異種肝腎聯(lián)合移植中豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測

張 虹，張 玄，陶開山，竇科峰

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 710032)

異種移植是解決同種器官移植供體短缺的有效策略之一。近年來，豬器官的應(yīng)用為心臟、腎臟、胰島等臨床前異種移植的發(fā)展提供了重要的器官來源[1]。目前原位豬腎臟異種移植受體和異位豬心臟異種移植受體最長存活時(shí)間分別達(dá)到499 d和945 d，說明臨床前豬器官異種移植研究已初具規(guī)模[2]。然而，免疫排斥反應(yīng)、炎癥和凝血功能障礙以及豬病毒的跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)是影響異種移植發(fā)展的關(guān)鍵性問題。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展和有效免疫抑制劑的出現(xiàn)，通過對供體豬進(jìn)行基因改造和使用免疫抑制劑能夠減輕受體免疫排斥反應(yīng)和炎癥及凝血障礙，延長異種受體的存活時(shí)間[3]。但豬器官的移植是否會(huì)引起人畜共患病微生物的跨物種傳播，是異種移植發(fā)展中人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。其中豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)整合在豬基因組中，被認(rèn)為是風(fēng)險(xiǎn)等級最高的病毒[4]。

PERV是由核心蛋白gag、聚合酶pol和包膜蛋白env基因組成編碼區(qū)的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，在體外能夠感染多種動(dòng)物或人的細(xì)胞，并通過遺傳傳播[5]。感染性的PERV分為3個(gè)亞類：多嗜性的PERV-A和PERV-B以及嗜生態(tài)性的PERV-C。PERV-A和PERV-B在所有豬中均表達(dá)，并能感染不同物種細(xì)胞；而PERV-C僅在部分豬中表達(dá)，且只能感染豬細(xì)胞[6]。PERV-A和PERV-C會(huì)形成具有強(qiáng)復(fù)制和特異性突變能力的重組體PERV-A/C，整合在動(dòng)物和人類細(xì)胞的基因組中[7]。此外，也有研究證明PERV在不同的組織器官中存在差異表達(dá)[8]。2019年，HEO等[9]研究發(fā)現(xiàn)異種腎臟移植術(shù)后受體膀胱中檢測到PERV序列，插入實(shí)驗(yàn)證實(shí)受體中的PERV來源于供體豬細(xì)胞，采用豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因檢測也證實(shí)了異種移植術(shù)后受體膀胱中存在豬細(xì)胞。因此，為了提高異種移植的安全性，選用PERV失活的供體或?qū)σ浦彩荏w進(jìn)行廣泛檢測具有重要意義?，F(xiàn)已有多種技術(shù)用于失活PERV，如同源重組、鋅指核酶和CRISPR/Cas9等[10]。但PERV失活的供體移植后是否已完全失去遺傳因素引起的病毒感染性，在移植過程中也需要進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。本研究以6-基因編輯豬-恒河猴異種肝腎聯(lián)合移植樣本為研究對象，檢測異種移植過程中供受體不同組織中PERV基因的表達(dá)，期望為PERV的跨物種傳播提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)采用的供體為成都中科奧格生物科技有限公司提供的健康SPF級3月齡(體質(zhì)量約8 kg)6-基因編輯(3KO·3TG)巴馬小型豬，敲除豬GGTA1、CMAH和β4GalNT2基因(3KO)，轉(zhuǎn)入人CD46、CD55和TBM基因(3TG)。受體為四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院暨四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供的10 kg成年雄性恒河猴。異種大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)原則及倫理規(guī)范，并取得空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號：20200487，20202488)。PK15細(xì)胞(CL-0187)購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

PK15專用培養(yǎng)基(CM-0187，普諾賽生物科技有限公司，中國)。總DNA提取試劑盒(DP304，天根生化科技有限公司，中國)。Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11711，艾瑞科生物工程有限公司，中國)。PremixTaqTM試劑(RR902A，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國)。SYBR GreenProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒(AG11476，艾瑞科生物工程有限公司，中國)。4S-GelRed核酸染料(A616694，生工生物工程有限公司，中國)。DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(3427A，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國)。瓊脂糖(BS081，白鯊科技有限公司，中國)。TAE溶液(50×)(BL533A，白鯊科技有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 引物序列及合成 查閱文獻(xiàn)找PERV基因序列[9]，在NCBI Primer-BLAST進(jìn)行引物序列比對。選擇合適的序列并合成引物(表1)，引物由西安擎科生物有限公司合成。

表1 檢測PERV各亞型的PCR和RT-PCR引物序列

1.2.2 PCR和RT-PCR檢測供受體中PERV各亞型基因 分別收集供受體心臟、肝臟和腎臟等不同部位的組織樣本，采用DNA提取試劑盒提取供受體組織和PK15細(xì)胞的基因組DNA(genomic DNA，gDNA)，具體實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)說明書。200 ng gDNA中加入不同PERV亞型的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。常規(guī)TRIzol法提取不同供受體組織和PK15細(xì)胞的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，600 ng cDNA中加入特異性引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增PERV基因，RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。將獲得的PCR和RT-PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PERV亞型的表達(dá)。其中PK15細(xì)胞為陽性模板，18srRNA為管家基因。

1.2.3 PCR檢測豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因 采用PCR技術(shù)檢測供受體組織中豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因的表達(dá)，200 ng gDNA中加入特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 異種肝腎聯(lián)合移植供受體中PERV基因gag和pol的表達(dá)

PERV的gag基因編碼核衣殼蛋白，pol基因編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶等，gag和pol基因是PERV產(chǎn)生的先決條件[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測了gag和pol基因在異種移植供受體組織中的表達(dá)。課題組負(fù)責(zé)人前期實(shí)施了6-基因編輯豬-恒河猴異種肝腎聯(lián)合移植大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，受體存活14 d。在移植終點(diǎn)組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)移植肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，存在片狀壞死及血栓性微血管病。將術(shù)前術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)收集的供受體組織樣本的cDNA進(jìn)行RT-PCR，瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的表達(dá)。結(jié)果顯示，gag和pol基因在供體豬的肝臟、腎臟、皮膚、脾臟、小腸和肌肉組織中表達(dá)，移植終點(diǎn)時(shí)受體的肝臟、腎臟、心臟、肺、胰腺、小腸和胃組織中均沒有檢測到gag和pol基因。上述結(jié)果表明，在異種移植14 d內(nèi)供體體內(nèi)的gag和pol基因未向受體基因組傳播(圖1)。

M：DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P：供體豬；NHP：非人靈長類受體恒河猴；NTC：陰性對照(以ddH2O為模板)；PC：陽性對照(以PK15細(xì)胞cDNA為模板)；Pre-Tx：移植前；Post-Tx：移植后。圖1 RT-PCR檢測異種肝腎聯(lián)合移植供受體不同組織中g(shù)ag和pol基因的表達(dá)

2.2 異種肝腎聯(lián)合移植供受體中PERV各亞型的表達(dá)

PERV的gag和pol基因具有高度同源性，env基因存在差異，因此將PERV分為A、B和C三個(gè)亞型[11]。提取異種移植術(shù)前和術(shù)后供受體不同組織樣本的gDNA并定量，經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果顯示：供體豬的肝臟、腎臟、皮膚、脾臟、小腸和肌肉組織中均有PERV-A和PERV-B亞型的表達(dá)，移植終點(diǎn)時(shí)受體肝臟、腎臟、心臟、肺、胰腺、小腸和胃組織中未檢出PERV-A和PERV-B亞型；而PERV-C亞型在供體豬和受體組織中均沒有檢出(圖2)。上述結(jié)果表明：在異種移植術(shù)后14 d內(nèi)，供體體內(nèi)的PERV-A和PERV-B亞型未向受體傳播。PERV-C亞型在該6-基因編輯豬中未檢測到，提示形成強(qiáng)復(fù)制能力重組體PERV-A/C亞型的可能性較小。

M：DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P：供體豬；NHP：非人靈長類受體恒河猴；NTC：陰性對照(以ddH2O為模板)；PC：陽性對照(以PK15細(xì)胞gDNA為模板)；Pre-Tx：移植前；Post-Tx：移植后。圖2 PCR檢測異種肝腎聯(lián)合移植供受體不同組織中PERV亞型的表達(dá)

2.3 異種肝腎聯(lián)合移植供受體中豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因的表達(dá)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在大量線粒體，且線粒體基因組比gDNA更適用于少量供體細(xì)胞的檢測[12]。因此，我們通過PCR技術(shù)檢測了異種移植術(shù)前術(shù)后供受體不同組織樣本DNA中豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因的表達(dá)，電泳結(jié)果顯示：豬的肝臟、腎臟等組織表達(dá)豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因，移植終點(diǎn)時(shí)受體肝臟、腎臟等組織中未檢出豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因(圖3)。上述結(jié)果表明，在異種移植術(shù)后14 d內(nèi)，供體體內(nèi)的豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因未向受體體內(nèi)傳播。

M：DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P：供體豬；NHP：非人靈長類受體恒河猴；NTC：陰性對照(以ddH2O為模板)；PC：陽性對照(以PK15細(xì)胞gDNA為模板)；Pre-Tx：移植前；Post-Tx：移植后。圖3 PCR檢測異種肝腎聯(lián)合移植供受體不同組織中豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因的表達(dá)

3 討論

人畜共患病微生物的跨物種傳播是影響異種移植發(fā)展的關(guān)鍵性因素。目前在異種移植背景下已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可能造成人畜共患病的病毒有豬巨細(xì)胞病毒/豬玫瑰病毒[13]、E型肝炎病毒[14]、PERV[15]以及豬淋巴嗜皰疹病毒[16]。豬體內(nèi)存在的大部分病毒微生物可以通過接種疫苗或抗病毒藥物、早期斷奶以及胚胎移植后無病原體等級培養(yǎng)的方法消除，但PERV是整合在豬基因組中難以通過以上方式消除的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，并且PERV的隱形感染可能會(huì)導(dǎo)致受體基因調(diào)控的改變、引發(fā)腫瘤或DNA重組[17]。因此，PERV的安全性是異種移植發(fā)展過程中人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

研究表明PERV能夠在體外感染人類細(xì)胞，并在細(xì)胞培養(yǎng)過程中整合到人類基因組中[18]。也有研究證實(shí)在異種腎移植術(shù)后受體的膀胱組織中存在PERV序列[9]。PERV的傳播速度與其亞型和病毒載量有關(guān)[19]。PERV-A和PERV-B能感染不同物種細(xì)胞，而PERV-C僅能感染豬細(xì)胞。因此，國際異種協(xié)會(huì)建議通過篩選不表達(dá)PERV-C及低表達(dá)PERV-A和PERV-B的PERV源豬群作為移植供體來降低病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)[20]。在本研究中，我們檢測了供體豬不同器官中PERV亞型的表達(dá)，結(jié)果顯示本次實(shí)驗(yàn)供體只表達(dá)PERV-A和PERV-B亞型，不表達(dá)PERV-C亞型，這提示產(chǎn)生強(qiáng)感染效率的PERV-A/C重組體的可能性很小。我們的研究結(jié)果也顯示PERV-A在豬皮膚和肌肉中的含量低于肝臟和腎臟，提示PERV亞型在不同組織器官中的表達(dá)量不同，這與PERV在不同品系的豬群和不同組織器官中的表達(dá)存在差異的報(bào)道相一致[19]。

PERV作為內(nèi)源性病毒整合在宿主基因組中能夠通過遺傳傳播，而失活的內(nèi)源性病毒在特定情況下可能會(huì)重新感染細(xì)胞，并且異種移植過程中使用免疫排斥藥物也容易引起慢性免疫抑制相關(guān)的感染以及產(chǎn)生宿主適應(yīng)性病毒的風(fēng)險(xiǎn)[21]。因此，異種移植過程中需要對PERV進(jìn)行檢測和監(jiān)控?，F(xiàn)在已有多種檢測手段用于PERV的定性及定量檢測，如PCR、RT-PCR、Southern印跡雜交及熒光原位雜交技術(shù)等。本研究采用RT-PCR和PCR的方法檢測了異種肝腎聯(lián)合移植前后供受體體內(nèi)PERV基因的表達(dá)，結(jié)果顯示PERV-A和PERV-B亞型在供體豬體內(nèi)存在，而在移植終點(diǎn)時(shí)受體體內(nèi)未檢出。PERV的gag和pol基因是病毒產(chǎn)生的先決條件。因此，我們檢測了供受體不同組織中g(shù)ag和pol的表達(dá)。結(jié)果顯示，供體豬的不同組織中均能檢測到gag和pol基因，而移植終點(diǎn)時(shí)受體組織中未檢測到gag和pol基因。研究證明實(shí)體器官移植術(shù)后在受體不同組織中存在含量較低的循環(huán)供體細(xì)胞，而線粒體基因組的檢測常被用于確定異種移植環(huán)境中是否存在循環(huán)供體細(xì)胞[12]。本實(shí)驗(yàn)中豬特異性線粒體細(xì)胞色素B基因的檢測結(jié)果證明移植術(shù)后受體中不存在循環(huán)豬細(xì)胞。以上結(jié)果均說明在6-基因編輯豬-恒河猴異種肝腎聯(lián)合移植過程中供體豬中的PERV基因均未向受體傳播。但本實(shí)驗(yàn)受體存活時(shí)間僅14 d，并不能判斷隨著異種移植時(shí)間的延長，PERV病毒是否會(huì)向受體體內(nèi)傳播，這是本實(shí)驗(yàn)的局限性。

綜上所述，PERV的跨物種傳播是豬器官應(yīng)用為異種移植供體急需解決的關(guān)鍵性問題。本研究表明在6-基因編輯豬-恒河猴的異種肝腎聯(lián)合移植的模型中，受體存活14 d內(nèi)豬體內(nèi)的PERV基因未向受體傳播。但這只是單次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，PERV基因的傳播性還需在多次異種移植實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探究。雖然目前沒有單一的方法能夠完全消除PERV理論上的風(fēng)險(xiǎn)，但是移植前篩選合適的供體豬，以及移植過程中對PERV的安全性進(jìn)行監(jiān)測對推動(dòng)實(shí)體器官異種移植的臨床應(yīng)用具有非常重要的意義。