不同重金屬污染水平下生物結(jié)皮及下層土壤細(xì)菌群落的差異性分析

樊 瑾,王融融,叢士翔,常文靜,余海龍,*,黃菊瑩

1 寧夏大學(xué)地理科學(xué)與規(guī)劃學(xué)院,銀川 750021 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所,楊凌 712100 3 寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院,銀川 750021

隨著近些年礦產(chǎn)資源開發(fā)與工業(yè)進(jìn)程的加快,帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也產(chǎn)生了大量重金屬污染物,它們通過干、濕沉降進(jìn)入周邊土壤或被植物葉片直接吸收,引起土壤和植物中As、Cd等多種重金屬含量超標(biāo),甚至進(jìn)入食物鏈威脅人類健康[1-2]。由于重金屬的隱蔽性高、易累積、難降解且毒性強(qiáng),進(jìn)行重金屬污染修復(fù)工作顯得亟不可待。目前常用的修復(fù)方法有客土法、土壤淋洗法、植物修復(fù)法、生物炭修復(fù)法等[3]。然而,這些方法在實(shí)際的修復(fù)效果中都存在成本高、單一手段修復(fù)效率低等問題。微生物對土壤中微量金屬離子靈敏度高、特異性強(qiáng),兼具環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn),在環(huán)境監(jiān)測和重金屬污染治理中有著廣泛的應(yīng)用前景[4]。尤其是土壤細(xì)菌對土壤環(huán)境質(zhì)量變化敏感[5],可通過土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化對土壤是否被污染、污染的程度、污染的效應(yīng)和風(fēng)險(xiǎn)做出及時(shí)、科學(xué)的客觀判斷[6]。

生物結(jié)皮(Biocrusts)是由土壤顆粒與細(xì)菌、真菌、藻類和苔蘚植物相互作用形成的有機(jī)復(fù)合體[7]。作為尾礦地植被恢復(fù)過程中的先鋒拓殖生物體和重要的地表覆蓋物,一方面生物結(jié)皮中的植物體藻、苔蘚具有獨(dú)特的生物構(gòu)造被認(rèn)為是良好的重金屬富集材料[8-9],另一方面生物結(jié)皮通過吸附和截留大氣降塵和溶解于降水中的礦物質(zhì),促進(jìn)土壤顆粒細(xì)化,改善土壤結(jié)構(gòu),為微生物和土壤動物提供適宜的微生境[10],因此被視作潛在修復(fù)重金屬污染的理想材料。

有研究表明,細(xì)菌能夠通過胞內(nèi)聚集、礦化沉淀、吸附溶解等方式,改變土壤重金屬賦存形態(tài),調(diào)控其生物有效性[11],影響植物對重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),直接或間接活化吸收或固化土壤中重金屬[12]。然而,現(xiàn)有研究多聚焦于特定菌種-超積累植物的狹隘組合,成本高且植物的移栽過程繁瑣,修復(fù)效果往往差強(qiáng)人意。目前應(yīng)用生物結(jié)皮修復(fù)重金屬污染物的相關(guān)研究較少,對其可能的修復(fù)效果和機(jī)制并不明確。此外,人們對于重金屬污染過程如何驅(qū)動生物結(jié)皮及其下層土壤細(xì)菌群落變化知之甚少,對于不同重金屬污染背景下生物結(jié)皮層及下層土壤細(xì)菌群落的異同及原因鮮見報(bào)道。這在一定程度上制約了人們對微生物在修復(fù)退化生態(tài)系統(tǒng)過程中的貢獻(xiàn)及作用的科學(xué)評估。

基于此,本研究以寧夏東部荒漠草地和工礦區(qū)為研究區(qū)域,選取自然分布的2種生物結(jié)皮(藻結(jié)皮和苔蘚結(jié)皮)為研究對象,探究生物結(jié)皮富集重金屬效應(yīng),分析不同重金屬污染程度下生物結(jié)皮層及下層土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)、組成、多樣性,探討哪些關(guān)鍵的環(huán)境因子驅(qū)動了細(xì)菌群落的變異。研究結(jié)果旨在揭示生物結(jié)皮及其下層土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)對不同土壤重金屬污染水平的響應(yīng)及重金屬污染的生物指示程度,為重金屬污染的微生物修復(fù)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)地處寧夏東部,屬典型溫帶大陸性氣候,年均降水量190.4 mm,年均蒸發(fā)量2088.2 mm,年均溫6.7-8.8℃。土壤類型主要為灰鈣土和風(fēng)沙土,質(zhì)地偏砂,土層厚度約為50 cm,結(jié)構(gòu)松散。受水分條件限制,植被以耐旱、耐寒、耐土壤貧瘠的灌木和草本植物為主,自然形成的生物結(jié)皮廣泛分布,以藻類和地衣類結(jié)皮為主,蘚類結(jié)皮大多以斑塊狀分布。

1.2 樣地設(shè)置及樣品采集

依據(jù)生產(chǎn)活動類型差異造成的重金屬污染水平差異,本研究設(shè)置工礦區(qū)和封育區(qū)(圖1)。其中工礦區(qū)位于寧東基地核心區(qū)的馬蓮臺電廠周邊(37°48′N,107°21′E)。馬蓮臺電廠是寧夏發(fā)電集團(tuán)公司獨(dú)資建設(shè)的第一個(gè)大型火力發(fā)電廠,于2005年投產(chǎn),設(shè)計(jì)規(guī)模為2×330MW+2×600MW+2×1000MW。在盛行風(fēng)向(西北風(fēng))的下風(fēng)向,選取地形相對平坦且無高大樹木遮擋(為避免地形、植被對本研究的影響)的生物結(jié)皮分布區(qū)作為研究樣地。依據(jù)電廠產(chǎn)生的燃煤煙塵排放距離、方向,將位于電廠東南方向100 km處楊寨子村的封育草地設(shè)為封育區(qū)(周邊無工業(yè)活動)。兩個(gè)樣地均發(fā)育有大面積的生物結(jié)皮,且其組成和類型基本一致(表1)。依據(jù)生物結(jié)皮中優(yōu)勢類群的差異,選取發(fā)育良好的藻結(jié)皮和蘚結(jié)皮。其中,藻結(jié)皮在自然狀態(tài)下多為黑色,成片分布;蘚結(jié)皮在自然狀態(tài)下為深褐色,雨后為綠色,多呈斑塊狀分布。

表1 樣地基本信息Table 1 Basic information of the two sample plots

圖1 研究區(qū)位置Fig.1 Location of study area

圖2 生物結(jié)皮A、B層土壤細(xì)菌群落OTU的Venn圖Fig.2 Venn diagram of the OTUs of the soil bacterial communities in A and B horizons of biocrustsSZ-A: 工礦區(qū)藻結(jié)皮層 Algal biocrustal layer in mining area; DZ-A: 封育區(qū)藻結(jié)皮層 Algal biocrustal layer in enclosed area; ST-A: 工礦區(qū)苔蘚結(jié)皮層 Moss biocrustal layer in mining area; DT-A: 封育區(qū)苔蘚結(jié)皮層 Moss biocrustal layer in enclosed area; SZ-B: 工礦區(qū)藻結(jié)皮層下土壤 Soil below Algal biocrust in mining area; DZ-B: 封育區(qū)藻結(jié)皮層下土壤 Soil below Algal biocrust in enclosed area; ST-B: 工礦區(qū)苔蘚結(jié)皮層下土壤 Soil below Moss biocrust in mining area; DT-B: 封育區(qū)苔蘚結(jié)皮層下土壤 Soil below Moss biocrust in enclosed area;本研究以0-1 cm為生物結(jié)皮層,標(biāo)記為A層;生物結(jié)皮層下0-5 cm為結(jié)皮下層,標(biāo)記為B層

據(jù)前期研究工作[13],2類生物結(jié)皮的厚度均小于1 cm(藻結(jié)皮2.54-3.08 mm,蘚結(jié)皮6.13-7.23 mm),因此本研究以0-1 cm為生物結(jié)皮層,標(biāo)記為A層;生物結(jié)皮層下0-5 cm為結(jié)皮下層,標(biāo)記為B層。

采樣工作于2019年10月進(jìn)行,在工礦區(qū)和封育區(qū)各布設(shè)3個(gè)生物結(jié)皮的典型樣地(40 m×40 m,間隔至少50 m),每個(gè)樣地內(nèi)設(shè)置3個(gè)典型的子樣方(10 m×10 m,間隔至少15 m),子樣方中同時(shí)包含藻結(jié)皮和蘚結(jié)皮斑塊。采用5點(diǎn)采樣法,先用木鏟鏟取A層結(jié)皮,再挖取B層土壤,之后將同一土層的5個(gè)小斑塊所采樣本混勻并標(biāo)記好。因結(jié)皮斑塊面積大小不等,取樣斑塊至少為6 cm×6 cm。共采集24個(gè)樣本(A層樣本12個(gè),B層土壤樣本12個(gè),n=3),所有樣本置于冰盒內(nèi)保存,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 樣本測定

將采集的樣本各取10 g置于-20℃冰箱,短暫保存進(jìn)行DNA提取和后續(xù)研究。剩余樣本風(fēng)干,測定pH、電導(dǎo)率、有機(jī)碳等指標(biāo)。土壤基本理化指標(biāo)的測定參考《土壤農(nóng)化分析》。重金屬(Zn、As、Cd、Cr、Pb、Hg)含量的測定采用密封微波消解體系消解樣本,利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測消解液中重金屬濃度。

1.4 重金屬污染負(fù)荷指數(shù)分析

本研究運(yùn)用重金屬污染負(fù)荷指數(shù)(Pollution Load Index)法[14]對生物結(jié)皮A、B層重金屬進(jìn)行污染評價(jià)。

1.5 樣本DNA提取、擴(kuò)增和和高通量測序

根據(jù)Power SoilTM DNA試劑盒說明書提取土壤總DNA。之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板,采用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細(xì)菌16S rDNA-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每一樣本的引物均含有特異的Barcode序列用于區(qū)分樣本序列。測序由北京諾禾致源Illumina NovaSeq PE250測序平臺完成。

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析

采用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)的進(jìn)行質(zhì)控,過濾去除低質(zhì)量Reads。采用FLASH(V1.2.7)進(jìn)行序列拼接、QIIME(V1.7.0)進(jìn)行序列再過濾。采用UPARSE軟件在97%的相似水平下進(jìn)行可操作分類單元(OTU,Operational Taxonomic Units)的聚類。樣品中的微生物多樣性和各類微生物的豐度都是基于OTU的分析。采用RDP classifier(V2.2)對照Silva數(shù)據(jù)庫以80%置信度對OTU代表序列進(jìn)行物種注釋。為避免各樣本生物量的差異,按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行樣本序列的抽平處理,得到標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析?；贠TU結(jié)構(gòu)分析α多樣性、β多樣性及優(yōu)勢菌群差異,評估不同重金屬污染水平下兩類生物結(jié)皮A、B層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異。其中,細(xì)菌群落的α多樣性指標(biāo)(Chao1、ACE、Shannon-Weiner和Simpson指數(shù))通過Qiime平臺計(jì)算。β多樣性是基于兩兩樣本間距離矩陣反映樣本間的差異,通過PCoA進(jìn)行可視化展示[15]。

采用Origin 2021繪圖。在數(shù)據(jù)符合方差齊性的條件下,采用單因素方差分析(LSD,Duncan)進(jìn)行不同處理間的多重比較,反之采用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney法。采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析優(yōu)勢細(xì)菌門與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性。采用Canoco 5.0進(jìn)行土壤理化因子和細(xì)菌群落變化的冗余分析。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物結(jié)皮A、B層土壤理化性質(zhì)

所有樣本的pH值均大于7,土壤偏堿性(表2)。A層和B層的pH、電導(dǎo)率、有機(jī)碳、全氮、全磷、速效氮、速效磷、黏粒和粉粒都有顯著差異,表現(xiàn)出隨著生物結(jié)皮的演替,pH逐漸降低,有機(jī)碳、養(yǎng)分逐漸增高且A層始終高于B層(P<0.05)。其中有機(jī)碳和速效氮變化幅度最大。同一土層中,工礦區(qū)生物結(jié)皮的有機(jī)碳、全氮、全磷、速效氮、速效磷、黏粒和粉粒高于封育區(qū),而pH、砂粒含量低于封育區(qū)。

表2 生物結(jié)皮A、B層理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of A and B horizons of biocrusts

2.2 生物結(jié)皮A、B層土壤重金屬及污染評價(jià)

工礦區(qū)和封育區(qū)生物結(jié)皮A、B層土壤中重金屬含量見表3。總體表現(xiàn)為工礦區(qū)生物結(jié)皮A、B層土壤中重金屬含量顯著高于封育區(qū),生物結(jié)皮A層和B層的Cd和Zn含量差異顯著(P<0.05)。從藻結(jié)皮向蘚結(jié)皮演替過程中,生物結(jié)皮富集重金屬的能力呈增強(qiáng)趨勢。本研究以寧夏土壤背景值[16]作為重金屬污染程度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行參比評價(jià)。結(jié)果顯示該區(qū)域生物結(jié)皮的6類重金屬元素均存在不同程度污染(表4)。2個(gè)樣地中,所有樣本重金屬元素的最高污染系數(shù)(CFi)表現(xiàn)出一致的規(guī)律:Hg>Cd>As>Cr>Zn>Pb,污染負(fù)荷指數(shù)(IPL)排序結(jié)果為苔蘚結(jié)皮A層>苔蘚結(jié)皮B層>藻結(jié)皮A層>藻結(jié)皮B層。說明重金屬對生物結(jié)皮層及其下土壤均有影響。IPLZONE的結(jié)果表明工礦區(qū)為極強(qiáng)污染程度。

表3 生物結(jié)皮A、B層土壤重金屬含量Table 3 Heavy mental contents of A and B horizons of biocrusts

表4 生物結(jié)皮A、B層土壤重金屬污染評價(jià)Table 4 Evaluation of heavy metal pollution in A and B horizons of biocrusts

2.3 生物結(jié)皮及其下土壤細(xì)菌群落α多樣性

每一個(gè)OTU代表一種微生物。根據(jù)細(xì)菌OTU數(shù)目類群劃分,可區(qū)分不同生境中生物結(jié)皮中細(xì)菌的種群。α多樣性表征微生物群落的豐富度和多樣性,Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表征物種豐富度,Shannon指數(shù)和組成及分布。Venn圖顯示了不同供試樣本中特異和共有OTU數(shù)量差異。結(jié)果顯示(圖3),A層OTU數(shù)量排序?yàn)?STA(6411) >DTA(6336) >DZA(5983) >SZA(5681);B層OTU數(shù)量排序?yàn)?DTB(6654) >SZB(6268)>DZB(5977) >STB(5565)。盡管生物結(jié)皮A層OTU數(shù)量低于B層,但共有OTU數(shù)量高于B層。工礦區(qū)生物結(jié)皮A、B層的特異OTU數(shù)量均低于封育區(qū),苔蘚結(jié)皮的OTU數(shù)量高于藻結(jié)皮。說明生物結(jié)皮通過富集大氣降塵重金屬能夠影響生物結(jié)皮A、B層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),并存在種間差異。

圖3 生物結(jié)皮A、B層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacterial community structure of A and B horizons of biocrusts

α多樣性表征微生物群落的豐富度和多樣性,Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表征物種豐富度,Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征菌群的多樣性。測序覆蓋率用來評估測序深度。由表5可知,所有供試樣本測序覆蓋率均 >0.97,表明細(xì)菌群落置信度高,測序數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。兩個(gè)樣地生物結(jié)皮A層的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)均低于B層土壤,表明A層細(xì)菌豐富度低于B層。工礦區(qū)2類生物結(jié)皮A、B層的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均大于封育區(qū);工礦區(qū)藻結(jié)皮A、B層的Chao1和ACE指數(shù)亦大于封育區(qū),但苔蘚結(jié)皮A、B層的Chao1和ACE指數(shù)小于封育區(qū)。

表5 生物結(jié)皮A、B層土壤細(xì)菌群落α多樣性Table 5 Bacterial community α diversity in A and B horizons of biocrusts

2.4 生物結(jié)皮A、B層土壤細(xì)菌群落β多樣性

為了進(jìn)一步了解不同程度重金屬污染程度下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異,通過基于Bray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA)可以將兩個(gè)樣地間、結(jié)皮類型及層下土壤間的細(xì)菌群落相似度和差異性通過點(diǎn)與點(diǎn)間的距離體現(xiàn)出來。如圖3所示,在不同生境(工礦區(qū)與封育區(qū))或不同土層間(A、B層),生物結(jié)皮樣點(diǎn)間的距離較遠(yuǎn),表明不同樣地和不同土層的細(xì)菌群落組成均存在明顯差異;而在同一生境中,不論A層還是B層,2類生物結(jié)皮樣點(diǎn)間的距離均較近,表明處于相同樣地、相同土層的藻、蘚結(jié)皮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似,且同類結(jié)皮土壤細(xì)菌群落相似。由此推斷,人為活動(如重金屬污染引起土壤環(huán)境的變化)是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的主要驅(qū)動因素。PCoA1和PCoA2共同解釋了40.99%的變異,其中,PCoA1解釋了總變異的24.88%,而PCoA2解釋了總變異的16.11%。

2.5 生物結(jié)皮A、B層土壤的細(xì)菌群落組成

生物結(jié)皮A、B層土壤中門水平細(xì)菌相對豐度結(jié)果顯示(圖4):放線菌門(Actinobacteria,16.64%-40.75%)、變形菌門(Proteobacteria,15.30%-26.03%)和酸桿菌門(Acidobacteria,8.49%-25.29%)為供試樣本中的優(yōu)勢菌門,相對豐度最高。其他主要細(xì)菌有芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,4.49%-11.45%)、綠彎菌門(Chloroflexi,3.71%-10.87%)、浮霉菌門(Planctomycetes,2.32%-7.91%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,0.98%-7.48%)、厚壁菌門(Firmicutes,0.32%-3.98%)、奇古菌門(Thaumarchaeota,0.96%-2.81%)、疣微菌門(Verrucomicrobia,0.87%-1.93%)、裝甲菌門(Armatimonadetes,0.77%-1.23%)、棒狀桿菌門(Rokubacteria,0.27%-0.65%)、硝化螺菌門(Nitrospirae,0.16%-0.36%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria,0.02%-26.48%)、迷蹤菌門(Elusimicrobia,0.02%-0.07%)。其中藍(lán)細(xì)菌門為藻結(jié)皮的特有種,相對豐度顯著高于苔蘚結(jié)皮(P<0.01)。工礦區(qū)中的放線菌門、綠彎菌門和裝甲菌門相對豐度大于封育區(qū),厚壁菌門和迷蹤菌門相對豐度小于封育區(qū)。就土層來看,A層的變形菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、厚壁菌門和硝化螺菌門相對豐度小于B層,而擬桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門相對豐度大于B層。

圖4 生物結(jié)皮A、B層土壤中門水平優(yōu)勢細(xì)菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of the bacterial phylum in A and B horizons of biocrustsAci: 酸桿菌門Acidobacteria; Act: 放線菌門 Actinobacteria; Pro: 變形菌門 Proteobacteria; Bac: 擬桿菌門 Bacteroidetes; Gem: 芽單胞菌門 Gemmatimonadetes; Chl: 綠彎菌門 Chloroflexi; Fir: 厚壁菌門 Firmicutes; Unc: 未分類unclassified; Pla: 浮霉菌門 Planctomycetes; Tha: 奇古菌門Thaumarchaeota; Ver: 疣微菌門 Verrucomicrobia; Arm: 裝甲菌門 Armatimonadetes; Rok: 棒狀桿菌門 Rokubacteria; Nit: 硝化螺菌門 Nitrospirae; Cya: 藍(lán)細(xì)菌門 Cyanobacteria; Elu: 迷蹤菌門 Elusimicrobia

2.6 土壤環(huán)境因子與生物結(jié)皮A、B層細(xì)菌群落的關(guān)系

對2個(gè)樣地的優(yōu)勢細(xì)菌門與土壤環(huán)境因子進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,旨在厘清不同重金屬污染水平下生物結(jié)皮A、B層細(xì)菌群落多樣性及優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度產(chǎn)生顯著差異的原因。結(jié)果表明(圖5):α多樣性(Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Simpson指數(shù))與Hg、As、Cr、pH呈正相關(guān)關(guān)系,與Cd、EC、SOC、TN呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,但只有Shannon指數(shù)與Hg達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

圖5 生物結(jié)皮A、B層中優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度、α多樣性與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性Fig.5 Correlation of relative abundance and α diversity of dominant phyla in biocrust and subsoil with soil environmental factorsClay: 黏粒; Silt: 粉粒; Sand: 砂粒; EC: 電導(dǎo)率Electrical conductivity; SOM: 有機(jī)質(zhì)Soil organic matter; TN: 全氮Total nitrogen; TP: 全磷Total phosphorus; AN: 速效氮Available nitrogen; AP: 速效磷Available phosphorus; IPL: 污染負(fù)荷指數(shù) Pollution Load Index;*P<0.05;**P<0.01

在優(yōu)勢細(xì)菌門中,酸桿菌門與Clay相關(guān)性最強(qiáng)(圖5,P<0.01);迷蹤菌門與Sand相關(guān)性最強(qiáng)(P<0.01);變形菌門、擬桿菌門與pH相關(guān)性最強(qiáng)(P<0.01);厚壁菌門與EC相關(guān)性最強(qiáng)(P<0.01);芽單胞菌門與AP相關(guān)性最強(qiáng);綠彎菌門(P<0.01)、疣微菌門、藍(lán)細(xì)菌門與Hg相關(guān)性最強(qiáng)(P<0.05);裝甲菌門與Pb相關(guān)性最強(qiáng)(P<0.01);棒狀桿菌門、硝化螺菌門與Cd相關(guān)性最強(qiáng)(P<0.05);浮霉菌門與Cr相關(guān)性最強(qiáng)(P<0.05)。

為進(jìn)一步厘清土壤理化性質(zhì)變化對生物結(jié)皮及下層土壤細(xì)菌群落的影響,利用Canoco 5.0軟件進(jìn)行了門水平優(yōu)勢細(xì)菌與土壤環(huán)境因子的RDA分析。結(jié)果顯示,對細(xì)菌群落變異貢獻(xiàn)率前5的土壤因子有As(14.3%)> Clay(11.4%)> pH(9.7%)> Pb(8.3%)> Zn(7.7%),說明As、Pb、Zn是影響當(dāng)?shù)丶?xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重金屬元素,而黏粒含量和pH是影響當(dāng)?shù)丶?xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵土壤理化因子(表6,P<0.05)。

表6 冗余分析(RDA)中各因子的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 6 Significance of factors in redundancy analysis (RDA)

3 討論

3.1 生物結(jié)皮基本理化性質(zhì)及其對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

大氣降塵作為荒漠區(qū)成土母質(zhì)的來源,其組成、通量會影響生物結(jié)皮的成土過程、方向和污染程度。本研究中,生物結(jié)皮A層具有明顯富集大氣降塵細(xì)顆粒物的能力,并隨著生物結(jié)皮演替方向呈逐漸增強(qiáng)趨勢,促進(jìn)了生物結(jié)皮A層機(jī)械組成的細(xì)化和養(yǎng)分含量的增加,尤其是工礦區(qū)表現(xiàn)尤為突出。這是由于工礦區(qū)位于寧夏典型工礦企業(yè)富集區(qū),氮沉降較高[17],大氣降塵來源復(fù)雜,在富含重金屬顆粒物的同時(shí),還具有較高的養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)含量[18],而封育區(qū)大氣降塵主要以沙塵為主,粒徑較粗[19]。生物結(jié)皮A層的pH值均略低于B層,可能是A層中的微生物能分泌酸性物質(zhì)所致[20]。生物結(jié)皮具有顯著改變土壤pH、土壤養(yǎng)分含量及有機(jī)碳含量的功能[21-22]。其中,藻結(jié)皮具有顯著的固氮能力[23],而苔蘚結(jié)皮具有更好的固碳作用[24]。本研究中,生物結(jié)皮捕獲近地表風(fēng)沙流、大氣降塵和凋落物,促進(jìn)了各類生物結(jié)皮A、B層土壤養(yǎng)分含量的提高,其中以蘚結(jié)皮的氮和磷增加幅度最為顯著(表6),這主要是由于苔蘚結(jié)皮具有更高的生物量,且其凋落物是土壤氮和磷的重要來源[25-26]。

已有研究表明,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性會受到外界因素如植被類型、土壤理化性質(zhì)等的影響,并可以作為衡量土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感指標(biāo)[27-28]。生物結(jié)皮具有富集及積累大氣降塵重金屬污染物的作用[2]。本研究中,生物結(jié)皮對大氣降塵重金屬元素具有表層富集效應(yīng),表現(xiàn)為A層污染程度高于B層。重金屬污染會顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[29]。工礦區(qū)生物結(jié)皮A層重金屬元素Hg、As、Cd、含量超過寧夏土壤背景值。特別是苔蘚結(jié)皮A層污染負(fù)荷指數(shù)已達(dá)重度污染等級。由于細(xì)菌群落對重金屬污染敏感,其組成、多樣性和相對豐度會對重金屬污染做出響應(yīng)。本研究中,重金屬污染水平更高的工礦區(qū)生物結(jié)皮A、B層的特異OTU數(shù)量均低于封育區(qū)(圖2)。富集重金屬能力較弱的藻結(jié)皮A、B層的細(xì)菌豐富度指數(shù)(Chao1和ACE指數(shù))高于封育區(qū),富集重金屬能力較強(qiáng)的苔蘚結(jié)皮A、B層細(xì)菌豐富度指數(shù)低于封育區(qū),但所有供試樣本中均表現(xiàn)為B層土壤細(xì)菌多樣性和豐富度更高(表5)。這和唐凱[30]在渾善達(dá)克沙地生物結(jié)皮細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)論一致?？赡苁怯捎诮Y(jié)皮層富集的重金屬長期賦存于在土壤中,部分細(xì)菌對重金屬產(chǎn)生抗性,造成一些對重金屬毒性耐受性強(qiáng)的細(xì)菌增殖,相對豐度增大,并使一些耐受性差的細(xì)菌相對豐度減少,這和鄧琳靜[31]和Li等[32]關(guān)于重金屬脅迫下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化規(guī)律一致。

植物物種對細(xì)菌群落具有重要影響[33]?；贐ray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析結(jié)果表明,同一生境的不同種生物結(jié)皮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似,在圖中聚類比較明顯,但A層和B層的細(xì)菌群落離散程度較高,說明富集重金屬更多的表層更易于發(fā)生細(xì)菌群落組成變異(圖3)。本研究中,兩個(gè)樣地共存于同一類型生態(tài)系統(tǒng),且無明顯的地理隔離?？梢酝茰y細(xì)菌群落β多樣性分布可能是由土壤重金屬含量的空間異質(zhì)性,使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生分化。

土壤性狀顯著影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[20],且這種影響隨著重金屬污染程度、重金屬賦存狀態(tài)[34]、地上植被類型和土壤基本理化性質(zhì)(pH、有機(jī)碳、機(jī)械組成等)發(fā)生變化。而土壤性狀與生物結(jié)皮類型密切相關(guān)。生物結(jié)皮能夠固定碳、氮并活化磷,使表層碳、氮、磷含量均顯著增加。本研究中,蘚類植物作為生物結(jié)皮演替的高級階段,相較于藻結(jié)皮,蘚結(jié)皮能夠顯著增加A、B層有機(jī)碳和全氮、全磷等養(yǎng)分含量(表2),并提高表層土壤細(xì)菌α多樣性(表5)。由于生物結(jié)皮A層具有滯蓄養(yǎng)分和減弱滲透的作用,使B層養(yǎng)分含量相對較低,但重金屬污染也更易富集在A層,避免了B層細(xì)菌群落受到更強(qiáng)的重金屬污染脅迫,因而表現(xiàn)為B層細(xì)菌群落多樣性和相對豐度均高于A層。

土壤理化性質(zhì)(如土壤質(zhì)地、有機(jī)質(zhì)和pH等)是決定重金屬生物有效性的主要影響因子[35]。其中,pH是決定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化的最顯著的土壤因子。本研究中,α多樣性指標(biāo)均與pH呈正相關(guān),而部分優(yōu)勢細(xì)菌門如擬桿菌門和變形菌門相對豐度則與之極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),可能是由于pH激發(fā)了重金屬的生物毒性,造成部分細(xì)菌門相對豐度減少。放線菌門是土壤團(tuán)聚體的重要組成部分,與團(tuán)聚體的穩(wěn)定性關(guān)系密切。本研究中,放線菌門相對豐度與黏粒、粉粒呈正相關(guān)關(guān)系,而與砂粒呈負(fù)相關(guān)?？赡芘c生物結(jié)皮層具有明顯富集細(xì)顆粒物的能力有關(guān)[36]。由于工礦區(qū)生物結(jié)皮富集大量富含養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)的大氣降塵,可為細(xì)菌群落提供更多的可用生態(tài)位,表現(xiàn)為試驗(yàn)區(qū)生物結(jié)皮具有更高的α多樣性。

3.2 生物結(jié)皮細(xì)菌群落對重金屬污染的響應(yīng)

測序結(jié)果表明變形菌門、放線菌門、酸桿菌門為2個(gè)樣地內(nèi)生物結(jié)皮A、B層門水平上的優(yōu)勢細(xì)菌群落,這與荒漠區(qū)的研究結(jié)果相類似[37-38]。封育區(qū)和工礦區(qū)2類生物結(jié)皮的門水平優(yōu)勢菌群相似,但相對豐度存在差異,可能是重金屬元素的直接干擾,亦或是重金屬的入侵改變了生物結(jié)皮的物種組成和土壤性狀。其中,放線菌門相對豐度最高且工礦區(qū)高于封育區(qū),主要是由于放線菌門對貧瘠環(huán)境具有較高的耐受性和適應(yīng)性[39],此外,放線菌門對金屬毒性比較敏感,對重Cd污染耐受性強(qiáng)。研究區(qū)Cd嚴(yán)重超標(biāo),刺激了放線菌門的金屬抗性[40]。其次為變形菌門,作為一種可在高污染水平環(huán)境中存活的重金屬耐性細(xì)菌,其多樣化的能量利用途徑,有利于變形菌門在礦區(qū)廣泛存在[41]。酸桿菌門適生于碳源貧瘠的寡營養(yǎng)生存環(huán)境,對高重金屬濃度有強(qiáng)大的抵抗力并作為礦區(qū)的優(yōu)勢細(xì)菌門存在[42]。研究表明土壤的非生物性質(zhì)是土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成的主要調(diào)節(jié)因子,如pH、電導(dǎo)率和有機(jī)碳等會影響土壤重金屬的賦存狀態(tài)和生物學(xué)毒性,從而使細(xì)菌群落發(fā)生變化[43]。而本研究中,2種生境中的2類生物結(jié)皮的A、B層土壤理化因子存在顯著差異,受pH、電導(dǎo)率和有機(jī)碳的影響表現(xiàn)為重金屬污染程度更高的A層細(xì)菌群落α多樣性均低于B層,工礦區(qū)α多樣性高于封育區(qū)。但分屬于不同生境的同類結(jié)皮各層次細(xì)菌群落相似,這與高天鵬等[35]的研究結(jié)論相似。

細(xì)菌群落對重金屬污染的響應(yīng)因重金屬種類而異。本研究中,工礦區(qū)的重金屬污染屬復(fù)合污染。而細(xì)菌對重金屬污染的耐受性會因土壤環(huán)境因子、重金屬類別、賦存狀態(tài)等而異。優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度變化對各類重金屬元素污染及綜合污染的響應(yīng)既有共性,也有不同。具體表現(xiàn)為綠彎菌門、厚壁菌門、裝甲菌門、迷蹤菌門是受重金屬影響較大的微生物群落,與本研究涉及的重金屬相關(guān)性較為顯著,而其他優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度與各類重金屬含量并無一致性相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)性大多不顯著。猜測這可能取決于有效態(tài)重金屬的濃度和土壤本身的理化性質(zhì)[44]。除重金屬外,理化性質(zhì)與優(yōu)勢細(xì)菌群落之間也存在相關(guān)性。機(jī)械組成對酸桿菌門、厚壁菌門、迷蹤菌門影響較大,有機(jī)碳和養(yǎng)分顯著影響裝甲菌群落。冗余分析結(jié)果表明,重金屬As、Pb、土壤黏粒含量和pH是影響當(dāng)?shù)丶?xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要土壤理化因子(P<0.05)。說明生物結(jié)皮在改善土壤理化性質(zhì)的同時(shí),會通過影響一些重金屬的賦存狀態(tài)和生物學(xué)毒性而對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生影響。

生物結(jié)皮各層次土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性可以反映其受重金屬污染的程度,鑒于細(xì)菌群落種類眾多且部分細(xì)菌對重金屬具有耐受性和特異性,其相對豐度和多樣性指標(biāo)會因重金屬污染程度發(fā)生相應(yīng)變化。細(xì)菌群落多樣性和豐度的變化既體現(xiàn)了細(xì)菌群落對重金屬污染的適應(yīng)與響應(yīng),也反映了土壤細(xì)菌群落在對重金屬污染物的生物轉(zhuǎn)化中隨著污染物的濃度和種類發(fā)生的適應(yīng)性進(jìn)化。生物結(jié)皮是富集大氣降塵重金屬、修復(fù)污染土壤的潛在理想材料,而利用微生物活細(xì)胞吸附重金屬是未來生物吸附領(lǐng)域的研究方向[45],因地制宜培育生物結(jié)皮中具有重金屬抗性的細(xì)菌群落則可為工礦區(qū)的重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)提供天然原材料。

4 結(jié)論

本研究涉及的兩類生物結(jié)皮分處于不同生境,大氣降塵來源、組成的差異使生物結(jié)皮土壤理化性質(zhì)差異顯著。生物結(jié)皮對源自大氣降塵的重金屬元素均具有顯著的表層富集作用。由于不同類型生物結(jié)皮富集重金屬污染的能力不同,不同生物結(jié)皮各層次土壤重金屬污染程度存在顯著差異。變形菌門、放線菌門、酸桿菌門是研究區(qū)域的優(yōu)勢門類細(xì)菌,但受土壤理化性質(zhì)和重金屬污染程度的影響,不同生境優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度存在差異。相關(guān)性分析和冗余分析結(jié)果表明,重金屬As、Pb、土壤黏粒含量和pH是影響當(dāng)?shù)丶?xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動因子。