基于DMP氧化和HWE反應(yīng)的半乳糖修飾

劉兵，楊鈺，胡鈺，孟非凡，鄭勝彪，姜兵,2,＊

1 安徽科技學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 鳳陽 233100

2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)系，合肥 230026

糖類是自然界三大生物大分子(糖類、油脂和蛋白質(zhì))之一，不僅能作為生物體的功能物質(zhì)和結(jié)構(gòu)組成，還在生物學(xué)領(lǐng)域起著至關(guān)重要的作用[1]。糖類結(jié)構(gòu)的構(gòu)建無疑是糖科學(xué)研究必須要解決的基礎(chǔ)問題之一。糖類具有不同構(gòu)型、多種官能團、多個中心手性和復(fù)雜的分支，普遍存在端位差向異構(gòu)化現(xiàn)象，因此糖類化合物具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。自然界中即使本質(zhì)上相同的糖類分子之間在結(jié)構(gòu)上也存在微小差異，因此人類想分離純化天然糖類化合物是非常不容易的。糖分子并非基因直接控制得到的，試圖通過聚合酶鏈式反應(yīng)或者生物工程的方法得到糖分子是很難實現(xiàn)的[2,3]，因此糖分子的合成將是解決其來源的重要方式之一。目前糖分子的構(gòu)建主要包括羥基的保護[4]、糖基化[5]和官能團的修飾[6]。雖然糖化學(xué)合成的相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)展一百多年，但是糖分子的人工構(gòu)建仍然是化學(xué)合成領(lǐng)域的短板之一。

將醇氧化為醛或酮有很多種方法，早期常用鉻酸、重鉻酸鹽、吡啶氯鉻酸鹽等鉻(IV)試劑，基本已經(jīng)被更溫和的無毒試劑替代(圖1)。利用二甲亞砜(DMSO)和草酰氯的Swern氧化是一種成熟的方法，而苛刻的超低溫環(huán)境極大限制了它的應(yīng)用[7]。高價碘試劑是一種條件溫和、選擇性好、產(chǎn)率高且毒性低的綠色氧化劑，無疑是一種具有吸引力的方法[8]。

圖1 醇氧化為醛酮的方法

Dess-Martin氧化是現(xiàn)代有機合成中常用的氧化反應(yīng)之一，在有機合成化學(xué)中具有非常重要的地位。1983年，Martin和他的學(xué)生Dess合成了1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氫-1,2-苯碘酰-3-酮(DMP)[9]。該化合物不僅制備方法簡單，而且可以在溫和的條件下選擇性地將醇氧化為醛或者酮，底物分子中的醚鍵等許多官能團都具有較好的兼容性。Dess和Martin通過分離鑒定反應(yīng)中間體提出了反應(yīng)的機理(圖2)[10]：首先醇作為親核試劑通過SN2反應(yīng)取代了DMP中一個乙酸根離子，得到單烷氧基二乙酰氧基高價(V)碘中間體，該中間體歧化，離去一分子乙酸，得到醛酮和低反應(yīng)性的三價碘物種。

圖2 DMP氧化的機理

1958年，Leopold Horner等利用烷基二苯基氧膦的負離子和醛酮反應(yīng)成功制備了烯烴[11]。這一對Wittig反應(yīng)的改進被稱為Horner-Wittig反應(yīng)(或Horner反應(yīng))。直到20世紀60年代早期，Wadsworth和Emmons成功利用磷酸酯合成了烯烴，這一改進才被廣泛應(yīng)用于有機合成(圖3)[12]。相比Wittig反應(yīng)，HWE反應(yīng)具有原料廉價易得、反應(yīng)活性更高、應(yīng)用范圍更廣和后處理簡潔等優(yōu)勢。

圖3 HWE反應(yīng)的機理

根據(jù)專業(yè)人才培養(yǎng)方案和教學(xué)目標，本實驗設(shè)計了基于DMP氧化和HWE反應(yīng)修飾雙丙酮半乳糖：

(1)對目標化合物進行逆合成分析(圖4)。通過對醇的氧化和醛酮的烯基化方法進行文獻調(diào)研，小組討論不同方法的優(yōu)缺點并設(shè)計合理可行的實踐方案。培養(yǎng)學(xué)生綜合解決復(fù)雜問題和設(shè)計實驗的能力。

圖4 逆合成分析

(2)利用Oxone氧化鄰碘苯甲酸得到IBX，然后在乙酸和乙酸酐作用下將IBX轉(zhuǎn)化為DMP。一方面可以鞏固規(guī)范性加反應(yīng)和減壓抽濾的基本操作，另一方面可以掌握無水無氧操作技術(shù)(Schlenk技術(shù))。Schlenk技術(shù)是化學(xué)領(lǐng)域中最重要的實驗技術(shù)之一，主要是利用雙排管將空氣和水蒸氣置換為惰性氣體。和手套箱相比，該技術(shù)對設(shè)備、操作和維護的要求更低。將Schlenk技術(shù)引入高年級本科生實踐教學(xué)，在豐富教學(xué)內(nèi)容的同時，還能拓展學(xué)生的眼界，有利于推進研究型教學(xué)模式。

(3)通過DMP氧化將雙丙酮半乳糖氧化為醛。培養(yǎng)學(xué)生運用TLC技術(shù)和鉬酸銨鈰(CAM)、2,4-二硝基苯肼(DNP)和堿性高錳酸鉀等顯色方法監(jiān)測化學(xué)反應(yīng)進程。

(4)運用HWE反應(yīng)實現(xiàn)可差向異構(gòu)醛的烯基化反應(yīng)。

該實踐方案主要培養(yǎng)學(xué)生掌握Schlenk技術(shù)、薄層色譜分析技術(shù)、柱層析技術(shù)。掌握核磁共振和紅外光譜測試技術(shù)表征化合物結(jié)構(gòu)的方法，掌握核磁共振波譜和紅外光譜圖的解析方法。本實踐方案采取兩人一組的雙教師助教協(xié)助的小班教學(xué)模式，教學(xué)內(nèi)容豐富，適合作為一個20學(xué)時實踐周的教學(xué)實驗，能夠?qū)⒎从承轮R、新理論、新技術(shù)和新方法的科研成果設(shè)計為適合高年級本科生的綜合實踐教學(xué)內(nèi)容，有利于促進科教融合的研究型教學(xué)模式。管制藥品的儲存和取用以及規(guī)范的固液廢棄物的后處理過程可以加強學(xué)生對安全意識和環(huán)保意識等的教育。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

1.1.1 DMP的制備

早在19世紀末就發(fā)現(xiàn)了IBX，在有機溶劑中溶解性差限制了它的廣泛應(yīng)用[13]。1983年，Dess和Martin將IBX轉(zhuǎn)化為溶解性較好的DMP，該方法用了有致癌性的溴酸鉀，且反應(yīng)后的殘留物污染環(huán)境[14]。Santagostino等報道了用Oxone替代溴酸鉀的方法，Oxone是一種高效清潔且易保存的氧化劑[15]。DMP試劑的具體合成流程如圖5所示：首先利用Oxone氧化鄰碘苯甲酸得到IBX。然后在乙酸和乙酸酐的作用下乙?；瑢BX轉(zhuǎn)化為DMP。

圖5 DMP的制備方法

1.1.2 雙丙酮半乳糖的修飾

實踐方案如圖6所示，雙丙酮半乳糖可以直接從化學(xué)試劑商購買，也可以在濃硫酸催化和氯化鋅的作用下，通過半乳糖和丙酮脫水縮合制備(本實踐方案不包含雙丙酮半乳糖的制備)[16]。接下來用碳酸氫鈉作堿，在DMP作用下將一級醇氧化為醛[17]。最后用一水合氫氧化鋰作堿，通過HWE反應(yīng)實現(xiàn)可差向異構(gòu)醛的烯基化反應(yīng)[18]。

圖6 雙丙酮半乳糖的修飾

1.2 試劑和耗材

1.2.1 試劑

雙丙酮半乳糖，鄰碘苯甲酸，Oxone，丙酮，冰醋酸，乙酸酐，乙醚，碳酸氫鈉，二氯甲烷(DCM)，石油醚(PE)，乙酸乙酯(EA)，硫代硫酸鈉，碳酸鈉，氯化鈉，硫酸鎂，膦?；宜崛阴?，一水合氫氧化鋰，四氫呋喃(THF)，硫酸鈉，乙醇，鉬酸銨，硫酸鈰，濃硫酸，DNP，高錳酸鉀，碳酸鉀，氫氧化鈉，以上試劑均為分析純。

1.2.2 顯色劑

CAM：分別用去離子水(45 mL)將鉬酸銨(5 g)和硫酸鈰(2 g)完全溶解并混合均勻，緩慢滴入濃硫酸(10 mL)。

DNP：將濃硫酸(30 mL)緩慢滴入去離子水(40 mL)中并恢復(fù)至室溫，將其緩慢加入2,4-二硝基苯肼(6 g)的乙醇(100 mL)溶液中。

堿性高錳酸鉀：分別用去離子水(100 mL)將高錳酸鉀(1.5 g)和碳酸鉀(10 g)完全溶解并混合均勻，再加入氫氧化鈉(0.125 g)。

1.2.3 耗材

石英砂，硅膠粉(200–300目)，TLC板(GF254)，硅藻土，氣球，鉛筆，毛細管，離心管，注射器，脫脂棉，橡膠塞，膠頭滴管，丁腈手套，活性炭口罩，稱量紙。

1.3 儀器和表征方法

布氏漏斗，抽濾瓶，玻璃棒，燒杯，抽濾漏斗，試管，圓底燒瓶，三口燒瓶，錐形瓶，稱量瓶，量筒，廣口瓶，層析柱，雙排管，油泡器，雞心瓶，茄形瓶，抽濾漏斗，分液漏斗，防濺球，加熱槍，三通閥，護目鏡，其他儀器見表1。

表1 實驗儀器

1.4 實驗步驟

1.4.1 IBX的制備

實驗步驟：稱取Oxone(36.15 g，58.8 mmol)置于250 mL單口燒瓶中，加入攪拌子和130 mL去離子水并置于磁力攪拌器上，在攪拌下加入鄰碘苯甲酸(9.92 g，40 mmol)，塞上橡膠塞并扎上氣球，用油浴將懸浮液加熱至70 °C并在該溫度下保持3 h(如圖7，注意：溫度不能高于70 °C)。

圖7 IBX的制備

后處理：將反應(yīng)液冷卻至室溫，然后置于冰水浴中冷卻30分鐘，接下來將白色懸浮液減壓抽濾，再用冷水(25 mL×6)和冷丙酮(20 mL×2)洗滌得到白色固體，將濾紙上的固體轉(zhuǎn)移至100 mL茄形瓶(注意：空瓶需要稱重)中，用三通閥將其在減壓下抽干并碾碎得到白色固體粉末IBX，最后稱重計算產(chǎn)率(9.63 g，產(chǎn)率86%)。

1.4.2 DMP的制備

實驗步驟：稱取IBX(8.40 g，30 mmol)置于100 mL三口燒瓶中，加入攪拌子，將左側(cè)口用橡膠塞塞上，中間口加一個冷凝管，在冷凝管上塞上橡膠塞，右側(cè)口連上三通閥，利用雙排管將反應(yīng)裝置中的空氣置換為氮氣(抽換氣三次)，然后在冷凝管上端橡膠塞上扎上氮氣球。接下來用注射器向反應(yīng)裝置中依次加入乙酸(23.42 g，22.3 mL，390 mmol)和乙酸酐(27.87 g，25.6 mL，273 mmol)。將反應(yīng)裝置加熱至85 °C并在該溫度下劇烈攪拌30 min(如圖8)。此時，會觀察到白色懸濁液逐漸變?yōu)辄S色溶液。

圖8 制備DM P

后處理：將反應(yīng)裝置冷卻至室溫，然后置于冰水浴中冷卻析出白色固體，接下來將白色懸浮液減壓抽濾，再用乙醚(25 mL×3)洗滌，將濾紙上的固體轉(zhuǎn)移至100 mL茄形瓶(注意：空瓶需要稱重)中，用三通閥將其在減壓下抽干并碾碎得到白色固體粉末DMP(注意：DMP對水分非常敏感，暴露在過多的水分環(huán)境中是造成實驗失敗的主要原因。)，最后稱重計算產(chǎn)率。

1.4.3 DMP氧化

實驗步驟：稱取雙丙酮-D-半乳糖(2.60 g，10 mmol)置于250 mL單口燒瓶中(注意：不必用火焰干燥燒瓶或特別小心排除反應(yīng)中水分，少量的水對反應(yīng)有促進作用)，加入攪拌子和40 mL DCM，在室溫和攪拌下依次加入碳酸氫鈉(3.36 g，40 mmol)和DMP(8.48 g，20 mmol)。通過TLC(展開劑體積比為PE/EA=7:3，CAM顯色)監(jiān)測反應(yīng)進程，如果TLC顯示反應(yīng)不完全可適當補加少量DMP(圖9)。

圖9 DMP氧化

后處理：當TLC顯示雙丙酮半乳糖已經(jīng)反應(yīng)完全，用25 mL DCM稀釋，隨后緩慢加入體積比為1:1:1的飽和硫代硫酸鈉水溶液(30 mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(30 mL)和水(30 mL)的混合液。得到的混合物在室溫下劇烈攪拌30 min得到澄清的兩相，分液得到有機相，水相用DCM萃取(20 mL×3)，合并有機相并依次用水(20 mL)和飽和食鹽水(20 mL)洗滌，用無水硫酸鎂干燥，減壓抽濾并旋干溶劑。得到的黃色油狀粗產(chǎn)品不需要進一步純化直接投入下一步反應(yīng)。

1.4.4 HWE反應(yīng)

實驗步驟：將粗產(chǎn)品用20 mL THF溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL單口燒瓶，加入攪拌子和磷?；宜崛阴?2.24 g，2.0 mL，10 mmol)，然后在攪拌下加入一水合氫氧化鋰(0.42 g，10 mmol)，在室溫下反應(yīng)過夜(圖10)。通過TLC(展開劑體積比為PE/EA=4:1，DNP和堿性高錳酸鉀顯色)監(jiān)測反應(yīng)進程。

圖10 HWE反應(yīng)

后處理：當TLC顯示醛已經(jīng)反應(yīng)完全(約10 h)，取出攪拌子并旋干溶劑，粗產(chǎn)品用二氯甲烷萃取(15 mL×3)并使用飽和食鹽水(20 mL)洗滌有機相。有機相依次用無水硫酸鎂干燥，減壓抽濾，旋干溶劑并通過柱層析(展開劑體積比為PE/EA=4:1)分離得到白色固體目標產(chǎn)物(2.29 g，兩步反應(yīng)總產(chǎn)率70%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 TLC和柱層析分析

TLC是一種操作簡便、監(jiān)測速度快、分離效果好和檢測靈敏度高的微量分析技術(shù)，常用于有機反應(yīng)的監(jiān)測。DMP氧化(圖11A和11B)：反應(yīng)液以VPE:VEA=7:3為展開劑作TLC分析，S為雙丙酮半乳糖，P為DMP氧化反應(yīng)液，M為二者的混合點。HWE反應(yīng)(圖11C和11D)：反應(yīng)液以VPE:VEA=8:2為展開劑作TLC分析，S為DMP氧化粗產(chǎn)品，P為HWE反應(yīng)液，M為二者的混合點。TLC表明，DMP氧化和HWE反應(yīng)均進行得比較完全。

圖11 TLC分析

HWE反應(yīng)后的反應(yīng)液經(jīng)過后處理得到粗產(chǎn)品，使用濕法裝柱，濕法上樣(少量DCM溶解)，先用VPE:VEA=85:15為洗脫劑進行柱層析分離出第一個雜質(zhì)點，再用VPE:VEA=80:20為洗脫劑分離出目標產(chǎn)物。

2.2 紅外光譜分析

化合物3純化后的紅外光譜如圖12，2985.85、2936.25和2905.90 cm-1處的吸收峰為C―H鍵的對稱和不對稱伸縮振動，1716.33 cm-1處的強吸收峰為羰基的伸縮振動，1665.18 cm-1處的吸收峰為碳碳雙鍵的伸縮振動，1064.46 cm-1處的吸收峰為―C―O―C―上的C―O鍵伸縮振動。

圖12 粗產(chǎn)品和化合物3的紅外光譜

2.3 核磁共振波譜分析

2.3.1 DMP的核磁共振氫譜

DMP的核磁共振氫譜見圖13。

圖13 DMP的氫譜

1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.29(t,J=7.8 Hz,2H),8.08(t,J=7.8 Hz,1H),7.90(t,J=7.4 Hz,1H),2.33(s,3H),2.00(s,6H)。

2.3.2 DMP氧化粗產(chǎn)物的核磁共振氫譜和碳譜

未純化化合物2粗產(chǎn)品的核磁共振氫譜和碳譜見圖14和圖15。

圖14 未純化化合物2粗產(chǎn)品的氫譜

圖15 未純化化合物2粗產(chǎn)品的碳譜

1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ9.64(s,1H),5.69(d,J=5.0 Hz,1H),4.69 – 4.60(m,2H),4.41(dd,J=5.0,2.4 Hz,1H),4.21(d,J=2.1 Hz,1H),1.53(s,3H),1.46(s,3H),1.37(s,3H),1.34(s,3H)。

13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ200.26,110.03,109.04,96.25,73.21,71.73,70.49,70.39,26.01,25.80,24.81,24.24。

粗產(chǎn)品核磁表明不需要進一步純化可以直接投入下一步反應(yīng)。

2.3.3 HWE反應(yīng)產(chǎn)物的核磁共振氫譜、二維氫氫相關(guān)譜和碳譜

化合物3純化后的核磁共振氫譜、二維氫氫相關(guān)譜(H-H COSY)和碳譜見圖16、17和18。

圖16 化合物3的氫譜

圖17 化合物3的H-H COSY譜

圖18 化合物3的碳譜

1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ6.91(dd,J=15.7,4.5 Hz,1H),6.13(dd,J=15.7,1.9 Hz,1H),5.58(d,J=5.0 Hz,1H),4.64(dd,J=7.7,2.5 Hz,1H),4.45(dt,J=4.3,2.1 Hz,1H),4.34(dd,J=5.0,2.5 Hz,1H),4.28(dd,J=7.7,2.1 Hz,1H),4.18(q,J=7.2 Hz,2H),1.50(s,3H),1.42(s,3H),1.33(s,3H),1.32(s,3H),1.27(t,J=7.2 Hz,3H)。

13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ166.14,142.70,122.57,109.69,108.70,96.39,72.64,70.86,70.49,67.44,60.36,26.06,25.90,24.84,24.43,14.23。

2.4 高分辨率質(zhì)譜分析

化合物3的ESI電離源高分辨率質(zhì)譜見圖19。分子加氫和加銨峰理論值分別為329.1600和346.1866，實際測量值分別為329.1606和346.1868，測量值均在誤差允許范圍內(nèi)。

圖19 化合物3的ESI-MS圖

2.5 教學(xué)實踐

本實踐項目已經(jīng)實際應(yīng)用于開展本科實驗教學(xué)，并且運行了三輪。采取的是線上線下混合式教學(xué)模式，上課前學(xué)生需要完成以下內(nèi)容：① 通過查閱文獻和工具書等總結(jié)歸納醇氧化的方法及其優(yōu)缺點；② 總結(jié)歸納構(gòu)建烯烴的方法及其優(yōu)缺點；③ 總結(jié)歸納保護醇的方法及其優(yōu)缺點；④ 學(xué)完學(xué)習(xí)通單元操作視頻；⑤ 根據(jù)查詢的資料和視頻學(xué)習(xí)寫好預(yù)習(xí)報告。實踐環(huán)節(jié)直接操作，采取小班分組教學(xué)，每班20人左右，每兩人一組，兩個老師指導(dǎo)評分，勤工助學(xué)學(xué)生協(xié)助。實踐結(jié)束后學(xué)生根據(jù)實驗過程中記錄的數(shù)據(jù)和現(xiàn)象，結(jié)合結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)的分析完善實踐報告。實踐方案經(jīng)過三輪的驗證，絕大部分學(xué)生實驗的結(jié)果和本論文基本一致。通過實踐教學(xué)改革，學(xué)生學(xué)習(xí)了新知識和新理論，基本掌握了有機合成的新技術(shù)和新方法，普遍反映所學(xué)內(nèi)容在畢業(yè)論文設(shè)計、研究生復(fù)試、藥企工作和深造學(xué)習(xí)有較大幫助。

3 結(jié)語

本文推薦了一個20學(xué)時的糖化學(xué)反應(yīng)實驗，實踐內(nèi)容包括DMP試劑的制備、雙丙酮-D-半乳糖的氧化和HWE反應(yīng)三個部分，訓(xùn)練內(nèi)容不僅涵蓋回流、減壓抽濾、干燥、萃取等基礎(chǔ)實驗操作，還將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、TLC技術(shù)、Schlenk技術(shù)、柱層析技術(shù)、紅外光譜技術(shù)、核磁共振波譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)等融合到了一個綜合性實驗中。將能夠反映新知識、新理論、新技術(shù)和新方法的科研過程引入高年級本科生的實踐教學(xué)環(huán)節(jié)，有助于激發(fā)學(xué)生的科研興趣和鍛煉學(xué)生的綜合實驗?zāi)芰Α?/p>

實踐周學(xué)時說明：第一步IBX的制備，反應(yīng)需要4學(xué)時(需完成層析柱的裝柱過程)，后處理需要2學(xué)時；第二步DMP的制備，反應(yīng)需要2學(xué)時，分離需要2學(xué)時；第三步DMP氧化，反應(yīng)需要2學(xué)時，后處理需要2學(xué)時；第四步HWE反應(yīng)，反應(yīng)需要2學(xué)時，后處理需要2學(xué)時，柱層析需要2學(xué)時。實驗過程中冗余的時間可以靈活安排儀器的清洗過程(涉及堿缸和酸缸的使用)和烘干過程。