董連強, 馬星光, 孫亞偉*
(1. 中國石油大學(xué)(華東) 化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266580; 2. 煙臺東化新材料有限公司 合成研發(fā)部,山東 煙臺 265500)
現(xiàn)有的核酸化學(xué)合成技術(shù)主要基于亞磷酰胺化學(xué)(圖1),其中5′-羥基多使用4,4′-二甲氧基三苯甲基(4,4′-dimethoxytrityl, DMT)官能團來保護,DMT官能團主要通過質(zhì)子酸來切除,然后暴露羥基供下一步偶合反應(yīng)[1]。研究人員發(fā)現(xiàn),強酸對嘌呤類核苷的糖苷鍵有較強的破壞作用,會導(dǎo)致核酸序列上嘌呤堿基的無規(guī)則脫落,使DNA結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常[2]。為解決上述問題,本文提出使用光可降解保護基團來替代現(xiàn)有的酸脫保護的DMT基團,避免DNA合成中脫嘌呤現(xiàn)象的出現(xiàn)[3-4]。
圖1 DNA合成循環(huán)流程
光脫保護基團是一類光敏化合物,可被特定波長的光激發(fā),發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),在特定位置發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂[5]。目前光保護基團的光響應(yīng)范圍主要集中在紫外區(qū)間(280~350 nm),但該波段的光照會破壞核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu),因而在該部分工作中,用可在藍光波長下進行光脫保護的保護基團對核苷的活性位點進行選擇性保護。如圖2~3所示,本文選擇7-二乙胺基-4-羥甲基香豆素和7-二乙胺基-4-羥甲基(2-二氰甲基)香豆素作為光可降解保護基團[6-9],最大吸收波長分別為365 nm和450 nm,分別處于紫外和可見光的藍光波段[10]。
圖2 光敏醇合成工藝流程
圖3 光敏脫氧胞苷合成工藝流程
基于此,本文選用N-4-乙?;撗醢兆鳛槟P突衔?將上述香豆素基團作為光脫除保護基,以碳酸二酯鍵將香豆素光可降解保護基團與脫氧核苷的5′-羥基連接,探究了不同結(jié)構(gòu)的香豆素單元在紫外以及藍光下的保護和脫保護策略,證實了香豆素類光脫除保護基團在核苷類化合物的保護和脫保護中的高效作用。
Rotavapor R-210型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(BUCHI); HJ-6型磁力攪拌器(常州中捷實驗儀器制造公司); Bruker AMX-400 MHz型核磁共振譜儀; REFLEX-Ⅲ型質(zhì)譜儀(Bruker); ZF-5型手提式紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司); XS105型電子天平(METTLER TOLEDO); VACUCELL型真空干燥箱(浙江錢江偉岸干燥設(shè)備有限公司); 2XZ-2型旋片式真空泵(上海真空泵生產(chǎn)廠); Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司); U1型LED強光手電筒(杰克斯曼電子有限公司);450型藍色激光器(OXLasers公司)。
鹽酸、硝酸銀、N,N二異丙基乙基胺和硅膠粉等(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);4-二甲氨基吡啶、叔丁基二甲基氯硅烷、三氯乙酸、四丁基氟化銨、三乙胺氫氟酸鹽和冰醋酸等(阿拉丁集團);甲苯等(富宇化學(xué)試劑有限公司);7-二乙胺基-4-甲基香豆素、對硝基苯基氯甲酸酯、雙(2,5-二氧代環(huán)戊基)碳酸酯和雙(三氯甲基)碳酸酯(化夏化學(xué)有限公司);丙二腈、勞森試劑(阿達瑪斯試劑有限公司);N-4-乙?;?’-脫氧胞苷(Sigma-Aldrich公司);吡啶(上海Admas-beta公司),所有試劑均為分析純。
(1) 化合物2的合成
稱取100 g(400 mmol)化合物1置于2 L圓底燒瓶中,分散于1000 mL無水二氯甲烷中,于室溫下攪拌,并向體系中加入90 g(530 mmol)EDC·HCl,然后加入23 mL(440 mmol)乙酸和50 g(440 mmol)DMAP,將反應(yīng)體系避光處理。反應(yīng)18 h后向反應(yīng)體系中加入飽和NaHCO3溶液,觀察到有氣泡現(xiàn)象產(chǎn)生,然后旋蒸去除溶劑,再向體系中加入1000 mL乙酸乙酯萃取,用飽和食鹽水對有機相進行洗滌,再用無水硫酸鈉干燥有機相,最后旋干得到113 g粗產(chǎn)物化合物2。
化合物2: 黃褐色油狀液體,收率98%;1H NMR(DMSO-d6, 400MHz)δ: 1.11~1.14(t,J=6 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.17(s, COCH3, 3H), 3.41~3.46(q,J=6.7 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 5.27(s, CH2O, 2H), 6.00(s, CH, 1H), 6.55~6.56(d,J=4 Hz, ArH, 1H), 6.69~6.72(q,J=4 Hz, ArH, 1H), 7.46~7.48(d,J=8 Hz, ArH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 20.8, 47.1, 62.3, 97.1, 108.5, 110.5, 111.7, 125, 147.3, 149.2, 155.5, 160.8, 170.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H19NO4{[M+H]+} 290.1387, found 290.1444。
(2) 化合物3的合成
將上一步得到的化合物2(400 mmol)加入2 L的圓底燒瓶中,分散于1000 mL甲苯中,稱取105 g(260 mmol)Lawessons reagent加入體系中反應(yīng),于115 ℃加熱攪拌反應(yīng)4 h,停止加熱后繼續(xù)反應(yīng)12 h。將反應(yīng)體系中的甲苯旋蒸去除,剩余固體用乙酸乙酯和水進行萃取,有機相用飽和食鹽水洗滌,然后用無水硫酸鈉進行干燥。粗產(chǎn)品進行柱層析純化,最終得到104 g化合物3。
化合物3: 紅色固體,收率85%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.12~1.16(t,J=8 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.76(s, COCH3, 3H), 3.45~3.50(q,J=6.7 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 5.26(s, CH2O, 2H), 6.73(d, CH, 1H), 6.82~6.85(q,J=4 Hz, ArH, 1H), 6.69~6.72(s, ArH, 1H), 7.46~7.48(d,J=8 Hz, ArH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 20.8, 47.1, 62.4, 91.4, 104.3, 104.8, 126, 137.5, 150.2, 155.2, 170.2, 195.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H19NO3S {[M+H]+} 306.1159, found 306.1238。
(3) 化合物4的合成
稱取200 g(655 mmol)的化合物3置于2500 mL圓底燒瓶中,加入1000 mL的甲苯進行溶解,并向溶液中加入含220 g(1311 mmol)硝酸銀的硅膠粉混合物,室溫下攪拌5 min。分別稱取90 g(1311 mmol)丙二腈和160 g(1311 mmol)DMAP置于圓底燒瓶中,加入500 mL的甲苯使之溶解,室溫下攪拌5 min。將丙二腈和DMAP的混合液逐滴加入到化合物3的溶液中,90 ℃下加熱攪拌反應(yīng)4 h,停止加熱后繼續(xù)反應(yīng)10 h。抽濾除去不溶物,然后旋蒸去除甲苯,剩余固體用乙酸乙酯和水進行萃取,有機相用無水硫酸鈉進行干燥。粗產(chǎn)品進行柱層析純化,最終得到120 g化合物4。
化合物4: 紅色固體,收率52%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.13~1.17(t,J=8 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.15(s, COCH3, 3H), 3.48~3.54(q,J=8 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 5.37(s, CH2O, 2H), 6.74(s, CH, 1H), 6.67~6.68(d,J=4 Hz, ArH, 1H), 6.88~6.90(t,J=2.7 Hz, ArH, 1H), 7.60~7.62(d,J=8 Hz, ArH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 20.8, 47.1, 53.7, 63.3, 92.7, 105.9, 106.1, 113.6, 117.7, 125.3, 130.5, 149.5, 154.6, 170.2, 191.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H19N3O3{[M+H]+} 338.1499, found 338.1568。
(4) 化合物5的合成
稱取50 g(148 mmol)的化合物4置于2500 mL圓底燒瓶中,加入500 mL無水乙醇進行溶解,再加入400 mL HCl的乙醇溶液(12 mol/L),于60 ℃下攪拌反應(yīng)5 h。反應(yīng)完畢后向體系中加入飽和的NaHCO3溶液以中和剩余的鹽酸。然后旋蒸去除溶劑,加入乙酸乙酯和水對體系進行萃取,有機相用無水硫酸鈉進行干燥,將產(chǎn)物旋干后進行真空干燥,得到40 g化合物5。
化合物5: 橙紅色固體,收率95%;1H NMR(d6-DMSO, 400MHz)δ:1.09~1.11(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 3.43~3.46(q,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 4.76(t, CH2OH, 2H), 5.72(s, CH2OH, 1H), 6.59(s, CH, 1H), 6.76(s, ArH, 1H), 6.79~6.81(m, ArH, 1H), 7.49~7.50(d,J=4 Hz, ArH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: -2.3, 12.9, 47.1, 53.7, 63.9, 92.7, 105.9, 106.1, 113.6, 117.7, 125.3, 130.5, 149.5, 154.6, 191.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C17H17N3O2{[M+H]+} 296.1349, found 296.1426。
(5) 化合物7的合成
稱取5 g(20 mmol)化合物1加入到250 mL圓底燒瓶中,加入100 mL無水乙腈進行溶解,然后加入5 g(42 mmol)DMAP,再加入6 g(30 mmol)對硝基苯基氯甲酸酯,于室溫下攪拌反應(yīng)1 h,反應(yīng)完畢后將體系進行濃縮,等待產(chǎn)物結(jié)晶后進行抽濾操作。然后加入0.3 g(2.4 mmol)DMAP和9 g(20 mmol)3′-OTBDMS-dCBz,于室溫下攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)完畢后對體系進行旋蒸,然后用乙酸乙酯和水萃取,無水硫酸鈉干燥有機相。柱層析純化,將得到的洗脫液進行旋蒸以及抽真空干燥,得到8.3 g化合物7。
化合物7: 淡黃色固體,收率58%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 0.04(s, SiCH3, 6H), 0.83(s, SiCCH3, 9H), 1.04~1.06(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.18~2.23(m, 2’H, 1H), 2.28~2.30(m, 2’H, 1H), 3.68~3.71(t,J=6 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 4.05~4.06(d,J=4 Hz, 3’H, 1H), 4.37~4.39(t,J=4 Hz, 5’H, 1H), 5.33(s, 5’H, 1H), 5.96(s, ArCH2O, 2H), 6.13~6.15(t,J=4 Hz, 4’H, 1H), 6.48(s, 1’H, 1H), 6.63~6.65(t,J=4 Hz, O=CCH=C, 1H), 6.86~6.90(m, ArH, 2H), 7.04~7.06(t,J=4 Hz, ArH, 1H), 7.34~7.36(d,J=8 Hz, C=CHC=N, 1H), 7.46~7.49(t,J=8 Hz, O=CArH, 2H), 7.57~7.60(t,J=6 Hz, O=CArH, 1H), 7.96~7.97(d,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 8.12~8.13(d,J=4 Hz, NCH=C, 1H), 11.22(s, NH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: -2.0, 12.9, 25.9, 30.9, 41.1, 47.1, 66.3, 66.7, 73.8,89.3, 95.0, 95.7, 97.1, 108.5, 110.5, 111.7, 125.0, 127.5, 128.8, 132.1, 133.2, 143.0, 147.3, 149.2, 155.1, 155.5, 160.8, 162.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C37H46N4O9Si {[M+H]+} 719.3107, found 719.3091。
(6) 化合物8的合成
稱取3 g(4 mmol)化合物7加入到100 mL圓底燒瓶中,溶于20 mL無水四氫呋喃,加入10 mmol(1 mol/L)四丁基氟化銨,再向反應(yīng)體系中滴加50滴冰醋酸于室溫下攪拌反應(yīng)0.5 h。旋蒸除去四氫呋喃,然后用乙酸乙酯和水進行萃取,無水硫酸鈉干燥有機相。粗產(chǎn)品進行柱層析純化,將得到的洗脫液進行旋蒸以及真空干燥后得到1.8 g化合物8。
化合物8: 淡黃色固體,收率75%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.02~1.04(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.14~2.19(m, 2’H, 1H), 2.36~2.40(m, 2’H, 1H), 3.30~3.33(q,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 4.12~4.13(t,J=2 Hz, 3’H, 1H), 4.28~4.30(t,J=4 Hz, 5’H, 1H), 4.40~4.42(t,J=4 Hz, 5’H, 1H), 4.45~4.48(m, OH, 1H), 5.32(s, ArCH2O, 2H), 5.65(s, 4’H, 1H), 5.95(s, 1’H, 1H), 6.19(s, ArH, 2H), 6.43(s, ArH, 1H), 6.60~6.61(m, C=CHC=N, 1H), 7.46~7.48(t,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 7.57~7.59(d,J=8 Hz, O=CArH, 1H), 7.98~7.99(d,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 8.15~8.16(d,J=4 Hz, NCH=C, 1H), 11.23(s, NH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 40.1, 47.1, 66.3, 66.7, 70.7,85.5, 95.0, 95.7, 97.1, 108.5, 110.5, 111.7, 125.0, 127.5, 128.8, 132.1, 133.2, 143.8, 147.3, 149.2, 154.4, 155.5, 160.8, 162.9, 167.0; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C31H32N4O9{[M+Na]+} 627.2083, found 627.2051。
(7) 化合物10的合成
將3 g(10 mmol)化合物5加入到100 mL圓底燒瓶中,溶于20 mL無水乙腈,然后加入2.6 g(21 mmol)DMAP,再加入2.2 g(30 mmol)對硝基苯基氯甲酸,于室溫攪拌反應(yīng)1 h,反應(yīng)完畢后進行濃縮,待產(chǎn)物結(jié)晶后進行抽濾得到產(chǎn)物。然后向體系中加入1.4 g(12 mmol)DMAP和4.4 g(10 mmol)3′-OTBDMS-dCBz,于室溫下攪拌反應(yīng)6 h。用乙酸乙酯和水萃取,無水硫酸鈉干燥有機相。柱層析純化,將得到的洗脫液進行旋蒸及真空干燥得到3.4 g化合物10。
化合物10: 黃褐色固體,收率45%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 0.04(d, SiCH3, 6H), 0.83(s, SiCCH3, 9H), 1.06~1.08(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.17~2.20(q,J=4 Hz, 2’H, 1H), 2.28~2.30(t,J=4 Hz, 2’H, 1H), 3.68~3.71(t,J=6 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 4.06(d, 3’H, 1H), 4.38~4.39(d,J=4 Hz, 5’H, 1H), 5.46(s, 5’H, 1H), 6.11~6.14(t,J=6 Hz, ArCH2O, 2H), 6.60(s, 4’H, 1H), 6.81~6.82(d,J=4 Hz, 1’H, 1H), 6.89~6.90(d,J=4 Hz, O=CCH=C, 1H), 7.04~7.06(t,J=2.7 Hz, ArH, 2H), 7.15~7.16(d,J=4 Hz, ArH, 1H), 7.29~7.30(d,J=4 Hz, C=CHC=N, 1H), 7.46~7.49(t,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 7.56~7.59(t,J=4 Hz, O=CArH, 1H), 7.96~7.97(d,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 8.08~8.09(d,J=4 Hz, NCH=C, 1H), 11.21(s, NH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: -2.0, 12.9, 25.9, 30.9, 41.1, 47.1, 53.7, 66.3, 66.7, 73.8, 89.3, 92.7, 95.0, 95.7, 105.9, 106.1, 111.7, 113.6, 125.3, 127.5, 128.8, 130.5, 132.1, 133.2, 143.0, 149.5, 154.6, 154.4, 155.1, 162.9, 167.0, 191.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C40H48N6O8Si {[M+Na]+} 789.3039, found 789.3036。
(8) 化合物11的合成
稱取3 g(4 mmol)化合物10加入到100 mL圓底燒瓶中,溶于20 mL無水四氫呋喃中,再加入10 mmol四丁基氟化銨(1 mol/L),再向反應(yīng)體系中滴加50滴冰醋酸,于室溫下攪拌反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去四氫呋喃,加入水和乙酸乙酯進行萃取,無水硫酸鈉干燥有機相。通過柱層析對產(chǎn)物進行純化,將得到的洗脫液進行旋蒸及真空干燥后得到1.3 g化合物11。
化合物11: 黃褐色固體,收率50%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.09~1.12(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.04~2.08(m,J=16 Hz, 2’H, 1H), 2.10~2.14(m,J=16 Hz, 2’H, 1H), 3.28(d, ArNCH2CH3, 4H), 3.45~3.48(q,J=3 Hz, 3’H, 1H), 3.71~3.72(d,J=4 Hz, 5’H, 1H), 3.92~3.94(t,J=2.7 Hz, 5’H, 1H), 3.97~4.01(q,J=4 Hz, OH, 1H), 4.20(s, ArCH2O, 2H), 4.33~4.34(d,J=4 Hz, 4’H, 1H), 4.96~4.98(t,J=2.7 Hz, 1’H, 1H), 5.41~5.45(q,J=4 Hz, ArH, 2H), 5.72(s, ArH, 1H), 6.14~6.17(t,J=4.0 Hz, C=CHC=N, 1H), 6.59~6.62(d,J=12 Hz, O=CArH, 2H), 6.82~6.84(d,J=8 Hz, O=CArH, 1H), 7.38(d, O=CArH, 2H), 7.72~7.74(d,J=8 Hz, NCH=C, 1H), 11.25(s, NH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 40.1, 47.1, 53.7, 66.3, 66.7, 70.7, 85.5, 92.7, 95.0, 95.7, 105.9, 106.1, 108.5, 110.5, 111.7, 113.6, 125.3, 127.5, 128.8, 132.1, 133.2, 143.8, 149.5, 154.4, 154.6, 155.1, 160.8, 162.9, 167.0, 191.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C34H32N6O8{[M+Na]+} 675.2175, found 675.2153。
2017年,MARCHAN課題組[10-14]報道了可見光波段響應(yīng)的香豆素光脫保護基團,該課題組以7-二乙胺基-4-甲基香豆素為原料,通過對其2-位進行修飾,得到不同波長響應(yīng)的香豆素光脫保護基團,在化合物3到化合物4的合成中,有大量硫化銀副產(chǎn)物產(chǎn)生,硫化銀具有極高的黏稠性,使整個反應(yīng)的分離純化難度增加。為解決以上問題,本研究采用硝酸銀與層析100~200目的硅膠混合投料模式,有效避免了黏稠固體的產(chǎn)生,在一定程度上降低了分離純化的難度,在優(yōu)化反應(yīng)過程的同時使收率由原來的40%提高到了52%。
在本文中用碳酸二酯鍵將光可降解保護基團和脫氧核苷5′-羥基連接到一起,由于碳酸二酯鍵在中等強度的酸性和堿性環(huán)境下均具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性,所以可以耐受DNA合成過程中的強酸性和強堿性化學(xué)環(huán)境。如表1所示,同時考察了三光氣、羰基二咪唑和對硝基苯基氯甲酸酯等常見連接試劑對目標(biāo)物合成收率的影響,其中添加三光氣的反應(yīng)速度最快,但是反應(yīng)副產(chǎn)物較多,分離純化的價值極低;添加羰基二咪唑后該反應(yīng)的二取代副產(chǎn)物較多且反應(yīng)速度慢,產(chǎn)物通過柱層析分離純化困難,收率低無法滿足后續(xù)試驗要求。因此最終選擇對硝基苯基氯甲酸酯作為連接試劑,該試劑與化合物1和化合物5的反應(yīng)效率高,并且副產(chǎn)物較少,反應(yīng)后處理簡單。其中化合物6和化合物9可以通過結(jié)晶的方式分離純化,收率分別為63%和60%。
表1 不同保護試劑對化合物10合成的影響
將制備的香豆素-PNC單體與脫氧胞苷5′-羥基進行連接保護,如表2~4所示,本文考察了不同溶劑、添加劑、溫度對實驗結(jié)果的影響。通過對N,N-二甲基甲酰胺、吡啶和乙腈等有機溶劑進行對比,確定最優(yōu)溶劑為乙腈;通過對1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯、N,N-二異丙基乙胺和4-二甲氨基吡啶等有機堿進行對比,確定最優(yōu)添加劑為4-二甲氨基吡啶。此外在不加添加劑的情況下進行了實驗,收率低于40%。通過探究不同反應(yīng)溫度對實驗結(jié)果的影響,確定最優(yōu)反應(yīng)溫度為65 ℃。因此光可降解保護基團的保護條件如下:溶劑為乙腈,添加劑為4-二甲氨基吡啶,反應(yīng)溫度為65 ℃。
表2 不同溶劑對化合物7收率的影響
表3 不同添加劑對化合物7收率的影響
表4 不同溫度對化合物7收率的影響
為了探究光敏核苷單體的應(yīng)用前景,在光敏脫氧核苷合成后,對紫外光響應(yīng)的光敏脫氧胞苷(化合物8)進行光降解實驗。根據(jù)文獻介紹和紫外光敏香豆素的吸收光譜[15],光解實驗決定采用最大吸收波長為365 nm進行光解實驗,使用光功率密度為500 mW/cm2的紫外燈。為確定紫外香豆素光可降解保護單元徹底脫保護的最佳光照時間,在光照時間分別為15 s、 30 s、 60 s、 90 s、 120 s和150 s的條件下進行HPLC表征,并整合出光解動力學(xué)曲線。通過對圖4分析得知,在120 s的紫外光照下化合物8的光解率達到了100%。因此將紫外光照時間定為120 s,確?;衔?能夠全部發(fā)生光解。
時間/s圖4 化合物8光解動力學(xué)曲線
Time/min圖5 化合物8光照前后HPLC譜圖
時間/min圖6 化合物11光解動力學(xué)曲線
Time/min圖7 化合物11光照前后HPLC譜圖
將進行2 min紫外光照后的化合物8通過反相高效液相色譜記錄光照前后HPLC出峰的時間差異。從圖5可以看出,化合物8在光照前的保留時間為2.98 min,但是在經(jīng)過2 min的光照后,2.98 min處的信號消失,新的化合物保留時間變?yōu)?.74 min。同時對N-4乙酰基脫氧胞苷進行液相色譜分析,發(fā)現(xiàn)其在該分析條件下的保留時間是2.74 min,證實化合物8可以按照預(yù)期方式發(fā)生香豆素保護基團的光脫保護。通過電噴霧電離質(zhì)譜對光照后的結(jié)果進行表征,所得結(jié)果為298.1398({[M+H]+}),與N-4乙?;撗醢盏姆肿恿拷Y(jié)果一致。綜上可知,以碳酸二酯鍵連接的7-二乙胺基-4-羥甲基香豆素保護基團可在2 min的紫外照射下完全脫除。
在驗證完紫外光敏脫氧胞苷光解的可行性后,對藍光響應(yīng)的光敏脫氧胞苷(化合物11)進行可見光照射下的光降解實驗。根據(jù)藍光光敏香豆素的吸收光譜決定采用其最大吸收波長為450 nm進行光解實驗,使用功率為2.5 W的藍色激光作為光源。為確定最佳光照時間,分別對光照時間為3 min、 6 min、 9 min、 12 min、 15 min、 18 min、 21 min和24 min的結(jié)果進行HPLC表征,并整合出光解動力學(xué)曲線,以此確定藍光光敏脫氧胞苷的最佳光解時間。通過對圖6分析得知,在大于18 min的藍光光照下化合物11的光解率達到了100%,為了確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性特此將藍光光照時間設(shè)置為20 min,以確?;衔?1能夠全部發(fā)生光解。
將進行20 min藍光光照后的化合物11通過反相高效液相色譜記錄光照前后HPLC出峰的時間差異。由圖7可以看出,光照前化合物11在反相高效液相色譜中的保留時間為3.09 min。光照后該信號消失,新的化合物保留時間變?yōu)?.73 min,與N-4乙?;撗醢毡A魰r間一致。
通過電噴霧電離質(zhì)譜對光照后的結(jié)果進行表征,所得結(jié)果為298.1398({[M+H]+}),與N-4乙?;撗醢盏姆肿恿拷Y(jié)果一致。綜上可知,該實驗證實7-二乙胺基-4-羥甲基(2-二氰甲基)保護基團在藍光照射下可以實現(xiàn)高效脫除。
綜上所述,本文分別對紫外光敏脫氧胞苷和藍光光敏脫氧胞苷進行了光解實驗和結(jié)果驗證,結(jié)果充分說明了光解實驗的成功。
本文中將在不同波長下可發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的香豆素類化合物作為脫氧核苷化合物5′-羥基的光響應(yīng)保護基,確定了合成過程中的最優(yōu)溶劑、添加劑和溫度,探究了合成效率最佳的反應(yīng)條件。同時對上述保護基團的光降解行為進行了初步研究,探索了在不同光照時間下紫外和藍光2種光可降解保護基團的光降解脫保護效率,確定了最佳脫保護光照時長。該研究為光控DNA的合成化學(xué)進行了較為細致的前期研究。