巴西橡膠樹HbEBP1生物學(xué)特性、原核表達(dá)及氨肽酶活性分析

程漢 朱建順 安澤偉 方家林 胡彥師 黃華孫

摘 要 從巴西橡膠樹中篩選到了HbEBP1基因，該基因序列長度為1 462 bp，其中5′端非編碼區(qū)長度為141 bp，3′端非編碼區(qū)長度為133 bp，其cDNA序列具有完整的閱讀框，編碼395個氨基酸，推導(dǎo)的HbEBP1分子量為43.596 ku，等電點位為6.45。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明巴西橡膠樹HbEBP1具有3個保守結(jié)構(gòu)域：增值相關(guān)蛋白2G4（PA2G4-like）、氨肽酶M24（APP_MetAP）、甲硫氨酸氨肽酶（MAP）結(jié)構(gòu)域。對原核表達(dá)的HbEBP1蛋白進(jìn)行氨肽酶活性測定，發(fā)現(xiàn)體外表達(dá)的HbEBP1蛋白沒有Map活性。這些結(jié)果表明，橡膠樹HbEBP1基因并不存在氨肽酶活性。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；HbEBP1；氨肽酶；原核表達(dá)

中圖分類號 S794.1，Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

The Characterization，Prokaryotic Expression and MetAP

Activity Analysis of Hevea brasiliensis HbEBP1

CHENG Han，ZHU Jianshun，AN Zewei，F(xiàn)ANG Jialin，HU Yanshi，HUANG Huasun*

Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Danzhou，Hainan 571737，China

Abstract An EBP1 gene was identified from rubber tree in this study. The full length of the cDNA sequence of HbEBP1 gene was 1 462 bp in length，with a 141 bp 5′ UTR and a 133 bp 3′ UTR. An intact ORF was found in the HbEBP1 cDNA sequence， which encoding a 395 AA poly-peptide. The deduced HbEBP1 protein had a molecular weight of 43.596 ku，pI 6.45. Bioinformatics analysis revealed this protein had three conserved domains：a PA2G4-like domain，a APP-MetAP domain and a MAP domain. HbEBP1 was expressed in E.coli， and the purified protein was used to test the MAP activity. The results showed that HbEBP1 protein had no MAP activity in vitro. These results demonstrated that HbEBP1 may not function as a MAP enzyme.

Key words Rubber tree；HbEBP1；Aminopeptidase；Prokaryotic expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.017

EBP1是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型蛋白質(zhì)，是表皮生長因子受體ErbB-3結(jié)合蛋白，被認(rèn)為是重要的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)，EBP1參與多個信號傳導(dǎo)途徑，與細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)，影響細(xì)胞的增殖和分化，但其確切的作用機(jī)制尚不明確[1-5]。EBP1是增殖相關(guān)蛋白2G4（PA2G4s）家族的一員。在真核生物中，P2G4蛋白高度保守，參與細(xì)胞的生長和分化[6-7]。人體EBP1蛋白由PA2G4基因編碼，其cDNA序列全長1 697 bp，其編碼蛋白長度為394 aa，與調(diào)節(jié)鼠細(xì)胞周期的DNA結(jié)合蛋白p38-2G4高度同源[8]，在對p38-2G4進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察時發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)具有以下特點：G1期至S期中期表達(dá)呈強(qiáng)陽性，S期晚期表達(dá)量減少，S/G2間期表達(dá)呈陰性，G0期表達(dá)消失[9，6]。EBP1蛋白的分子量為48 ku，是一類堿性蛋白質(zhì)，在其C-端（368aa-373aa）存在著一個細(xì)胞核定位信號。整個蛋白包含5個酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點和6個蛋白激酶C（PKC）的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點，其第258～313 aa的肽段被推測為親水親脂性雙螺旋區(qū)域[10]。

植物中EBP1基因的命名與克隆主要基于其與人體EBP1基因在結(jié)構(gòu)和序列上的相似性。筆者在橡膠樹中克隆了橡膠樹HbEBP1基因，并對其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)能定位到細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中[11]，然而對于該基因的功能尚未進(jìn)行深入研究。通過同源性比對搜索，發(fā)現(xiàn)HbEBP1與甲硫氨酸氨肽酶（MAP）基因也具有較高的同源性。在人類中EBP1蛋白和MAP1蛋白在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，但EBP1蛋白不具有氨肽酶活性[12，10]。因此，橡膠樹HbEBP1到底屬于EBP家族基因還是MAP尚未可知。本研究通過原核表達(dá)技術(shù)使HbEBP1蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)過純化后分析了HbEBP1蛋白的氨肽酶活性，這為進(jìn)一步闡明該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用巴西橡膠樹抗寒品種93-114由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠樹國家種質(zhì)資源圃提供。當(dāng)年將芽接苗種植于大棚內(nèi)，待其長至第二蓬葉穩(wěn)定時，收集葉片樣品，于液氮保存?zhèn)溆?。所使用的菌株、質(zhì)粒載體均為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)重點開放實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 巴西橡膠樹HbEBP1基因的獲得 本課題組通過低溫誘導(dǎo)構(gòu)建了巴西橡膠樹品系93-114的全長cDNA文庫[13]，利用該文庫，對測序后的EST序列進(jìn)行注釋，得到了1 462 bp的HbEBP1基因全長cDNA。從文庫中找到對應(yīng)HbEBP1基因的編號，用無菌牙簽沾取少量菌液，接種到盛有20 mL含100 μg/mL氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒后送交華大基因科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.2.2 HbEBP1基因的生物信息學(xué)分析 HbEBP1基因的ORF預(yù)測通過NCBI的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）程序進(jìn)行；利用ExPASy的在線軟件Compute PI/MW（http：//au.expasy. org/tools/pi_tool.html）、 Protparam tool（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）、 http：//www.ch.embnet.org/和NCBI的核酸、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征在線分析工具對氨基酸序列進(jìn)行理化特性分析；通過NCBI的CD-Search service工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）對氨基酸功能保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測；信號肽預(yù)測采用SignalP 3.0程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行； HbEBP1蛋白的疏水性圖譜使用ExPASy的ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）進(jìn)行繪制； 使用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白質(zhì)跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測；使用Psort程序（http：//psort.nibb.ac.jp）對亞細(xì)胞進(jìn)行定位分析。

1.2.3 巴西橡膠樹HbEBP1基因的原核表達(dá) （1）表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)HbEBP1基因序列設(shè)計2對引物，分別引入BamHI和NotⅠ酶切位點：上游引物P1（5′-TCAAAGCTGTGGATCCATGTCGG-3′）和下游引物P2（5′-CATAAGCGGCCGCATACAAGGT-3′）。使用高保真酶從橡膠樹葉片cDNA中擴(kuò)增基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用iNtRON公司的MEGA-spin Agarose Gel Extraction Kit回收目的片段，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

將回收的目的片段用BamHI、NotⅠ（Fermentas）進(jìn)行雙酶切，回收后將其連接至經(jīng)過BamHI、NotⅠ雙酶切并磷酸化處理過的PGEX-6P-1原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，經(jīng)過測序確認(rèn)序列正確后，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入工程菌BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞中。

（2）HbEBP1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。帶有HbEBP1基因的工程菌經(jīng)過夜活化后，按1 ∶ 100的比例將其稀釋于新的培養(yǎng)基中，繼續(xù)于37 ℃中培養(yǎng)1～2 h，待OD600≈0.6時，加入一定濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在各個時間點（1 h、2 h、3 h、4 h）分別取出1 mL的菌液，離心收集菌體；分別在誘導(dǎo)后每隔1 h取出1 mL培養(yǎng)物，取其中40 μL加入10 μL的5×SDS loading buffer中，于100 ℃中煮沸10 min后，以12 000 r/min離心1 min，收集上清，取20 μL進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳。

（3）重組蛋白GST-HbEBP1的分離純化。取保存于-70 ℃的菌體，加入細(xì)胞裂解液（200 μL PBS、0.2% Triton-X 100、1 mmol/LPMSF ）懸浮，使用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解，直至溶液透明，以12 000 r/min離心10 min后，取上清液，用50%谷胱甘肽交聯(lián)瓊脂4B（Glutathione Sepharose 4B）柱進(jìn)行離心管純化，并使用谷胱甘肽洗脫液剪切GST，之后進(jìn)行洗脫，收集純化后的HbEBP1蛋白，測定其濃度后保存。

（4）HbEBP1蛋白的氨肽酶活性測定。本研究采用了2種方案對HbEBP1的甲硫氨酸氨肽酶活性進(jìn)行檢測。

參照Selvakumar等[14]的方法：以Met-pNA（BACHEM公司）為反應(yīng)底物，反應(yīng)液為500 μL，包括50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、0.25 mmol/L Met-pNA、0.4 mmol/L各種不同的二價金屬離子（Fe2+，Cu2+，Co2+，Ca2+，Mg2+，Mn2+）、融合蛋白125 ng，混勻后于37 ℃反應(yīng)30 min，冰上靜置15 min后，測OD405值。

參照Li等[15]的方法：以Met-Gly-Pro-pNA（LKT公司）為底物， 反應(yīng)液為500 μL，包括10 mmol/L Hepes（pH 7.35）、150 mmol/L KCl、10%甘油、融合蛋白200 ng、0.5 U DPP-IV（Sigma）、0.4 mmol/L二價金屬離子（Fe2+，Cu2+，Co2+，Ca2+，Mg2+，Mn2+），混勻后于37 ℃ 溫浴5 min；加入2 mmol/L Met-Gly-Pro-pNA，混勻后，測定OD405值。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西橡膠樹HbEBP1基因序列及其生物信息學(xué)分析

2.1.1 HbEBP1基因序列及其ORF區(qū)預(yù)測 借助NCBI的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）程序可知， HbEBP1基因序列長度為1 462 bp。從HbEBP1基因中找出一條長1 188 bp的ORF，其起始密碼子位于142 bp，終止密碼子位于1 327 bp，推測編碼395個氨基酸。ORF兩測分別是141 bp的5′UTR和133 bp的3′UTR（圖1）

2.1.2 HbEBP1蛋白質(zhì)特性分析 通過ExPASy在線軟件Compute PI/MW、Protparam tool、http：//www.ch.embnet.org/和NCBI的核酸、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征在線分析工具對推測的HbEBP1氨基酸序列進(jìn)行了理化特性分析。結(jié)果表明HbEBP1蛋白質(zhì)的分子量為43.596 ku，理論等電點為6.45，不穩(wěn)定指數(shù)估算值為35.71，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。其氨基酸組成見表1。

蛋白質(zhì)通常由多個膜體（Motif）組成，組成這些膜體的氨基酸區(qū)段行使各自特定的功能，同時還蘊(yùn)藏了各自的遺傳進(jìn)化信息。通過NCBI的CD-Search service工具對巴西橡膠樹HbEBP1的多肽序列進(jìn)行功能保守區(qū)域的分析。結(jié)果表明，HbEBP1具有增殖相關(guān)蛋白2G4（PA2G4-like）結(jié)構(gòu)域、氨肽酶M24（APP_MetAP）結(jié)構(gòu)域、甲硫氨酸氨肽酶（MAP）結(jié)構(gòu)域，且都高度同源（圖2）。其中，據(jù)報道，在蛋白質(zhì)合成過程中，MAP具有切除N-端起始甲硫氨酸的功能[16]，且在原核生物和真核生物中都高度保守。

2.1.3 信號肽、疏水性及跨膜區(qū)預(yù)測 采用SignalP 3.0程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行信號肽預(yù)測。分析結(jié)果顯示，巴西橡膠樹HbEBP1蛋白氨基酸序列存在信號肽的概率為0，存在信號切割位點的概率也為0，且S-core mean<0.5（圖3），因此，推測HbEBP1蛋白中不存在信號肽，不是分泌蛋白。

在進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測時必須分析蛋白質(zhì)的親/疏水性質(zhì)，通過了解整條肽鏈中不同肽端的親/疏水性，可以對一些蛋白質(zhì)跨膜的肽段進(jìn)行預(yù)測，不僅可以為蛋白質(zhì)次級結(jié)構(gòu)預(yù)測提供參考，還可以為結(jié)構(gòu)域和功能域的劃分提供參考。合成的新生肽鏈，有相當(dāng)一部分被轉(zhuǎn)運(yùn)并定位到不同的細(xì)胞器上，或被分泌到細(xì)胞外。折疊為特定的空間構(gòu)象的肽鏈，表面帶有大量的親水基團(tuán)，雖然在細(xì)胞質(zhì)中很容易被傳送，但是不能通過脂質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞膜。用ExPASy的ProtScale對HbEBP1蛋白進(jìn)行預(yù)測，計算疏水性圖譜，通過分析氨基酸殘基的得分可知，HbEBP1不含明顯的疏水區(qū)（圖4）。

跨膜結(jié)構(gòu)域一般富含疏水性氨基酸殘基，起著固定于細(xì)胞膜中的“拋錨”作用。具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白屬于跨膜蛋白，跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測對正確認(rèn)識蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、細(xì)胞定位具有重要意義。利用TMHMM軟件，對蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，屬于非跨膜蛋白。

2.1.4 亞細(xì)胞定位預(yù)測 用Psort程序分析HbEBP1蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的可能性都是30%，并在第365個氨基酸處存在核定位信號序列（NLS）：KKKK。用Protfun預(yù)測HbEBP1蛋白的功能分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白存在于信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、生長調(diào)節(jié)、脅迫應(yīng)答的可能性分別是0.051、0.037、0.018和0.011。植物EBP1基因在生長調(diào)節(jié)和響應(yīng)脅迫應(yīng)答方面的作用已經(jīng)得到證實[17]。因此推測HbEBP1在橡膠樹中可能具有調(diào)節(jié)生長和脅迫應(yīng)答功能。

2.1.5 HbEBP1同源性分析 HbEBP1與蓖麻的增值相關(guān)蛋白RcP2G4（Ricinus communis，XP_002530

504）、沙冬青AmEBP1（Ammopiptanthus mongolicus，ABF66654）、馬鈴薯StEBP1（Solanum tuberosum，ABJ97690）、擬南芥AtEBP1（Arabidopsis thaliana，NP_190748）的同源性分別為100%、98%、97%、98%。圖5可看出，HbEBP1在植物中是高度保守的。

2.2 HbEBP1蛋白的原核表達(dá)及氨肽酶活性分析

將HbEBP1基因克隆進(jìn)工程載體PGEX-6P-1中后，轉(zhuǎn)入工程菌BL21，經(jīng)0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，得到高效表達(dá)（圖6）。結(jié)果顯示GST-HbEBP1在誘導(dǎo)表達(dá)過程中，隨時間的積累，表達(dá)量不斷上升，在誘導(dǎo)4 h后（第7泳道），融合蛋白得到了大量積累，得到的重組蛋白分子量在69 ku左右，和預(yù)計的大?。℅ST為26 ku，HbEBP1預(yù)計為43.6 ku）基本相當(dāng)。

2.3 重組蛋白的氨肽酶活性測定

由于HbEBP1含有MAP保守結(jié)構(gòu)域，據(jù)報道，MAP在原核生物和真核生物中都高度保守，是一種雙核金屬蛋白水解酶，廣泛存在于生物體中，其主要功能是可選擇性地水解切除新生蛋白質(zhì)或多肽鏈N端的第一個甲硫氨酸，這對于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、成熟及其在細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位、功能發(fā)揮和最終降解等起著關(guān)鍵作用。

用裂解液將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物沉淀懸浮，之后用超聲波裂解，將上清液用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠（Glutathione Sepharose）4B過柱純化，最后將洗脫液收集起來，測定含量后參照Selvakumar等[14]和Li等[15]的方法，在0.4 mmol/L的不同金屬離子存在條件下對酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，應(yīng)用2種方法都未能檢測到氨肽酶活性。

3 討論與結(jié)論

Kowalinski等[10]在研究人源HsEBP1的晶體結(jié)構(gòu)時，在其中也沒有檢測到MAP活性。Kowalinski等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HsEBP1含有和甲流氨酸氨肽酶（MAP）、脯氨酰氨基酸酶、肌酸酶和氨肽酶P一樣的皮塔面包結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)上看，HsEBP1和人源HsMAP2非常接近，但序列確相差較大。皮塔面包酶的主要結(jié)構(gòu)特點是其內(nèi)表面的β-桶狀結(jié)構(gòu)形成一個大的腔體[10]，這個腔體是MAP2的活性位點，也是與底物結(jié)合識別的相鄰位點。在MAP家族中，活性中心的二價離子結(jié)合位點是水解底物所必需的。人體MAP2中2個金屬離子通過單基配位體（His 331和Glu 364）和二基配位體（Asp251，Asp262和Glu459）相結(jié)合。而在EBP1中，晶體結(jié)構(gòu)中不存在金屬離子，只有2個金屬配位殘基（Asp109和His188）是保守的。MAP2中的2個帶負(fù)電荷的殘基（Asp262，Glu364）在EBP1中被Asn120和Asp227替換，最為顯著的是MAP2中的Glu459在EBP1中變成了Lys320，正電荷Lys320的長側(cè)鏈在靜電上和空間位置上都阻礙了金屬的配位，所以，EBP1不能將MAP的底物進(jìn)行水解。

筆者將HbEBP1與HsEBP1的氨基酸序列做了比對，發(fā)現(xiàn)HbEBP1和HsEBP1在結(jié)構(gòu)上是保守的，HsEBP1的Asp227、Lys320位點和HbEBP1完全一樣，只是HsEBP1的Asn120在HbEBP1中變成了Val氨基酸，而Val是疏水性氨基酸，在空間上可能更加阻礙了HbEBP1與底物的結(jié)合。因此，推測HbEBP1蛋白與HsEBP1蛋白一樣，也不具有氨肽酶活性。在本研究中，筆者使用了2種氨肽酶活性測量方法，均未能檢測到氨肽酶活性，與推測結(jié)果一致。

然而，由于本研究使用的HbEBP1蛋白來源于大腸桿菌中的過量表達(dá)，而不是從橡膠樹中純化得到，因此也不能完全排除HbEBP1蛋白在原核表達(dá)體系中失去氨肽酶活性。原核表達(dá)蛋白的活性丟失往往是由于其在大腸桿菌中形成包涵體而導(dǎo)致錯誤折疊，而在本研究中，HbEBP1能夠高水平表達(dá)出可溶性蛋白，且融合蛋白的GSH標(biāo)簽也很容易被切除，因此大大降低了目的蛋白錯誤折疊的可能性。另外，已有報道稱，在原核細(xì)胞中能夠表達(dá)具有活性的氨肽酶活性蛋白[18]，因此，結(jié)合HbEBP1蛋白的生物學(xué)特征和本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為HbEBP1不具有氨肽酶活性最可能的原因是其內(nèi)在屬性。

本研究從巴西橡膠樹cDNA文庫中篩選到了巴西橡膠樹HbEBP1基因。該基因序列長度為1 462 bp，具有完整的閱讀框，編碼395個氨基酸，推導(dǎo)的HbEBP1蛋白分子量為43.596 ku，等電點位6.45。分析表明巴西橡膠樹HbEBP1具有3個保守結(jié)構(gòu)域：增殖相關(guān)蛋白2G4（PA2G4-like）、氨肽酶M24（APP_MetAP）、甲硫氨酸氨肽酶（MAP），不存在信號肽，不是分泌蛋白，不含明顯的疏水區(qū)，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，屬于非跨膜蛋白。對原核表達(dá)的HbEBP1蛋白進(jìn)行氨肽酶活性測定，發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的巴西橡膠樹HbEBP1沒有MAP活性。

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