎn)生可靠的藥效。樊慧蓉等[10]通過大鼠實驗發(fā)現(xiàn),柚皮素體內(nèi)代謝包括Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝,代謝產(chǎn)物主要以Ⅱ相代謝產(chǎn)生的的葡萄糖醛酸結(jié)合物為主,并通過肝腎代謝后排出體外。目前,有學(xué)者通過采取制備柚皮素-PLGA納米粒[11]、脂質(zhì)體[12]、磷脂復(fù)合物[13]等的方式來提高柚皮素的生物利用率并取得了一定的成功,使得柚皮素的臨床應(yīng)用前景更加開闊。近年研究表明,柚皮素對于腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)保護具有顯著的作用,而這是通過不同的通路或作用機制來實現(xiàn)的,本文就柚皮素對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護機制及作用靶點相關(guān)研究進展進行歸納總結(jié),以期為柚皮素治療腦缺血再灌注損傷機制進一步探討與開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 抗炎作用

腦梗死早期,神經(jīng)細胞因缺氧缺血開始出現(xiàn)不可逆性損傷,在缺血中央?yún)^(qū)域形成缺血壞死區(qū),神經(jīng)細胞因缺氧缺血短時間內(nèi)大量死亡,周圍形成缺血半暗帶(ischemic penumbra,IP),如能及時改善缺氧缺血狀態(tài),可避免形成壞死,是腦梗死現(xiàn)代治療的理論基礎(chǔ);但壞死組織可激活體內(nèi)免疫應(yīng)答,激活小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化形成巨噬細胞,進而清除缺血壞死區(qū)腦組織,并同時誘導(dǎo)炎性介質(zhì)產(chǎn)生,進一步加重周圍腦組織炎性反應(yīng)[14,15]。如何抑制炎性介質(zhì)產(chǎn)生、抑制小膠質(zhì)細胞激活是減輕炎性反應(yīng)的關(guān)鍵。目前,積極有效的抗炎治療是預(yù)防腦缺血再灌注損傷最有效的方法[16]。核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路廣泛存在于機體內(nèi)各種細胞,參與機體的炎癥反應(yīng)、應(yīng)激和免疫應(yīng)答,并在免疫應(yīng)答的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。研究表明,NF-κB信號通路與腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)關(guān)系密切,調(diào)節(jié)因子蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)可通過活化NF-κB介導(dǎo)的信號通路,促進白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎癥因子的表達[17,18],而柚皮素可通過抑制蛋白激酶C的磷酸化抑制NF-κB介導(dǎo)的信號通路減少炎癥因子的釋放進而發(fā)揮抗炎作用[19]。Bai等[20]通過大鼠實驗發(fā)現(xiàn),柚皮素對缺血腦組織神經(jīng)保護功能是通過下調(diào)核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體2(nucleotide oligomerization domain-like receptors 2,NOD2)、受體相互作用蛋白2 (receptor interacting protein 2, RIP2)、 NF-κB、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達并上調(diào)血腦屏障緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5蛋白的表達實現(xiàn)的。Olugbemide等[21]進一步研究后認(rèn)為,柚皮素通過調(diào)控NF-κB和腦神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)的表達來調(diào)節(jié)氧化炎癥損傷,進而改善缺氧應(yīng)激小鼠的精神行為。Raza等[22]通過動物實驗并分析免疫組化及免疫印跡后證實,柚皮素通過下調(diào)NF-κB的表達水平,抑制NF-κB介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥,同時,柚皮素還可以限制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活,抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng),進而改善神經(jīng)功能及預(yù)后。Satoshi Okuyama等[23]實驗發(fā)現(xiàn),柚皮素對于阻止小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的過度激活具有顯著作用,同時對缺血后海馬區(qū)神經(jīng)細胞死亡具有抑制作用,而海馬結(jié)構(gòu)是否完整與腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重程度關(guān)系密切[24]。

2 抗氧化作用

氧化應(yīng)激是細胞代謝過程中一種無法避免的現(xiàn)象,但有學(xué)者認(rèn)為過度的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細胞出現(xiàn)死亡。作為缺血再灌注損傷的核心環(huán)節(jié),腦缺血再灌注損傷時,神經(jīng)細胞內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,產(chǎn)生大量氧自由基[25],并攻擊恢復(fù)血供的神經(jīng)細胞和周圍正常神經(jīng)細胞,進一步加重神經(jīng)功能損傷[26,27]。柚皮素作為一種良好的天然抗氧化劑,在腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護中具有重要地位,對減輕神經(jīng)系統(tǒng)氧化反應(yīng)、改善神經(jīng)功能預(yù)后具有重要作用。既往研究表明,核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信號通路在抗氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用[28],是體內(nèi)調(diào)節(jié)抗氧化過程的有效途徑,通過調(diào)控偶聯(lián)反應(yīng)和細胞抗氧化能力控制基因的表達,減少自由基產(chǎn)生,提高機體抗氧化作用,來維持體內(nèi)氧化與抗氧化作用平衡進而使細胞處于氧化還原穩(wěn)態(tài)[29],從而減少神經(jīng)元凋亡以保護神經(jīng)細胞[30]。研究表明,通過激活體內(nèi)Nrf2/HO-1信號途徑可促進抗氧化蛋白HO-1的表達從而發(fā)揮對大腦神經(jīng)細胞缺血再灌注損傷的保護作用進而改善和修復(fù)受損的神經(jīng)功能[31]。目前,柚皮素通過Nrf2/HO-1通路作用于機體其他細胞相關(guān)研究較為廣泛,而其在神經(jīng)功能保護方面機制正成為研究熱點[32]。有研究發(fā)現(xiàn),柚皮素治療可降低外周血中炎細胞水平,抑制炎癥因子的釋放,提高Nrf2和HO-1蛋白表達,減輕細胞氧化應(yīng)激[33]。王毅華等[34,35]通過構(gòu)建體外原代大腦皮層神經(jīng)細胞培養(yǎng)氧糖剝奪/再灌注(Oxygen-glucose Deprivation and Reperfusion,OGD/R)模型證實,柚皮素可通過激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化途徑,改變體內(nèi)氧化與抗氧化失衡狀態(tài),進而減輕神經(jīng)細胞氧化損傷以保護神經(jīng)功能。同時,還有研究表明,Nrf2/ARE信號通路具有抗氧化、抗細胞凋亡、神經(jīng)保護等多種作用,柚皮素通過Nrf2/ARE信號通路也可減輕氧化應(yīng)激并改善線粒體功能實現(xiàn)神經(jīng)功能保護[36],但關(guān)于Nrf2/ARE信號通路更深入的研究有待進一步展開。

3 減輕腦組織水腫作用

水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是調(diào)節(jié)水分子轉(zhuǎn)運的重要結(jié)構(gòu),目前已知的有13種亞型,其中水通道蛋白4 (Aquaporin 4,AQP4)主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與腦血管與周圍神經(jīng)組織水分子轉(zhuǎn)運[37],研究表明AQP4與腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成關(guān)系密切[38]。王娟等[39]研究發(fā)現(xiàn),柚皮素與腫瘤壞死因子TNF具有良好的結(jié)合性,通過減少組織中TNF的含量減輕炎性反應(yīng)進而減輕腦水腫。Gaur等[40]給予50 mg/kg和100 mg/kg的柚皮素處理后大鼠腦組織水腫及氧化損傷明顯減輕,同時鏡下觀察發(fā)現(xiàn)實驗大鼠腦組織病理改變顯著逆轉(zhuǎn)。Somuncu等[41]給予腦缺血再灌注損傷后腦水腫大鼠模型上述劑量柚皮素處理,進一步研究發(fā)現(xiàn)柚皮素可顯著降低大鼠體內(nèi)升高的腦組織AQP4IL-2和8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHDG)水平。此外,當(dāng)發(fā)生缺血性卒中時,血腦屏障可因此受到破壞,作為存在于腦組織與周圍血管之間的天然屏障,血腦屏障在平衡腦組織與外周交換中起重要作用,在腦組織恢復(fù)再灌注時,因缺少天然屏障的保護,神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境可發(fā)生紊亂,亦可導(dǎo)致水鈉潴留,加重腦水腫。Han等[42]在研究中發(fā)現(xiàn),柚皮素通過減輕氧化應(yīng)激和細胞凋亡改善血腦屏障的損傷進而減輕神經(jīng)功能損傷和腦水腫。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)介導(dǎo)的信號通路能夠引起內(nèi)皮細胞增生,致使其通透性增強,誘發(fā)血管腫瘤以及血管滲透,從而使周圍水腫及炎癥形成。柚皮素可通過調(diào)控VEGF信號通路抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達,抑制新生血管形成,改善神經(jīng)系統(tǒng)水鈉交換,減輕腦水腫,促進神經(jīng)細胞血液灌注,改善神經(jīng)功能損傷[43]。由此可見,梗死后腦組織水腫是多種因素作用的結(jié)果,柚皮素可通過不同途徑分別減輕腦組織水腫,這是與腦缺血再灌注損傷病理生理發(fā)展中多因素相互作用過程相符的。

4 抗細胞凋亡作用

當(dāng)腦梗死發(fā)生時,梗死中心區(qū)域腦組織因缺血發(fā)生壞死,而周圍區(qū)域則表現(xiàn)為缺血半暗帶,早期溶栓治療旨在恢復(fù)缺血半暗帶這一區(qū)域的血供,改善損傷的神經(jīng)功能。而缺血半暗帶區(qū)域腦組織在血供恢復(fù)的過程中常表現(xiàn)為延遲性程序性死亡,即細胞凋亡。細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中起著重要的作用,可導(dǎo)致神經(jīng)功能不可逆性損傷進一步加重,相關(guān)研究表明,這與多種因素如過量的氧自由基、炎性因子、線粒體損傷、鈣超載等有關(guān)[44]。大量研究證實,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)在減輕腦缺血再灌注損傷造成的細胞凋亡中起重要作用[45,46]。Ni等[47]通過觀察發(fā)現(xiàn),激活HIF-1α/VEGFA途徑可以明顯減輕腦腦缺血再灌注損傷。Cao等[48]研究證實,柚皮素可靶向作用于核因子-κB亞型1(Nuclear factor kappa B subunit 1,NFKB1)來調(diào)控HIF-1α/AKT/mTOR信號通路控制調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達,進而預(yù)防氧糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。另有研究表明,鈣離子參與體內(nèi)多種細胞活動,當(dāng)神經(jīng)細胞灌注恢復(fù)后,細胞內(nèi)出現(xiàn)大量鈣離子,即鈣超載[49]。體內(nèi)鈣超載主要與谷氨酸受體過度激活[50]、生物膜離子通道功能異常[51-53]、高爾基體[54]、鈣調(diào)蛋白功能異常[55]等因素有關(guān)。體內(nèi)過多的鈣離子可通過氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[56]及線粒體損傷[57]等多種途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。研究認(rèn)為,柚皮素可增加鈣結(jié)合蛋白含量,進而降低細胞內(nèi)的游離鈣離子濃度,從而改善鈣超載狀態(tài),減輕細胞凋亡[58]。目前,國內(nèi)外關(guān)于柚皮素對體內(nèi)鈣超載的影響多集中在以鈣超載為中心的上下作用環(huán)節(jié),單純針對鈣超載的相關(guān)研究比較匱乏,而鈣超載是神經(jīng)細胞腦缺血再灌注損傷多種作用的共同通路,因此針對柚皮素作用于腦缺血再灌注損傷后鈣超載通路相關(guān)機制具有廣泛研究價值。

5 調(diào)節(jié)線粒體自噬作用

線粒體是機體內(nèi)生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的重要場所,通過氧化磷酸化途徑為細胞內(nèi)多種生命活動提供能量。當(dāng)缺血缺氧時,線粒體內(nèi)呼吸鏈結(jié)構(gòu)和功能隨之出現(xiàn)異常,功能酶活性顯著降低,影響正常生物代謝及信號傳導(dǎo)過程,進而導(dǎo)致線粒體損傷,神經(jīng)細胞出現(xiàn)線粒體相關(guān)性程序性凋亡[59]。當(dāng)缺血腦組織恢復(fù)再灌注時,氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載等多種病理過程進一步加重線粒體損傷[60]。王凱華等[61]通過構(gòu)建大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型證實,柚皮素可增強線粒體自噬來減少細胞內(nèi)腫脹損傷的線粒體,進而減輕神經(jīng)細胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。同時,有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)缺血腦組織恢復(fù)再灌注時,可導(dǎo)致線粒體自噬過度激活,使得結(jié)構(gòu)和功能完整的線粒體一同被清除[62]。因此,在恢復(fù)再灌注減輕細胞損傷的同時,如何避免線粒體自噬過度激活顯得尤為重要。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),柚皮素對于線粒體自噬的調(diào)節(jié),可能與腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)介導(dǎo)的信號通路有關(guān)[63,64]。但是目前更進一步的研究較為缺乏,而線粒體自噬作為腦缺血再灌注損傷中重要的一個環(huán)節(jié),與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載等多種病理過程和細胞凋亡關(guān)系密切,對于神經(jīng)細胞保護起著承上啟下的作用,因此,針對柚皮素對于線粒體自噬調(diào)節(jié)的研究需要進一步補充。

腦梗死是目前威脅人類健康的一大常見原因,因其高致殘、高經(jīng)濟負擔(dān)被人們所忌憚,超早期靜脈溶栓對恢復(fù)梗死區(qū)域缺血半暗帶腦組織血供、減輕神經(jīng)功能損傷、改善患者預(yù)后具有關(guān)鍵作用,是目前治療腦缺血性卒中血管內(nèi)治療最主要的手段之一。然而,在缺血腦組織恢復(fù)血供的同時,再灌注損傷卻能導(dǎo)致本未完全恢復(fù)的神經(jīng)損傷進一步加重,如何減輕腦梗死患者超早期靜脈溶栓后再灌注損傷是目前國內(nèi)外研究的熱點話題之一。腦梗死溶栓后再灌注損傷絕非單一機制造成的,而各種機制之間又相互影響相互作用,形成滾雪球效應(yīng),損傷不斷放大,加重神經(jīng)功能損傷。然而現(xiàn)階段研究多針對腦缺血再灌注損傷的某一個環(huán)節(jié)或靶點展開,不能夠整體而系統(tǒng)的把握疾病發(fā)展與轉(zhuǎn)歸,這與腦缺血再灌注損傷各機制相互作用、瀑布樣放大的病理發(fā)展特征背道而馳,整體而系統(tǒng)的把控腦缺血再灌注損傷發(fā)病機制,對于疾病的更深層次的研究及治療顯得尤為重要。

柚皮素作為一種廣泛存在的天然藥物,價格低廉,副作用小,廣泛應(yīng)用于多個中藥方,對于腦梗死患者的治療已具有一定的經(jīng)驗。近年來,柚皮素在腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護機制及作用靶點研究中取得了大量令人矚目的成果,其透過血腦屏障的能力暗示著其在神經(jīng)系統(tǒng)用藥的廣泛前景。柚皮素可以同時作用于腦缺血再灌注損傷疾病轉(zhuǎn)歸中的多個節(jié)點減輕神經(jīng)細胞損傷改善神經(jīng)功能,通過調(diào)控體內(nèi)多種信號通路發(fā)揮其抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等作用實現(xiàn)保護腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的目的。但是柚皮素在腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護機制及作用靶點的研究仍有許多方面需要進一步深入。首先,目前大量研究發(fā)現(xiàn)柚皮素對于腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護作用確切且對于其作用機制與作用靶點具有一定了解,但是如上所述,為發(fā)揮更好的療效,仍有一部分機制需要進一步明確。其次,柚皮素雖已實現(xiàn)大量制備且實驗中可穩(wěn)定釋放藥效,但該藥物研究主要處在動物實驗階段,而在臨床試驗研究階段相對較少,因此需要對柚皮素進一步探索和研究,爭取早日開展規(guī)范、正規(guī)的臨床試驗,以期為實現(xiàn)早日臨床推廣提供充分的理論依據(jù)。相信隨著動物實驗研究的有序進展和臨床實踐的逐步推進,柚皮素在腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護機制及作用靶點的研究定會取得突破性進展,柚皮素在腦缺血再灌注損傷治療與預(yù)防中定會進一步發(fā)揮重要作用。