家禽基因編輯相關技術研究進展及應用

冉明霞，鄭基壇,，劉興廷，謝 龍，左二偉*，陸陽清*

（1.廣西大學動物科學技術學院動物繁殖研究所，廣西南寧 530004；2.中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518000）

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，家禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)是我國農(nóng)業(yè)的重要組成部分，改革開放以來，尤其是21世紀以來，我國家禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，快速規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化。截至2022 年，我國禽肉產(chǎn)量達到2443 萬t，位居世界第二，成為我國僅次于豬肉的第二大消費肉類，全國禽蛋產(chǎn)量達到3456 萬t，位居世界第一[1]。家禽產(chǎn)業(yè)為我國經(jīng)濟的高速增長做出了卓越的貢獻，在滿足廣大城鄉(xiāng)居民生活需求、壯大鄉(xiāng)村經(jīng)濟實力、優(yōu)化農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、促進農(nóng)民增收等方面均發(fā)揮了重要作用[2]。但在過去幾十年的發(fā)展中，由于長期以來局限于追求畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量增長，缺乏對畜禽種質(zhì)資源重要性認識，普遍存在 “重引進、輕培育，重雜交、輕保護” 現(xiàn)象，育種技術研究和應用相對落后，自主培育的產(chǎn)業(yè)主導品種少，生產(chǎn)效率及單產(chǎn)水平較低，與國際先進水平差距較大。以蛋雞為例，我國蛋雞產(chǎn)蛋期的產(chǎn)蛋量為15～17 kg，料蛋比為2.3～2.7∶1，死淘率為10%～20%。而美國、荷蘭等養(yǎng)禽發(fā)達國家這3 個指標分別為18～20kg、2～2.3∶1、3%～6%[3-5]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）估計，2050 年世界人口將達到97 億，對動物性食品的需求將增長70%，世界農(nóng)作物和動物總產(chǎn)量需要增加60%才能滿足需求[6,7]。我國人口也將持續(xù)增長，預計在2030 年達到16.5 億，以我國目前的產(chǎn)肉量來看，肉類缺口將達7900 萬t[8]。因此，為了滿足日益增長的需求，我國未來的家禽產(chǎn)業(yè)急需進一步提升育種技術水平，在加強優(yōu)質(zhì)高生產(chǎn)效益品種培育的基礎上實現(xiàn)向高質(zhì)量發(fā)展轉(zhuǎn)型已成為我國家禽產(chǎn)業(yè)必然的發(fā)展趨勢。

傳統(tǒng)育種技術是基于遺傳重組和表型選擇的雜交選育過程，多年來為家禽產(chǎn)業(yè)培育出了大批優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種，推動了家禽產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展。但隨著家禽生產(chǎn)水平的提高，僅依靠傳統(tǒng)育種技術，繼續(xù)提高家禽生產(chǎn)性能的成效越來越小，傳統(tǒng)育種中優(yōu)良基因與不良基因的連鎖遺傳、表型測定結(jié)果易受環(huán)境影響、育種效率低、育種周期長等問題開始掣肘育種進程[1]。隨著生命科學的快速發(fā)展，以生物育種技術為核心，交叉融合了遺傳學、分子生物學和計算機科學等多學科領域的現(xiàn)代育種體系誕生并得到廣泛應用，大大提高了育種效率、加快了育種進程?；蚓庉嫾夹g是現(xiàn)有生物育種技術中發(fā)展最快、針對單一性狀改良效率最高的育種技術，是突破傳統(tǒng)育種技術面臨的不良基因連鎖等瓶頸問題的關鍵[8]?；蚓庉嫾夹g不斷的改良發(fā)展和應用正悄然推動著農(nóng)業(yè)領域的顛覆性變革。

1 基因編輯技術的發(fā)展現(xiàn)狀

1.1 基因組修飾系統(tǒng)

1.1.1 ZFN 基因編輯系統(tǒng)

鋅指核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）技術由2 個關鍵部分組成：鋅指蛋白和FokI 核酸內(nèi)切酶。通常鋅指蛋白包含3～6 個鋅指結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域都與DNA 的特定核苷酸序列結(jié)合。這種高度特異性的結(jié)合使鋅指蛋白能精確識別和結(jié)合到基因組的目標區(qū)域。FokI 核酸內(nèi)切酶必須以二聚體的形式出現(xiàn)才能具備核酸酶活性，因此需要成對的鋅指蛋白將其引導到靶位點，從而實現(xiàn)其剪切功能[9,10]。通過對鋅指蛋白進行設計和工程化，研究人員能設計合成識別和結(jié)合特定的DNA 序列的鋅指蛋白，為精確編輯基因組提供了可能性。

1.1.2 TALEN 基因編輯系統(tǒng)

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）類 似于ZFN，是一種可以實現(xiàn)DNA 序列特異性切割和編輯的核酸酶[11]。TALE 蛋白來自植物病原菌，具有特殊的DNA 識別能力。每個TALEN 蛋白包含一系列高度重復的結(jié)構(gòu)單元，這些單元被稱為“重復”。每個重復都能識別和結(jié)合到DNA 的一個堿基對。TALEN 蛋白的特異性來自于這些重復單元，其序列和排列可以根據(jù)所需編輯的DNA序列進行定制。通過精心設計TALEN 蛋白的重復序列，可以實現(xiàn)對目標DNA 的高度特異性識別。與ZFN 類似，TALEN 也需要結(jié)合FokI 核酸內(nèi)切酶，對靶位點進行切割，從而實現(xiàn)基因編輯的目標。

1.1.3 CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）是規(guī)律間隔成簇短回文重復序列的縮寫，最早于1987 年由日本科學家在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)。當時科學家們雖然注意到存在短串聯(lián)重復的DNA 序列，但并未揭示其功能[12]。直到2002 年，科學家正式將這些結(jié)構(gòu)命名為CRISPR，并研究揭示了一些與CRISPR 結(jié)合相關的蛋白，命名為Cas（CRISPRassociated protein），它們與CRISPR 一起構(gòu)成了CRISPR/Cas 系統(tǒng)[13,14]。這一系統(tǒng)具有識別外源DNA 并將其整合到CRISPR 序列中間，從而構(gòu)建對外源DNA 的適應性免疫系統(tǒng)的能力。當外源DNA 再次進入細菌時，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以識別并對其進行抑制?；谶@一機制，研究人員開發(fā)了能夠針對特定DNA 序列的基因編輯系統(tǒng)。

（1）核酸酶

2012 年，Doudna 和Charpentier 團隊使用源自化膿桿菌的CRISPR/Cas 系統(tǒng)成功實現(xiàn)了在大腸桿菌中對靶基因的編輯[15]。這一系統(tǒng)的核心是Cas9 蛋白，它能在CRISPR RNA（crRNA）和反式激活的CRISPR RNA（trans-acting CRISPR RNA，tracRNA）的協(xié)同作用下，對特定DNA 進行切割，造成靶向DNA 雙鏈斷裂（Double Strand Break，DSB）。一旦CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在靶位點引發(fā)DSB，細胞通常會通過2 種自我修復機制來應對：非同源末端連接和同源重組。非同源末端連接可以在靶基因的編碼區(qū)域進行編輯，它通過在DNA 雙鏈斷裂處插入或刪除堿基對來導致移碼突變，從而破壞了基因的正常功能。此外，還可以在附近的多個位置設計打靶位點，以增加刪除特定DNA 序列的可能性，以達到特定的基因修飾目的。另一方面，可以通過提供模板DNA，利用同源重組修復方式來實現(xiàn)特定的基因突變，但這種方法的整體效率相對較低。

Cas9 蛋白主要由一些關鍵結(jié)構(gòu)域組成，包括Rec 結(jié)構(gòu)域用于識別，RuvC 和HNH 結(jié)構(gòu)域用于切割、以及原間隔相鄰基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）相互作用結(jié)構(gòu)（PAM Interacting Domain，PI）域用于與PAM 結(jié)合等[16]。在選擇靶序列時，需要確保在打靶位置的3' 端存在PAM 結(jié)構(gòu)，以區(qū)分自身與非自身的DNA。在Sp-Cas9 系統(tǒng)中，PAM 的典型序列為 “NGG”。cr-RNA 由5' 端引導序列和3' 端重復序列構(gòu)成，其中引導序列能夠靶向結(jié)合DNA，類似于CRISPR中的間隔序列。重復序列能與tracRNA 形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而Cas9 蛋白主要與莖環(huán)結(jié)構(gòu)相結(jié)合。因此，在crRNA 引導序列的指導下，Cas9蛋白能識別靶標并對其進行切割。但crRNA 與tracRNA 在細菌內(nèi)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的過程相對繁瑣。因此，研究人員通過將這兩種RNA 直接連接起來，形成一個二級結(jié)構(gòu)相似的單嵌合體RNA（single chimera RNA，sgRNA），簡化了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。2013 年，張鋒等[17]也研發(fā)了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在哺乳動物細胞內(nèi)進行高效的基因編輯。與Doudna 等[15]系統(tǒng)相比，這一系統(tǒng)的Cas9 蛋白具有額外的核定位信號，使其能夠進入細胞核進行編輯。此外，還延長了sgRNA 中的tracRNA 長度，增強了與Cas9蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性，從而提高了基因編輯效率。

（2）單堿基編輯系統(tǒng)

2016 年，David 等[18]開發(fā)了胞嘧啶單堿基編輯器（Cytosine Base Editor，CBE），其原理是先通過對Cas9 蛋白的RuvC 結(jié)構(gòu)域引入D10A 突變，以及對HNH 結(jié)構(gòu)域引入H840A 突變，將Cas9 蛋白改造成了無切割活性的Cas9（dead Cas9，dCas9），使其僅具備結(jié)合DNA 的能力，而不再具有切割活性；然后，在dCas9 蛋白的氨基端添加了來自大鼠胞嘧啶脫氨酶rApobec1，該脫氨酶的功能是將單鏈DNA 中的胞嘧啶核苷酸C 脫氨基化，轉(zhuǎn)化為尿嘧啶核苷酸U。這一系統(tǒng)被稱為BE1，其工作原理是在sgRNA 的引導下，dCas9 將rApobec1 引導到靶位點，使目標鏈被sgRNA 捕獲，而非目標鏈則暴露出來。此時，rApobec1 能夠結(jié)合非目標鏈，對C 進行脫氨化，將其轉(zhuǎn)化為U。在隨后的DNA 復制過程中，U將與腺嘌呤核苷酸A 互補配對，最終達到C 到T的突變。

早期研發(fā)的BE1 的編輯效率非常低，隨后的研究通過在BE1 的羧基端添加了尿嘧啶糖基酶抑制蛋白（Uracil Glycosylase Inhibitor Protein，UGI），抑制了尿嘧啶糖基酶的活性，降低尿嘧啶脫氨酶將DNA 中的U 去除修復為T 的能力，從而提高C 到T 的編輯效率。為了進一步提高編輯效率，將編輯器BE2 的dCas9 改為nCas9（nick-Cas9，nCas9），保留了Cas9 的切割靶向鏈的活性，得到BE3。BE3 在rApobec1 將非靶向鏈上的C 轉(zhuǎn)化為U 的同時，使靶向鏈產(chǎn)生切口，促使靶向鏈以非靶向鏈為模板進行DNA 修復，進一步提高了編輯效率。盡管BE3 的編輯效率相對較高，但仍然存在一些局限性。因此，研究者通過使用人類胞嘧啶脫氨酶代替rApobec1，進一步提高了編輯效率[19]。此外，脫氨酶本身可能會隨機結(jié)合到非靶位置的單鏈DNA 或RNA 上，導致非sgRNA 依賴性的隨機脫靶[20]。為了降低這一風險，研究者采取了多種策略，如降低胞嘧啶脫氨酶對單鏈DNA 或RNA 的結(jié)合能力[21]，或者在編輯器上添加胞嘧啶脫氨酶抑制蛋白來降低脫靶[22]，但這些策略在減少脫靶的同時也都在一定程度上降低了編輯效率或限制了可用位點。

2017 年，David 團隊[23]研發(fā)了腺嘌呤單堿基編輯器（Adenine Base Editor，ABE）。ABE 由nCas9 的與來自大腸桿菌的腺嘌呤脫氨酶TadA融合而成。通常，天然的TadA 需要兩個TadA分子形成二聚體，以對tRNA 的腺嘌呤核苷酸A進行脫氨化，將其轉(zhuǎn)化為次磺嘌呤核苷酸I。通過定向進化，研究人員獲得了由野生型TadA、突變型TadA 和nCas9 組成的ABE 7.10 系統(tǒng)。在ABE 系統(tǒng)中，腺嘌呤核苷酸A 被轉(zhuǎn)化為I，然后I 與C 互補配對，最終實現(xiàn)A 到G 的突變。盡管ABE 7.10 系統(tǒng)具有高度的編輯效率，但仍然存在RNA 脫靶風險[24]。為了降低這種風險，研究者采取了多種策略，包括降低其對RNA 的結(jié)合能力或只使用單個突變型TadA[25]等，獲得了效率更高的ABE8e 系統(tǒng)[25]。另外，將CBE 的UGI 改為尿嘧啶脫氨酶可以使C 轉(zhuǎn)化為G，從而形成CGBE編輯器[26,27]。通過在ABE 中引入MPG，可以將A轉(zhuǎn)化為Y（C 或T），形成AYBE 系統(tǒng)[28]。還有研究者將TadA 添加到CBE 上，實現(xiàn)AC 到GT 的同時編輯，被稱為ACBE[29]。

（3）先導基因編輯系統(tǒng)

2019 年，David 團隊[30]研發(fā)了引導編輯系統(tǒng)（Prime Editing，PE），它在不引發(fā)DSB 的情況下實現(xiàn)了對基因組的任意堿基編輯以及小片段插入或刪除，極大提高了基因編輯工具的可用性。PE系統(tǒng)主要由兩部分組成：一是H840AnCas9 蛋白與逆轉(zhuǎn)錄酶的融合蛋白，二是pegRNA。pegRNA不僅包含通常sgRNA 的引導序列和支架序列，還在其3' 端添加了逆轉(zhuǎn)錄模板序列（RTT）和引導結(jié)合序列（PBS）。PE 系統(tǒng)的工作原理是在切割非靶向鏈后，PBS 通過堿基互補配對結(jié)合到非靶向鏈的3'末端的互補部分，提供了羥基。在RTT的模板作用下，逆轉(zhuǎn)錄酶合成所需的DNA 序列，最終在DNA 修復或復制過程中保留了所編輯的結(jié)果，從而實現(xiàn)了基因編輯的目標。后續(xù)研究者通過在靶位點下游引入靶向鏈切口，提高了PE系統(tǒng)的編輯效率。此外，還通過改變pegRNA 的支架結(jié)構(gòu)、增加與DNA 錯配修復Cas9 蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性、在PBS 的3'端增加保護序列等方式來提高編輯效率。通過引入DNA 錯配修復抑制蛋白，也能提高PE 系統(tǒng)的編輯效率[31,32]。

1.2 家禽基因編輯細胞工具

1.2.1 胚胎干細胞

胚胎干細胞（Embryonal Stem Cell，ESC）來源于早期胚胎未分化的干細胞，最早從小鼠的胚泡中分離出[33,34]，隨后Pain 等[35]成功從雞胚中分離出了ESC 細胞。ESC 具有多能性，被移植到囊胚后能重新分化成所有胚胎組織細胞，包括生殖系細胞。因此，ESC 分離培養(yǎng)為雞的基因組操作和轉(zhuǎn)基因雞的制備提供了重要的細胞工具。Zhu等[36]通過電穿孔法將人單克隆抗體（mAB）轉(zhuǎn)進雞ESC 中，然后通過ESC 胚胎移植形成管狀腺細胞表達mAB 嵌合體雞。但從雞早期胚胎中分離的ES 細胞數(shù)量少，體外培養(yǎng)體系與哺乳動物差異較大，沒有完善的雞ESC 體外培養(yǎng)體系，且移植到受體胚胎后不能定向分化為生殖細胞，種系傳遞效率低，限制了ESC 在家禽基因編輯中的應用。

1.2.2 原始生殖細胞

原始生殖細胞（Primordial Germ Cell，PGC）是早期胚胎中精子和卵子的前體細胞，能通過配子發(fā)生將遺傳物質(zhì)傳遞到下一代[37]，是理想的基因編輯細胞工具。在小鼠等哺乳動物中，PGC 從外胚層沿著后腸上皮細胞遷移到性腺附近，并通過腸系膜出口進入性腺中[38]。家禽存在獨特的PGC 發(fā)育和遷移模式，PGC 最早出現(xiàn)在Eyal-Gi ladi 和Kochav（EGK）X 期胚胎的胚盤中，從胚盤透明區(qū)域沿著原條，隨著胚胎的形態(tài)發(fā)生運動被動遷移到生殖新月區(qū)；隨后，這些PGC 遷移穿過胚胎外血管中進入血液循環(huán)系統(tǒng)，隨著血液流動遷移出血管并定殖到性腺中[39-41]。根據(jù)雞PGC的遷移路徑和胚胎發(fā)育模式，結(jié)合胚胎操作，能從EGK X 期胚胎的胚盤、Hamburger Hamilton（HH）11 階段胚胎的血液中以及HH 15～32 階段胚胎的性腺中分離獲得PGC[42]。Van de Lavoir 等[44]首次成功建立了雞PGC 的體外長期培養(yǎng)體系，從胚胎血液中獲得的PGC 能在添加了堿性成纖維細胞生長因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）、干細胞因子（Stem Cell Factor，SCF）的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)超過35d，在移植到受體胚胎血液系統(tǒng)后，仍然能遷移到性腺中，并分化成功能性配子。Macdonald 等[45]再次證實了這一培養(yǎng)系統(tǒng)對PGC 的有效性。

PGC 分離和體外長期培養(yǎng)體系的建立是基因編輯雞研究發(fā)展的關鍵。Schusser 等[46]基于PGC體外長期培養(yǎng)系統(tǒng)，采用同源重組技術編輯PGC免疫球蛋白的輕鏈或重鏈后，將PGC 移植到HH 13～15 的胚胎血液系統(tǒng)中產(chǎn)生嵌合體，這是第一只通過PGC 體外長期培養(yǎng)和同源重組敲除制備的非哺乳動物的脊椎動物。Whyte 團隊[47]對雞PGC培養(yǎng)進行了進一步優(yōu)化，開發(fā)了雞PGC 無血清和飼養(yǎng)層的組成明確的培養(yǎng)體系，并確定了鳥類生殖細胞自我更新所需的信號通路。隨后，Ballantyne 等[48]利用PGC 體外培養(yǎng)和CRISPR/Cas9 介導的同源性定向修復將iCaspase9基因插入到體外培養(yǎng)的雞PGC 中DAZL 基因最后一個編碼外顯子的3' 端，再通過基因編輯成功的PGC 移植入受體胚胎，構(gòu)建出了誘導不育的宿主雞。將供體基因組編輯的PGC 移植到不育雞中，產(chǎn)生只攜帶外源細胞的嵌合體雞，將宿主雞產(chǎn)生供體來源后代的比例提升到100%，進一步提升了基因編輯效率，促進了基因編輯技術在雞中的應用。陸陽清課題組[49,50]進一步優(yōu)化了雞PGC 的體外培養(yǎng)體系，將PGC 建系時間縮短至16d，并利用此培養(yǎng)體系和CRISP/Cas9 系統(tǒng)成功構(gòu)建了生殖細胞發(fā)紅色熒光的DAZL-mCherry 基因編輯雞，為PGC 的增殖、分化、遷移等研究提供了重要的試驗模型。目前，PGC 是基因編輯雞制備主要采用的細胞工具。

1.2.3 精原細胞

精原干細胞（Spermatogonial Stem Cell，SSC）具有自我更新或分化的能力，能分化成雄性生殖細胞系中所有的生殖細胞類型[51]，通過受精將遺傳信息傳遞給下一代，也是基因編輯理想的細胞工具之一。1994 年，Brinster 和Zimmermann 從小鼠睪丸中分離SSC 注射到不育小鼠睪丸的曲精細管中，發(fā)現(xiàn)受體睪丸的供精細胞精子發(fā)生表現(xiàn)出正常的形態(tài)特征，并產(chǎn)生成熟精子，首次建立了SSC 的移植體系[52]。此后，SSC 移植在大鼠[53]、狗[54]、豬[55]和奶牛[56]上都成功實現(xiàn)。在禽類中，Lee 等[57]在2006 年將成年或幼年的公雞睪丸中分離獲得的生殖細胞移植到成年白來航公雞的睪丸中，形成了異種精原細胞嵌合體的公雞，首次證明了雞精原干細胞睪丸移植的可行性。Jung 等[58]將成年公雞的SSC 移植到E&GxX期和HH 14 期的雞胚胎中，發(fā)現(xiàn)移植的SSCs 能遷移到受體雞胚的性腺中。同時，Roe 等[40]將從鵪鶉睪丸中分離出的SSC 移植到雞HH 14～17 胚胎的血液系統(tǒng)中，注射4h 后在受體雞胚的性腺中觀察到了供體來源的細胞。

但這些嘗試都是基于原代SSC 的分離和移植，而SSC 在基因編輯中廣泛應用仍需要優(yōu)化SSC 的分離和體外培養(yǎng)體系，以獲得足夠數(shù)量細胞用于體外操作。在體內(nèi)，SSC 生長很大程度上受周圍支持細胞、間質(zhì)細胞和類肌細胞構(gòu)成細胞構(gòu)成的生態(tài)環(huán)境的調(diào)控。支持細胞和類肌細胞分泌神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子（Glial Cell Derived Neurotrophic Factor，GDNF）和間質(zhì)細胞產(chǎn)生集落刺激因子1（Colony Stimulating Factor 1，CSF1）都有促進SSC 增殖的作用[59-61]。通過體外重建微環(huán)境進行SSC 體外長期培養(yǎng)較為困難，有幾個實驗室嘗試了小鼠SSC 的體外培養(yǎng)，Kubota等[62]通過添加GDNF 使體外培養(yǎng)的幼鼠睪丸SSC持續(xù)增殖超過6 個月，且在移植到不育小鼠睪丸后重建了小鼠睪丸內(nèi)長期的精子發(fā)生過程，并恢復了不孕受體小鼠的生育能力。但禽類SSCs 仍未建立完善的體外長期培養(yǎng)體系，Rasouli-Gharehsaghal等[63]將未性成熟公雞的精原干細胞分離并培養(yǎng)7d，將攜帶報告基因GFP 的質(zhì)粒載體pDB2 轉(zhuǎn)染到SSC 中，并將轉(zhuǎn)染的SSC 移植到不育公雞的左側(cè)睪丸中。因此，雞SSC 的體外長期培養(yǎng)體系仍需進一步優(yōu)化來推動SSC 在基因編輯廣泛應用。

2 基因編輯技術在家禽中的應用

2.1 提高產(chǎn)肉量和飼料利用率

在促進肌肉生長的遺傳因素中，肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN），也被稱為生長分化因子8，是促進肌肉生長最突出的基因之一，可以作為促進肌肉生長的標記基因，其主要在骨骼肌中表達，通過與激活素受體2B 型（Activin A Receptor Type 2B，ACVR2B）結(jié)合，激活1 型激活素接收器絲氨酸激酶ALK4 和ALK5，使Smad2 和3 被磷酸化并轉(zhuǎn)移到細胞核，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄的變化，最終抑制肌肉分化和生長[38,64]。Kim 等[65]通過D10A-Cas9 DNA 切口酶系統(tǒng)敲除雞原始生殖細胞內(nèi)的MSTN 基因，并將其移植到受體雞胚中產(chǎn)生MSTN 敲除的基因編輯雞。與野生型雞相比，MSTN 敲除雞胸部和腿部骨骼肌更大，但肌肉生長抑制素缺失引起的骨骼肌肥大和增生程度因性別和肌肉類型而異。此外，MSTN敲除雞的腹部脂肪沉積也顯著低于野生型雞。Lee 等[66]通過將含有CRISPR/Cas9 的重組腺病毒注射到鵪鶉胚細胞中，產(chǎn)生了MSTN 基因前肽區(qū)第42 位半胱氨酸缺失的基因編輯個體，與野生鵪鶉相比，MSTN 突變鵪鶉的脂肪墊重量和心臟重量分別以年齡和性別依賴的方式降低。這些研究表明，基因編輯技術可以成功創(chuàng)制出肌肉生長更符合需求的家禽新品種。

脂肪沉積水平是衡量雞飼料利用率的重要指標，動物身體的能量穩(wěn)態(tài)是由脂質(zhì)儲存和動員的精確調(diào)節(jié)平衡決定的，減少身體脂肪沉積能促使吸收的能量更多地用于肌肉的生成。脂質(zhì)的動員主要是脂肪水解酶介導的甘油三酯（Triglyceride，TG）降解釋放未酯化的脂肪酸。Zimmermann 等[67]研究發(fā)現(xiàn)了第二種脂肪水解酶，脂肪甘油三酯脂肪 酶（Adipose Triacylglycerol Lipase，ATGL），在人和小鼠的脂肪組織中高表達，對TG 具有高度的底物特異性，參與催化TG 水解的初始步驟，是TG 水解的限速酶。G(0)/G(1)開關基因2（G0/G1 Switch Gene 2，G0S2）編碼的蛋白質(zhì)是ATGL 的選擇性調(diào)節(jié)因子，在脂肪組織和分化的脂肪細胞中高表達，通過G0S2 的疏水結(jié)構(gòu)域和ATGL 的patatin 樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合與ATGL 特異性相互作用，抑制ATGL 的三酰甘油水解酶活性[68]。Park 等[69]通過結(jié)合CRISPR-Cas9 系統(tǒng)和PGC 介導的種系傳播制備G0S2 基因敲除雞，發(fā)現(xiàn)G0S2敲除的雞在其他經(jīng)濟性狀沒有受到明顯影響的情況下表現(xiàn)出腹部脂肪沉積的顯著減少。此外，與正常飲食條件下的野生型雞相比，G0S2 敲除雞的血液和腹部脂肪中的脂肪酸組成發(fā)生了變化：游離脂肪酸水平降低，總膽固醇含量增加。這2個基因編輯品種的創(chuàng)制為提高禽肉產(chǎn)量和飼料利用率提供了新的育種素材。

2.2 抗病育種

病毒性疾病給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，降低了家禽生產(chǎn)性能，基因編輯技術的興起為提高家禽的抗病能力提供了新的解決方案。病毒與宿主細胞受體高度特異性相結(jié)合，才能進入靶細胞從而發(fā)揮致病作用，敲除受體可以特異性阻止病毒感染[70]。此外，病毒受體和病毒復制相關的基因，以及細胞對感染的免疫應答相關的基因都是基因編輯的重點對象[71]。禽白細胞病病毒（Avian Leukosis Virus，ALV）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科α 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，是一組誘導鳥類腫瘤的逆轉(zhuǎn)錄病毒，ALV 亞群J（ALV-J）自1988 年在英國首次暴發(fā)以來就一直是家禽產(chǎn)業(yè)關注的一個重要問題。2018 年中國暴發(fā)了一次大規(guī)模的ALV-J疫情，疫情雞群15～20 周齡表現(xiàn)出抑郁、癱瘓和體重減輕，某些雞群的死亡率達到15%，給中國家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[72]。雞Na+/H+交換器類型1（Chicken Na+/H+Exchange Type 1，chNHE1）是AVL-J 的關鍵受體，其顯著的糖基化細胞外環(huán)1 是病毒進入所必需的[73]。而在ALV-J 易感物種（家雞、叢林雞、火雞）和抗性物種（大多數(shù)鳥類）中的氨基酸序列比較分析結(jié)果表明，chNHE1 色氨酸殘基38（W38）是受體功能的關鍵殘 基[74]。Koslová 等[75]通 過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了W38 敲除的PGCs，并成功制備了W38 敲除雞。體外和體內(nèi)檢測了對ALV-J 的耐藥性的體內(nèi)和體外檢測結(jié)果顯示，W38 敲除純合子雞表現(xiàn)出對ALV-J 的耐藥性，而W38 敲除雜合子和野生型雞則對ALV-J 敏感。此外，W38的缺失沒有顯示出任何明顯的副作用。這是第一只通過CRISPR/Cas9 和PGCs 系統(tǒng)介導的對某一特定病原體具有抗性的精確基因編輯雞，是基因編輯技術在抗病雞品種培育中取得的一次重大進展。

2.3 早期胚胎的性別鑒定

在蛋雞養(yǎng)殖行業(yè)中，公雞的需求量少，很多蛋雞養(yǎng)殖場會在雛雞孵化后立即篩選出雄性并將其安樂死，以降低飼養(yǎng)成本。除了傳統(tǒng)的1 日齡雛雞撲殺外，卵內(nèi)性別鑒定能進一步降低孵化和人工性別鑒定的成本，并為雛雞撲殺的倫理問題提供了解決方案。在這方面Lee 等[76]通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將綠色熒光蛋白GFP 基因插入到雞PGC 的Z 染色體上，然后通過PGC 胚胎移植技術構(gòu)建了Z 染色體表達GFP 的基因編輯雞，這些將表達GFP 的ZW 雌性與野生型ZZ 雄進行交配，產(chǎn)生的雄性后代均表達GFP 綠色熒光，可通過熒光檢測進行早期胚胎淘汰。兩性和mab-3相關轉(zhuǎn)錄因子1（Double Sex-mab3-related Transcription Factor1，DMRT1）是雞睪丸的決定 基因，Lee 等[77]嘗試通過CRISP 介導的PGC 基因組修飾來生產(chǎn)DMRT1 敲除的基因編輯雞來達到早期胚胎性別控制的目的。但由于激素分泌等原因，DMRT1 敲除雞并未實現(xiàn)性別反轉(zhuǎn)，但為禽類性別控制研究提供了重要線索。

2.4 生物反應器

蛋白質(zhì)類藥物是目前研發(fā)較多的一種藥物之一，其生產(chǎn)通常是基于細菌和哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。然而，細菌細胞培養(yǎng)系統(tǒng)對重組蛋白的糖基化、翻譯后修飾有限；從哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白成本昂貴。因此，人們開始嘗試通過基因編輯或轉(zhuǎn)基因動物制備生產(chǎn)蛋白類藥物。轉(zhuǎn)基因禽類生物反應器生產(chǎn)重組蛋白有幾個顯著的優(yōu)勢：家禽的飼養(yǎng)成本低、性成熟時間短、蛋白質(zhì)產(chǎn)量高、卵清蛋白成分簡單易于重組蛋白的分離純化，且能進行類似于人類糖基化的蛋白修飾[78]。因此，通過基因編輯技術精確的將重組蛋白基因整合到卵清蛋白的可編輯位點，制備基因編輯雞生產(chǎn)重組蛋白，也是未來基因編輯技術在禽類的主要應用方向之一。Oishi 等[79]通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將人干擾素-β（Human Interferon-β，hIFN-β）精確整合到雞卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）基因座中，然后將基因編輯的PGC 移植制備獲得轉(zhuǎn)基因雞，所有hIFN-β 敲入的雌性后代蛋清中都產(chǎn)生了豐富hIFN-γ 蛋白（～3.5mg/mL）。盡管第一代的雌性后代是不育的，但其雄性后代是可育的，產(chǎn)生第二代母雞hIFN-β的產(chǎn)量與第一代相當。這些結(jié)果表明，通過CRISPR/Cas9 和PGC 移植基因編輯技術在雞卵清蛋白基因座插入轉(zhuǎn)基因，可以實現(xiàn)在蛋清中的外源蛋白的豐富和穩(wěn)定表達。

3 展望

20 世紀90 年代初，DNA 標記技術的開發(fā)及在畜牧業(yè)中的應用，使世界畜禽育種技術跨入了分子育種時代，傳統(tǒng)的遺傳學/ 基因組學和選擇性育種介導的分子育種技術對牲畜生產(chǎn)和健康產(chǎn)生了變革性影響，但傳統(tǒng)的選擇育種依賴于自然產(chǎn)生的變異，遺傳進展仍然較為緩慢。2005 年以后，基因編輯技術逐漸興起，為畜禽育種提供了新的理論基礎和策略，分子設計育種應運而生。此后，隨著CRISPR/Cas9 產(chǎn)生與應用，以及雞PGC 體外長期培養(yǎng)體系的建立，家禽基因編輯技術在過去20 年中得到了飛速的發(fā)展，并應用到家禽育種中，成功創(chuàng)制出抵抗ALV-J 病毒的W38敲除雞、MSTN 敲除雞等基因編輯雞等育種素材，進一步推動著家禽生物育種跨入育種4.0 時代-精準育種時代。但要推動精準育種技術在家禽育種中的快速發(fā)展和應用，仍要解決以下5 個方面的問題。

3.1 建立多種禽類的PGC 培養(yǎng)體系

PGC 的體外培養(yǎng)條件具有明顯的物種特異性，目前僅成功構(gòu)建了成熟的雞PGC 體外培養(yǎng)體系，并通過PGC 介導的基因編輯技術實現(xiàn)了關鍵基因的敲入或敲除。鵪鶉、鴨、火雞等其他禽類雖分離出了PGC，但均尚未建立起完善的PGC體外長期培養(yǎng)體系，限制了PGC 介導的基因編輯技術在鵪鶉、鴨等禽類上的應用。因此，構(gòu)建出不同禽類PGC 的最佳培養(yǎng)體系、促進基因編輯技術在野雞、鵪鶉、火雞或鴨子關鍵基因敲除或敲入上的應用將是以后基因編輯技術的重要研究方向之一。有研究通過腺病毒感染或體內(nèi)PGC 轉(zhuǎn)染的方法成功編輯出了攜帶熒光基因編輯鵪鶉[80,81]和MSTN 插入突變的基因編輯鴨[82]，但基因編輯效率較低。此外，Cooper 等[83]通過沒有PGC 介導的精子轉(zhuǎn)染輔助基因編輯技術（STAGE）成功產(chǎn)生了GFP 敲除胚胎和雞。但這些方法仍處于發(fā)展的早期階段，尚不清楚其是否像PGC 培養(yǎng)或直接注射一樣靈活、高效或穩(wěn)健，有待進一步的驗證和優(yōu)化。

3.2 提高基因編輯的實用性與安全性

基因編輯技術在不同細胞類型和生物體中的編輯效率存在顯著差異。盡管最常用的SpCas9能實現(xiàn)較高的DNA 雙鏈斷裂效率，但DSB 對細胞可能產(chǎn)生不利影響，如可能導致染色體倒位易位或過度激活P53 等基因[84]。與之不同，單堿基編輯器雖然不會引發(fā)DSB，但它引入脫氨酶，從而增加脫靶風險[20]。目前，各種策略用于減少脫氨酶導致的脫靶效應，但幾乎都伴隨著編輯效率的下降。因此，如何在維持編輯效率的前提下降低脫靶風險是一個亟待解決的問題。此外，盡管PE 技術具有實現(xiàn)任意堿基突變以及小片段插入或刪除的潛力，但其整體編輯效率相對較低。而且PE 系統(tǒng)相對較大，導致遞送方面存在挑戰(zhàn)。因此，如何提高PE 的編輯效率并減小其體積是當前迫切需要解決的問題。除此之外，SpCas9 擁有一定的NGG PAM 限制，而SpRY 雖然解除了PAM 限制，但效率顯著下降，且伴隨著脫靶風險增加[85]。因此，如何開發(fā)更高效且具有更小PAM限制的編輯器仍然是需要解決的問題。

3.3 轉(zhuǎn)基因遞送系統(tǒng)優(yōu)化

CRISPR/Cas 表達系統(tǒng)通常以質(zhì)粒、RNA 和RNP（Ribonucleoprotein）的形式進行轉(zhuǎn)染遞送到細胞內(nèi)。在體外培養(yǎng)細胞中，遞送方法包括顯微注射、電轉(zhuǎn)、病毒感染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等多種方式。但由于PGC 的特殊性，目前遞送系統(tǒng)的效率都不高，特別是對分子量比較大的核酸質(zhì)?；虻鞍祝D(zhuǎn)染遞送的效率更低。對于體內(nèi)遞送，目前主要依賴AAV 病毒感染，但AAV 病毒對編輯工具的包裝大小有一定限制，一般要求DNA 大小在4.2 kb 以下。此外，體內(nèi)遞送也采用脂質(zhì)體納米粒子，它們可以包裝DNA、RNA 和蛋白質(zhì)，且大小限制較小，但遞送效率相對較低，且靶向性不夠特異。因此，開發(fā)出不受大小限制、高效且具有特異性的遞送系統(tǒng)仍然是需要解決的問題。

3.4 功能關鍵基因的挖掘

隨著測序技術的發(fā)展，家禽遺傳圖譜繪制促進了更多改善經(jīng)濟性狀的遺傳變異，這些DNA信息除了用于選擇性育種外，也可應用于基因編輯。與哺乳動物相比，家禽重要經(jīng)濟性狀關鍵候選基因的基因編輯成功應用的案例較少。未來，基于基因組測序數(shù)據(jù)確定的目標位點功能分析驗證，并結(jié)合精確基因組編輯技術，能夠直接引入與經(jīng)濟重要性狀相關的新等位基因，賦予其抗病性和耐熱性等理想的性狀，提高生產(chǎn)力。此外，家禽的繁殖性能、抗病力等都是受多個基因控制的復雜性狀，通常是由主效基因及其互作基因構(gòu)成的調(diào)控單元共同調(diào)控目標性狀的形成。因此，除了單個關鍵功能基因的篩選，挖掘和解析調(diào)控復雜經(jīng)濟性狀的 “分子模塊”，并結(jié)合基因編輯技術進行分子模塊設計育種是未來實現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗病力強的家禽新品系創(chuàng)制的重要方法[8]。

3.5 建立健全基因編輯動物商業(yè)化應用的監(jiān)管政策

基因編輯技術的快速發(fā)展在推動畜禽育種技術發(fā)展的同時也伴隨著生物安全隱患、生態(tài)平衡和動物福利倫理等問題。因此，通過國家監(jiān)管門檻的設定，建立消費者對基因編輯產(chǎn)品的信心是影響精準育種發(fā)展和基因編輯技術應用程度的關鍵因素之一。2017—2021 年，美國食品藥品監(jiān)督管理局已先后批準了AquuAdvantage 三文魚、GalSafe 豬和PRLR-SLICK 牛3 種供人類食用的基因編輯動物上市銷售，建立了使用基因組編輯技術以及重組DNA 構(gòu)建體等技術開發(fā)的蓄意基因組改變動物監(jiān)管體系，為以后的基因編輯使用動物的上市鋪平了道路。歐盟轉(zhuǎn)基因生物、由轉(zhuǎn)基因生物制成的食品和飼料以及由轉(zhuǎn)基因生物組成或含有轉(zhuǎn)基因生物的食品/ 飼料制定了全面而嚴格的法律制度，但是否將基因編輯生物歸類于轉(zhuǎn)基因生物歐盟成員國之間仍未達成統(tǒng)一[86]。日本政府經(jīng)過安全測試批準了238 種轉(zhuǎn)基因食品和食品添加劑，是世界上最大的轉(zhuǎn)基因作物進口國之一[87]。中國也在大力支持基因編輯技術的創(chuàng)新、發(fā)展和應用，在2022 年發(fā)布了 《基因編輯植物的安全評價指南》，但目前還沒有基因編輯動物的安全評價指南或相關監(jiān)管政策[88]。因此，隨著基因編輯技術在動物中的應用，我國亟需出臺合理的監(jiān)管政策，確保基因編輯技術在動物育種中充分發(fā)揮潛力。

4 小結(jié)

綜上所述，CRISPR/Cas9 和PGCs 介導的基因編輯技術是生命科學的又一次技術革命，對家禽育種意義重大，并且隨著CRISPR/Cas9 介導的基因編輯系統(tǒng)的進一步優(yōu)化和發(fā)展，以及基因編輯動物產(chǎn)品監(jiān)管制度的完善，基因編輯技術將會在未來的家禽育種新材料創(chuàng)制等方面發(fā)揮更重要的作用。