豬-恒河猴心臟異種移植的圍術期受體感染預防及治療策略總結與分析

周曄農(nóng)，張 冰，陳 濤，楊秀玲，金 艷，呂向妮，郭 紅，易 蔚，趙 榮，段維勛，劉金成，金振曉

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心血管外科，陜西 西安 710032)

心臟移植是目前治療終末期心力衰竭最有效的方法。根據(jù)國際心肺移植學會的調查，盡管有許多心力衰竭患者需要接受心臟移植，但實際上只有極少數(shù)(僅4%)的患者最終能夠獲得這一手術機會[1]，在中國，每年等待心臟移植手術的患者與成功接受移植手術患者的比例為30∶1[2]。心臟異種移植是解決供體短缺的重要手段[3]。2022年1月，馬里蘭大學團隊成功進行了世界首例豬-人心臟異種器官移植手術，且受者在手術后存活了60 d[4]。2023年9月，他們又進行了第二例豬-人心臟異種移植手術，目前受者仍存活[5]。

盡管異種移植被認為是心臟移植的一種有效替代方法，但障礙重重，需要克服的困難包括免疫排斥[6]、凝血功能障礙[7]、異種移植物生長[8]、感染和炎癥[9]等。隨著基因編輯技術、免疫抑制方法以及術后管理策略的不斷改進，心臟異種移植受體的存活時間顯著延長[10-11]。然而在心臟同種異體移植和異種移植實驗中，術后感染很常見，并且顯著影響移植物存活率[12-13]。不同類型的病原微生物，包括細菌、病毒和真菌，都可能成為移植后感染的病原體。本研究圍繞2022年空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院開展的1例基因編輯豬-恒河猴異種心臟移植實驗術后受體猴的臨床表現(xiàn)、檢查檢驗指標等數(shù)據(jù)，總結感染發(fā)生的情況、治療措施及預后轉歸，為未來的異種移植研究提供經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料

供體為GTKO/β4GalNT2 KO/CMAH KO/hCD55/hCD46/hTBM基因編輯的雄性小型巴馬豬，基因編輯豬是通過體細胞核移植產(chǎn)生的[10]。將表達重組人蛋白的轉基因載體轉染到培養(yǎng)的豬胚胎成纖維細胞中，其中hCD55和hCD46調節(jié)補體途徑，hTBM預防凝血功能障礙。供體豬敲除主要糖類抗原半乳糖α-1,3-半乳糖，另外兩個異種抗原N-糖基神經(jīng)氨酸和Sda被CRISPR/Cas9誘導的插入和/或缺失突變基因敲除，這些基因編碼催化它們合成的酶，即CMAH和β4GalNT2。供體豬體質量7 kg，受體為雄性恒河猴，體質量10 kg。

1.2 方法

1.2.1 異種異位心臟移植 采用腹腔異位心臟移植的手術方法。術前1周實驗動物驅蟲處理，術前12 h禁食水并清洗全身。供體豬麻醉后從劍突到柄的中線切口打開其胸部。全身肝素化，結扎下腔靜脈和上腔靜脈，阻斷靜脈回流，切開下腔靜脈、左上腔靜脈和左心房。主動脈根部插入冷灌針，阻閉升主動脈并灌注4 ℃冷組氨酸-色氨酸-酮戊二酸停搏液，同時將碎鹽水冰敷在心包上。將心臟腔靜脈、左心房、肺動脈和主動脈分離，取出心臟，留下足夠長的大血管進行吻合。心臟從胸腔取出后，左心房和腔靜脈開口被封閉。受體猴麻醉后，通過中線切口打開其腹部，暴露并分離出腎動脈開口下方腹主動脈和下腔靜脈。肝素化后，鉗夾后，行腹主動脈切開和下腔靜脈切開。供體主動脈與受體腹主動脈端側吻合，供體肺動脈與受體下腔靜脈端側吻合。吻合后，大血管及吻合口排氣并開放血流，靜脈給予甲強龍20 mg/kg，同時給予碳酸氫鈉、利多卡因、100 mL/L葡萄糖酸鈣、硫酸鎂注射液，直至心功能恢復和竇性節(jié)律恢復。

1.2.2 圍術期免疫抑制方案 受體猴的免疫抑制方案包括抗胸腺細胞球蛋白、αCD20抗體(利妥昔單抗)用于T細胞和B細胞抑制；阿巴西普用于阻斷CD28/B7共刺激信號通路；眼鏡蛇毒因子用于抑制補體激活；托珠單抗和依那西普用于抑制炎性因子，他克莫司(維持5～25 μg/L的血藥濃度)用于抑制淋巴細胞，甲潑尼龍用于抗炎和抗急性排斥反應。受體持續(xù)微量泵注射肝素，維持活化凝血時間在基線水平的2倍，持續(xù)至受體死亡。

1.2.3 圍術期感染預防方案 給予更昔洛韋預防病毒感染，抗真菌感染選擇注射用醋酸卡泊芬凈。術前30 min給予頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉0.5 g，術后繼續(xù)給予頭孢哌酮舒巴坦鈉持續(xù)6 d預防術后細菌感染。根據(jù)受體病情、藥效、用藥時長調整抗生素的使用，具體給藥劑量及詳細調整過程見結果部分。

1.2.4 術后重癥監(jiān)護 受體猴手術結束42 min后拔除氣管插管，重癥監(jiān)護護士和醫(yī)生在術后20 d提供重癥監(jiān)護級別的監(jiān)測和管理。限制受體肢體活動，并持續(xù)監(jiān)測呼吸、血壓等生命體征。每日早晨抽血，測定全血細胞計數(shù)、炎癥因子及每日進行引流液、胃液、口鼻腔分泌物、腹腔積液等液體的細菌培養(yǎng)，用于監(jiān)測感染。受體猴從術后第4日開始每日進行胸部X射線片檢查，用于監(jiān)測是否出現(xiàn)肺部感染，并根據(jù)胸片情況對肺部護理進行調整，如加強翻身、拍背、霧化、吸痰等護理措施預防肺部炎癥進展。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 所有生成的數(shù)據(jù)，包括線形圖，使用GraphPad Prism 9.0軟件進行處理和分析。

2 結果

2.1 總體結果和結局

受體猴于術后當日拔除氣管插管，存活并維持供體心臟功能持續(xù)20 d，期間受體猴一直處于束縛臥位，給予重癥監(jiān)護，最終因凝血功能紊亂死亡。

2.2 術后受體體征及臨床表現(xiàn)

2022年10月16日完成手術后，平均每0.5 h記錄一次體溫，并在次日早8∶00記錄前一日最高體溫，將每日最高體溫形成折線圖(圖1)，受體沒有出現(xiàn)過極低體溫(低于36.0 ℃)或者極高體溫(超過38.5 ℃)，即使體溫超過38.0 ℃也在一般物理降溫后當日恢復正常，從體溫來看未見受體出現(xiàn)明顯感染癥狀。受體于術后第6～8日出現(xiàn)偏黃色痰液，經(jīng)過加強肺部護理和吸痰護理后，癥狀有所改善。

圖1 術后受體體溫隨時間變化曲線圖

2.3 術后受體血細胞分析和血清學指標

受體每日進行血細胞分析和血清炎性因子的濃度檢查來初步評估是否存在感染。如圖2所示，受體白細胞、中性粒細胞和單核細胞波動明顯，但并未發(fā)生極度升高的情況，其中10月29日(術后第13日)全系升高最明顯，可能由于前一日受體接受了異體猴全血輸注的原因。同時，因為受體早期發(fā)生凝血功能紊亂，失血情況較為明顯，通過血細胞分析可能無法準確判斷感染的情況。因此進一步分析了受體每日血清炎性因子水平變化(圖3)，受體C-反應蛋白和降鈣素原在術后均處于極低水平，未提示感染的發(fā)生。

圖2 術后受體白細胞計數(shù)(A)、中性粒細胞計數(shù)(B)和單核細胞計數(shù)(C)隨時間變化曲線圖

圖3 術后受體C反應蛋白(A)和降鈣素原(B)的血清濃度隨時間變化曲線圖

2.4 術后受體胸部X射線檢查

受體從術后第4日開始每天進行一次床旁胸部X射線檢查，結果如圖4所示，10月25日(術后第9日)胸片顯示右肺中下部斑片狀高密度影，我們加強肺部護理，對受體進行霧化、祛痰、間歇吸痰等治療。術后第10日胸片顯示肺部高密度影減少。而術后第12日和第13日胸片顯示右側中部肺野大片斑片狀高密度影，經(jīng)加強肺部護理和治療至術后第20日，受體的胸片未見明顯的感染征象。

圖4 術后受體胸部X射線圖片匯總

2.5 術后受體血液及分泌物細菌培養(yǎng)

當出現(xiàn)可疑感染征象(肺部斑片狀陰影、黃色痰液、體溫超過38 ℃)時，醫(yī)護人員會對受體的血液、痰液、口腔分泌物、腹水、引流液、胃液等進行細菌培養(yǎng)檢查。在10月30日返回的化驗結果中顯示，10月28日(術后第12日)采集的腹腔引流液、10月29日(術后第13日)采集的胃液、10月30日(術后第14日)采集的口腔分泌物和腹水中均培養(yǎng)出了溶血葡萄球菌，提示存在細菌感染的證據(jù)，但感染原發(fā)灶未知。

2.6 術后受體抗感染藥物調整過程

本次圍術期預防用抗生素選擇頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉，術前30 min給藥。術后抗病毒藥物選擇更昔洛韋，每2 d給藥1次，每次給藥12.5 mg?？股匾廊皇褂妙^孢哌酮鈉舒巴坦鈉，術后每8 h給藥1次，每次給藥0.5 g靜脈滴注。術后第6日出現(xiàn)黃色痰液后，由于未出現(xiàn)細菌培養(yǎng)陽性結果且頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉使用時間較長，根據(jù)經(jīng)驗更換為哌拉西林他唑巴坦，每8 h給藥1次，每次給藥1.5 g靜脈滴注。由于術后第9日和第11日肺部X射線檢查發(fā)現(xiàn)斑片狀陰影，為對抗可能出現(xiàn)的肺部感染和及時控制病情進展，術后第11日將抗生素升級為注射用美羅培南，每8 h給藥1次，每次給藥0.1 g微量泵注射(3 h注射完畢)，并加用抗真菌藥物卡泊芬凈，每日1次，每次給藥25 mg微量泵注射(2 h注射完畢)。10月30日根據(jù)腹腔引流液細菌培養(yǎng)藥敏實驗結果，本次受體感染的溶血葡萄球菌對利奈唑胺敏感，因此抗生素更換為利奈唑胺葡萄糖注射液，每12 h給藥1次，每次給藥0.1 g靜脈滴注，直至受體死亡。

3 討論

在異種移植實驗和臨床應用中，醫(yī)生們往往關注的是受體術后感染情況，特別是跨物種病毒感染。首次進行豬-人心臟移植后，在受者體內檢測到豬巨細胞病毒的存在，證實了豬源病毒向宿主傳播的可能性[14]。在本研究中，我們主要關注大量使用免疫抑制劑相關的術后受體病原體感染情況。在可能感染的病原體種類中，細菌感染一直是同種異體心臟移植后的一個重要危險因素[15]，有必要采取措施預防和監(jiān)測圍手術期細菌感染的發(fā)生[16]。

由于免疫抑制和感染預防策略的不斷進步，包括在移植前進行傳染病篩查和采用抗菌素預防，心臟移植后患者細菌感染的發(fā)生率顯著下降[12]。革蘭陰性菌，如克雷伯氏菌和大腸桿菌，是最常見的感染病原體；其次是革蘭陽性菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌[15-17]。一般來說，異種移植后使用的免疫抑制劑的種類和劑量明顯高于同種異體移植，受體術后細菌感染的風險更大[6]。1996年，DAVIS等[18]進行了異位豬-食蟹猴心臟異種移植，在4只受體動物中，有2只因全身感染而死亡。具體而言，一只食蟹猴的血液培養(yǎng)結果顯示革蘭陽性和革蘭陰性菌血癥，而另一只食蟹猴的血液培養(yǎng)結果提示存在播散性巨細胞病毒感染，并伴有嚴重的巨細胞病毒肺炎。隨后不久，有研究團隊將轉基因豬的心臟原位移植到狒狒受體中，結果顯示，10只狒狒中有2只出現(xiàn)嚴重的術后感染并發(fā)癥(肺炎和全血細胞減少癥)，最終導致死亡[19]。2006年，BYRNE等[20]進行了轉基因豬-狒狒的腹部異位心臟移植研究。他們發(fā)現(xiàn)，隨著免疫抑制劑種類和劑量的增加，感染并發(fā)癥的風險也增加。在接受移植的63只狒狒中，有16只因敗血癥死亡，其中一半的敗血癥是由細菌引起的。后來，隨著術后監(jiān)測手段的改進以及抗生素研發(fā)的進步，術后感染變得更加可控[21]。在本研究中，我們對術后感染相關指標進行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在術后第14日，受體的引流液、胃液、口腔分泌物和腹腔積液中都培養(yǎng)出了相同的細菌——溶血葡萄球菌，這表明受體發(fā)生了系統(tǒng)性感染。

溶血葡萄球菌發(fā)生侵襲性感染主要引起化膿性炎癥。葡萄球菌可通過多種途徑侵入機體，導致皮膚或器官的多種感染，甚至感染敗血癥[22]。但是在本研究中，受體血液中并沒有培養(yǎng)出溶血葡萄球菌，而且直到受體死亡也沒有出現(xiàn)明顯的感染癥狀。因此我們認為，雖然移植術后明確發(fā)生了細菌感染，但細菌感染并不是主要致死原因，但其是否推動了受體整體情況惡化需要進一步研究。近年來異種心臟移植術后最明顯、最嚴重的感染并發(fā)癥是2015年的一項研究，7只狒狒中有4只出現(xiàn)感染相關并發(fā)癥，其中包括由腸道糞便菌群引起的菌血癥、肺炎和感染性腹膜炎，以及1例巨細胞病毒引起的肺炎。此外，研究表明使用抗CD20單抗不僅不能提高生存率，還會顯著增加感染風險[23]，但是為了抑制免疫排斥反應，目前抗CD20單抗幾乎是在異種移植過程中必須使用的藥物。非全身性細菌感染也可能導致致命的結果。在一項研究中，心臟異種移植受體發(fā)生由大腸桿菌引起的縱隔炎，嚴重影響受體壽命[24]。這些結果提示我們，無論術后細菌感染病情是否可控，我們仍要積極預防并遏制其發(fā)生。

本研究中，我們從多方面對受體感染進行監(jiān)測，如胸部放射檢查、血細胞分析、血清炎性因子等，但是都存在特異性不足的問題。胸片檢查的確出現(xiàn)了肺部炎癥的征象，但是也可能是因為心臟功能差或者長時間臥床出現(xiàn)的肺水腫或滲出；血細胞分析容易受到失血、輸血的影響；血清炎癥因子在一定程度上能夠反映感染的發(fā)生，多項研究已經(jīng)證實C-反應蛋白和降鈣素原在一定程度上可以用來診斷感染的發(fā)生，并且與感染的預后存在極大的相關性[25-26]。然而需要注意的是，手術或異種移植本身所引起的全身性應激可能也是導致炎癥因子升高的原因之一。在本研究中，我們觀察到移植術后受體的白細胞、中性粒細胞和炎性因子沒有明顯升高的情況。此外肺部不良征象也通過加強肺部護理、實時的監(jiān)測和積極的治療策略調整得到控制和逆轉。

本中心從研究結果中總結了寶貴的經(jīng)驗，并制定了下一步實驗的感控規(guī)劃：首先，與專業(yè)生物檢測機構合作，對供體豬和受體猴進行術前病毒、細菌檢測及圍術期動態(tài)監(jiān)測；其次，制定參與基因編輯豬-猴異種移植的工作人員防護標準和應對暴露事件后的緊急處理預案，以及建立科學且周密的圍術期感染控制標準和可執(zhí)行性強的感染控制管理措施，包括抗生素的使用；最后，定時對受體猴的血液、體液、分泌物及各種管道、物體表面、工作人員手、空氣進行監(jiān)測和培養(yǎng)。異種心臟移植圍術期積極預防和控制感染是器官移植手術的重要環(huán)節(jié)之一，通過制定科學、周密的感染控制標準，實施集束化規(guī)范化感控管理措施，制定參與異種移植工作人員防護標準與發(fā)生暴露后的緊急處置預案，為今后開展異種心臟移植臨床試驗提供依據(jù)和借鑒。