氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型小鼠腎組織代謝組學研究

董利軍 祁慧 楊宇航 毛星星 張國明 張少沖 雷和田

深圳市眼科醫(yī)院 暨南大學附屬深圳眼科醫(yī)院 深圳市眼病防治研究所,深圳 518040

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)是一種由于視網(wǎng)膜發(fā)育障礙導(dǎo)致血管異常增生的潛在致盲眼病,早產(chǎn)兒數(shù)量的急劇增加使ROP已成為全球兒童盲的主要原因之一[1]。視網(wǎng)膜激光光凝是ROP的一線治療方案,但對Ⅰ區(qū)病變和急進型后極部ROP治療效果欠佳[2]。隨著對ROP發(fā)病機制的深入研究,玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物已經(jīng)成為一種有效治療ROP的新手段[3]。但是,有大量文獻報道了注射抗VEGF藥物產(chǎn)生的不良事件,尤其是腎相關(guān)疾病,包括蛋白尿惡化、高血壓和血管凝血事件以及腎小球相關(guān)疾病[4-7]。ROP和腎損傷是氧化應(yīng)激反應(yīng)誘發(fā)的早產(chǎn)兒典型疾病,早產(chǎn)兒極易受到氧化應(yīng)激的影響,氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡導(dǎo)致自由基水平升高,進而對器官造成氧化損傷[8]。在大鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型中,腎皮質(zhì)中VEGF-A和血小板衍生因子β的表達在出生第5天(P5)和P19時與Ⅰ期ROP和Ⅱ期ROP相似,表明高氧誘導(dǎo)腎臟生成受損的機制與ROP相似[9]。因此推測2種組織在高氧誘導(dǎo)下的病理變化可能有一定關(guān)聯(lián),而從代謝組學的角度探討OIR小鼠腎組織與血漿的代謝機制可能為相關(guān)研究和臨床工作提供新的思路。OIR模型是一種公認的研究視網(wǎng)膜新生血管疾病的動物模型[10-11]。OIR模型的高通量轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)大量的分子網(wǎng)絡(luò)和潛在的治療靶點[12-14]。然而,許多生命活動發(fā)生在代謝物層面,如細胞信號釋放、能量傳遞、細胞間通信等都受代謝物調(diào)控[15]。因此,可通過代謝組學分析來識別疾病的病理過程[16]。代謝組學已廣泛應(yīng)用于ROP及其他視網(wǎng)膜病理性新生血管增生類疾病的研究中,如增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體液和ROP患者血漿[11,17]、OIR動物模型血漿及視網(wǎng)膜等樣本中代謝產(chǎn)物的差異研究等[18]。然而,臨床研究和實驗研究發(fā)現(xiàn)氧代謝相關(guān)疾病可同時引起眼部和腎組織相似反應(yīng),但ROP與早產(chǎn)兒高氧導(dǎo)致腎損傷的機制研究很少,其致病機制是否也相似需進一步證實。本研究擬采用非靶向代謝組學方法分析OIR小鼠腎勻漿的代謝產(chǎn)物變化,結(jié)合OIR小鼠靶向代謝組學的的方式探討高氧導(dǎo)致的腎損傷及ROP病理性新生血管形成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 取16只7日齡健康SPF級C57/B6J小鼠及相應(yīng)母鼠,小鼠雌雄不限,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京)2016-0006]。采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為OIR組和正常對照組,每組8只,采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)小鼠,飼養(yǎng)于北京大學深圳研究生院實驗動物中心SPF級實驗室[SYXKC(粵)2017-0172]。動物飼養(yǎng)及使用均嚴格按照暨南大學倫理委員會要求,研究方案經(jīng)暨南大學倫理委員會審核批準(批文號:20200401-54)。

1.1.2主要試劑及儀器 甲醇、甲酸、乙腈(北京索萊寶科技有限公司);L-2-氯苯丙氨酸、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、4%多聚甲醛、Triton X-100、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(廣州哲泰生物科技有限公司);異凝集素(Isolectin B4,IB4)(美國賽默飛世爾科技有限公司);抗熒光淬滅封片劑(北京索萊寶科技有限公司)。動物氧箱(YCP1600,長沙華曦電子科技有限公司);全自動樣品快速研磨儀(Wonbio-E,上海萬柏生物科技有限公司);臺式高速冷凍離心機(TGL-16MS,上海盧湘儀離心機儀器有限公司);冷凍濃縮離心干燥器(LNG-T98,太倉市華美生化儀器廠);超聲波清洗機(F-060SD,深圳福洋科技集團有限公司);QEplus高分辨質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技公司);ACQUITY UPLC I-Class plus高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm色譜柱(美國Waters公司);AX激光掃描共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1OIR小鼠模型的建立 取OIR組小鼠,根據(jù)參考文獻[19]中OIR的方法制備OIR模型,自P8起,將小鼠及其母鼠置于(75±2)%的動物氧箱中,每隔2 d更換墊料、飼料、水和母鼠,高氧環(huán)境下連續(xù)飼養(yǎng)5 d后(P12)更換至正常環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5 d(P17)。正常對照組8只小鼠于正常環(huán)境飼養(yǎng)至出生后第17天(P17)。

1.2.2小鼠視網(wǎng)膜鋪片IB4染色觀察視網(wǎng)膜血管增生情況 根據(jù)參考文獻[20]中的方法,各組小鼠于P17行CO2安樂死,取出小鼠視網(wǎng)膜后用PBS清洗血漬,吸水紙吸去多余水分,置于4%多聚甲醛中固定30 min,轉(zhuǎn)移至0.5% Triton X-100中破膜過夜,PBS清洗3次并于體視顯微鏡下清除黏附雜質(zhì),轉(zhuǎn)移至1%BSA溶液稀釋的IB4染色劑(1∶200)中避光孵育過夜。將染色后的視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移至凹形載玻片,并于視網(wǎng)膜中心3:00、6:00、9:00、12:00方向1 mm處切開分成4個象限平鋪于載玻片上,避光滴加4 ℃預(yù)冷的冰甲醇固定10 min,重復(fù)操作2次。預(yù)冷PBS漂洗3次后吸干多余PBS,滴加抗熒光淬滅封片劑封片后用激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.2.3小鼠血漿氨基酸類代謝物的靶向代謝組學分析 各組小鼠于P17通過眼眶內(nèi)眥靜脈采血500 μl,采集的血液存放于EDTA抗凝管內(nèi),離心半徑10 cm,4 ℃下3 000 r/min離心10 min,取上清血漿保存于-80 ℃中,用于靶向代謝組學測定。4 ℃條件下融化血漿樣品,在100 μl血漿樣品中加入400 μl無水乙腈,劇烈振蕩30 s,室溫下靜置10 min,4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min,收集上清液,用0.22 μm濾膜過濾,取150 μl濾液進行靶向代謝組學測定。儀器參數(shù)設(shè)置如下:流動相為80%乙腈(15.4 mol/L)的等溫洗脫;流速為140 μl/min。中性氨基酸采用中性損失掃描進行掃描,中性損失片段的質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio,m/z)為102 Da,掃描范圍為m/z 140到m/z 280。酰基肉堿分析采用前體掃描方法進行,子離子為m/z 85 Da片段,掃描范圍為m/z 210到m/z 502。甘氨酸、鳥氨酸、精氨酸和檸檬酸采用多反應(yīng)監(jiān)測。

1.2.4液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測小鼠腎組織中代謝物 用CO2將小鼠安樂死,用滅菌手術(shù)剪及鑷子開腹并取出腎組織,用預(yù)冷PBS洗去血漬,吸干表面水漬,裝入無菌EP管,用液氮速凍15 min,于-80 ℃保存。取30 mg小鼠腎組織置于1.5 ml EP管中,分別加入20 μl含0.06 mg/ml的L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液和400 μl 80%甲醇溶液,置于-20 ℃中預(yù)冷2 min后用功率為60 Hz的研磨機研磨2 min,置于冰水中超聲(超聲功率500 W,頻率40 kHz)提取10 min,于-20 ℃中靜置30 min。4 ℃條件下13 000 r/min離心10 min,取300 μl上清液裝入LC-MS進樣小瓶中揮干,用300 μl體積分數(shù)20%甲醇渦旋30 s,超聲3 min進行復(fù)融,-20 ℃靜置2 h,4 ℃條件下13 000 r/min離心10 min,取150 μl上清液,用0.22 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)入進樣小瓶,進行液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)檢測。所有樣本的提取液等體積混合制備成質(zhì)控樣本。

采用ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 um)色譜柱,保持柱溫為45 ℃,進樣體積為2 μl;流動相中水相為0.1%甲酸水溶液,有機相為含有0.1%甲酸的乙腈溶液,流速為0.35 ml/min。采用梯度洗脫:0.01～2 min,5%有機相;2～4 min,5%～30%有機相;4～8 min,30%～50%有機相;8～10 min,50%～80%有機相;10～14 min,80%～100%有機相;14～15 min,100%有機相;15～15.1 min,100%～5%有機相;15.1～16 min,5%有機相。樣品質(zhì)譜信號采集采用正負離子掃描模式,離子源為電噴霧電離離子源(ESI),正負離子噴霧電壓分別設(shè)定為3 800 V和-3 000 V,正負離子輔助鞘氣流速和輔助氣體流量分別設(shè)定為40 Arb、10 Arb和35 Arb、8 Arb。毛細管溫度為320 ℃,輔助燃氣加熱器溫度為350 ℃,質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 200 Da,全毫秒分辨率和MS/MS分辨率為70 000和17 500,階梯式NCE梯度為10、20、40 eV。

1.2.5采用生物信息學法分析腎組織中的差異代謝物 采用代謝組學處理軟件Progensis QI v2.3對LC-MS獲得的原始數(shù)據(jù)進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化,根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)(誤差小于5個ppm)、二級碎片以及同位素分布對化合物進行鑒定,采用METLIN、Lipidmaps(v2.3)和人代謝組學數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database,HMDB)及上海鹿明生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫進行定性分析。根據(jù)化合物定性結(jié)果評分對提取的數(shù)據(jù)進行篩選,將高于36分的化合物合并成1個包含保留時間、m/z、峰強度和樣品信息的數(shù)據(jù)矩陣。

對數(shù)據(jù)矩陣進行分析,首先采用無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis,PCA)來觀察各組腎組織樣本之間的總體分布和整個分析過程的穩(wěn)定性;然后采用有監(jiān)督的偏最小二乘法分析(partial least-squares-discriminant analysis,PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析(orthogonal partial least-squares-discriminant analysis,OPLS-DA)區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異,在此過程中用參數(shù)R2X、解釋率R2Y和預(yù)測率Q2進行質(zhì)量評價,采用7次循環(huán)交互驗證和200次響應(yīng)排序檢驗(response permutation testing,RPT)法考察模型質(zhì)量,防止模型過擬合。根據(jù)OPLS-DA模型得到變量權(quán)重值(variable importance of projection,VIP),以VIP>1為篩選條件評估2個組之間有差異的代謝產(chǎn)物及其倍數(shù)變化(fold change,FC)。

1.2.6腎組織代謝產(chǎn)物KEGG富集通路分析 對篩選得到的差異代謝物利用其KEGG ID在KEGG(http://www.kegg.jp)數(shù)據(jù)庫進行富集分析,應(yīng)用超幾何檢驗,找出與整個背景相比,在顯著性差異表達代謝物中顯著富集的代謝通路,以P≤0.05為閾值,滿足此條件的代謝通路為在差異代謝物中顯著富集的代謝通路,P值越小,則該代謝通路的富集越顯著。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 2個組小鼠視網(wǎng)膜血管分布及無灌注區(qū)相對面積比較

視網(wǎng)膜鋪片IB4染色結(jié)果顯示,正常對照組P17小鼠視網(wǎng)膜血管均勻分布于整個視網(wǎng)膜,血管走行正常;OIR組小鼠視網(wǎng)膜中央出現(xiàn)大面積的無灌注區(qū),與血管區(qū)界限明顯,其分界處形成大量新生血管簇,血管走行紊亂(圖1)。OIR組視網(wǎng)膜無灌注區(qū)相對面積為(25.16±3.50)%,明顯大于正常對照組的(0.63±0.30)%,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.07,P<0.001)。

圖1 2個組小鼠視網(wǎng)膜血管分布及定量分析(標尺=500 μm,IB4) A:正常對照組小鼠視網(wǎng)膜血管分布正常 B:OIR組小鼠視網(wǎng)膜血管迂曲,中央?yún)^(qū)可見大面積無灌注區(qū)

2.2 2個組小鼠腎組織差異代謝產(chǎn)物差異及其倍數(shù)比較

PCA結(jié)果顯示,OIR組與對照組小鼠的腎組織樣本主成分PC1和PC2上投影的得分在坐標軸上相距較遠,樣本之間總體區(qū)分明顯。OPLS-DA模型中R2X cum為0.578,R2Y cum為0.978,Q2 cum為0.857,均大于0.5,表明該模型與數(shù)據(jù)擬合良好,具有較好的預(yù)測能力。循環(huán)交互驗證和RPT驗證OPLS-DA模型中的R2和Q2分別為0.9和-0.488,所有R2和Q2均低于原始值,表明模型不存在過度擬和。OPLS-DA評分圖顯示,OIR組和正常對照組代謝產(chǎn)物分別位于模型投影左側(cè)和右側(cè)且相距較遠,表明2個組間小鼠代謝產(chǎn)物明顯不同(圖2)。

圖2 2個組小鼠腎組織代謝產(chǎn)物分析圖 A:PCA表達的代謝產(chǎn)物總體分布圖 B:OPLS-DA測試的代謝輪廓圖 C:RPT的反應(yīng)排序圖 藍色矩形和紅色三角分別代表正常對照組小鼠腎組織樣本和OIR組腎組織小鼠樣本

OPSL-DA模型載荷圖顯示,代謝物磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)、左旋異亮氨酸、左旋組氨酸、2-羥基苯丙烯酸權(quán)重較大,可能是缺氧條件下導(dǎo)致血管增生的主要因子,而OPLS-DA S-plot圖顯示,PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)、左旋異亮氨酸與主成分具有良好的相關(guān)性(圖3)。

圖3 2個組小鼠腎組織代謝產(chǎn)物OPLS-DA模型的載荷圖和S-plot圖 A:載荷圖 圖中每個點代表一種代謝物,代謝物距離載荷圖中心的距離越遠,載荷值越接近于-1或1,即該代謝產(chǎn)物作用愈大 B:S-plot圖 橫坐標是組間比較的代謝產(chǎn)物與影響的特征值,縱坐標是代謝產(chǎn)物得分。代謝產(chǎn)物越靠近右上角和左下角,表示組間差異越顯著

依據(jù)OPLS-DA模型第一主成分VIP>1為篩選標準,共篩選出組間差異代謝物236個,其中表達上調(diào)134個,下調(diào)102個(圖4)。

圖4 2個組小鼠腎組織差異代謝產(chǎn)物火山圖 圓點越大提示VIP值越大,VIP值≥1且遠離坐標軸原點者為優(yōu)先考慮的潛在生物標志物 VIP:變量權(quán)重值;FC:倍數(shù)變化

2.3 2個組小鼠腎組織差異代謝物的鑒定及分層聚類分析

對篩選的VIP值>1結(jié)合t檢驗中P<0.05的差異代謝產(chǎn)物標準在HMDB、Lipidmaps、METLIN以及自建庫進行比對鑒定,得到26種有意義的化合物(表1)。OIR組小鼠腎組織中甘油磷脂類化合物PC 20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0∶0和PC22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0代謝產(chǎn)物表達上調(diào),PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)和PE P-18∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])代謝產(chǎn)物表達下調(diào)。氨基酸類代謝物精氨酸、鳥氨酸、哌可酸和羥基賴氨酸代謝產(chǎn)物水平升高。

表1 2個組小鼠腎組織中主要差異代謝產(chǎn)物比較Table 1 Comparison of main differential metabolites in mouse kidney tissue between OIR group and normal control group代謝物分子式VIPLog2(FC)P值PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)C42H78NO8P23.10-0.76a<0.000 1PE P-18∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])C43H78NO8P21.87-0.92a0.000 5L-isoleucineC6H13NO221.590.26b0.000 53,4-dihydro-2H-1-benzopyran-2-oneC9H8O220.680.25b0.000 42-hydroxycinnamic acidC9H8O313.310.16b0.004 4L-histidinolC6H11N3O12.82-0.15a0.000 4PC 20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0∶0C28H50NO7P11.380.27b0.000 8PC 22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0C30H50NO7P10.890.38b0.001 7L-pipecolic acidC6H11NO29.080.28b0.000 3L-histidineC6H9N3O24.960.25b<0.000 1phosphoglycolic acidC2H5O6P3.910.10b0.000 4oxypurinolC5H4N4O23.890.32b0.001 2guanosineC10H13N5O53.49-0.74a0.000 2L-ornithineC5H12N2O23.470.46b0.001 015-methylpalmitateC17H34O22.89-0.14a0.000 3N-acetylmannosamineC8H15NO62.630.28b0.002 05-hydroxylysineC6H14N2O32.290.53b0.000 3guanineC5H5N5O2.21-0.70a0.000 12,6,8,12-tetramethyl-2,4-tridecadien-1-olC17H32O2.12-0.16a0.001 6N-acetyl-D-glucosamineC8H15NO61.840.37b0.000 3L-arginineC6H14N4O27.330.28b0.001 1L-glutamineC5H10N2O31.680.75b0.004 5hypoxanthineC5H4N4O9.430.13b0.010 0L-prolineC5H9NO210.700.22b0.003 9adenosine monophosphateC10H14N5O7P2.05-0.27a0.033 8adenosineC10H13N5O42.01-0.40a0.045 3 注:P值表示富集顯著性 a:下調(diào)產(chǎn)物;b:上調(diào)產(chǎn)物 VIP:變量權(quán)重值;FC:倍數(shù)變化 Note:P value indicated enrichment significance a:down-regulation of expression;b:up-regulation of expression VIP:variable importance of projection;FC:fold change

分層聚類分析結(jié)果顯示,相較于正常對照組,OIR組腎組織中氨基酸類代謝物精氨酸、鳥氨酸、哌可酸、脯氨酸和羥基賴氨酸含量及甘油磷脂類化合物PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)、PE P-18∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])含量均明顯升高,PC 20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0∶0、PC 22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0含量及嘌呤類(鳥嘌呤、羥嘌醇)和脂肪酸類(15-棕櫚酸甲酯、2,6,8,12-tetramethyl-2,4-tridecadien-1-ol)含量均降低(圖5)。

圖5 2個組小鼠主要差異代謝產(chǎn)物聚類熱圖 垂直軸代表代謝產(chǎn)物,水平軸代表不同樣本組。紅色表示代謝產(chǎn)物含量最高,藍色表示含量最低,軸上的分叉越近說明相似度越高 OIR:氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變;WT:野生型

2.4 2個組小鼠腎組織中差異代謝產(chǎn)物KEGG通路富集

差異代謝物KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,差異代謝產(chǎn)物的前10個富集通路主要涉及ABC轉(zhuǎn)運蛋白、嘌呤代謝、癌癥中的膽堿代謝、氨酰-tRNA生物合成、mTOR信號通路、精氨酸生物合成、蛋白質(zhì)消化吸收、嗎啡成癮、癌癥中的中心碳代謝、cGMP-PKG信號通路(圖6)。

圖6 2個組小鼠主要差異代謝產(chǎn)物排名前20 KEGG富集通路氣泡圖 富集因子越大,提示富集程度越高;氣泡點越大,說明該通路上發(fā)生變化的代謝物越多

2.5 小鼠血漿氨基酸類代謝產(chǎn)物的靶向鑒定

根據(jù)VIP值結(jié)合t檢驗P<0.05的標準對小鼠血漿氨基酸類代謝產(chǎn)物在HMDB、Lipidmaps、METLIN以及自建庫比對鑒定得到11種具有明顯差異的主要氨基酸類代謝物。與正常對照組比較,OIR組小鼠血漿內(nèi)天冬酰胺和丁酰肉堿的代謝水平降低,纈氨酸、酪氨酸、亞油基肉堿、半胱氨酸、十四碳二烯酰肉堿、丙氨酸、瓜氨酸、色氨酸和癸二烯酰肉堿的代謝水平明顯升高(表2)。KEGG通路分析表明,這些代謝產(chǎn)物主要富集在氨酰-tRNA生物合成,精氨酸生物合成,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,泛酸和CoA生物合成,癌癥中的中心碳代謝,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解,ABC轉(zhuǎn)運蛋白等信號通路(圖7)。

圖7 2個組小鼠血漿主要差異代謝產(chǎn)物聚類熱圖和KEGG通路分析 A:小鼠血漿主要差異代謝產(chǎn)物聚類熱圖 B:代謝通路富集圖 WT:野生型;OIR:氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變

3 討論

ROP是一種以視網(wǎng)膜缺血、病理性新生血管形成為特點,發(fā)生于早產(chǎn)兒和低出生體重兒的不可逆致盲視網(wǎng)膜病變,主要特征是玻璃體中VEGF表達水平上調(diào),但其具體發(fā)病機制尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn),大鼠OIR模型中同時存在高氧誘導(dǎo)的腎生成受損機制,認為其可能是由活性氧和VEGF-A引起的微血管生成改變所致[9]。VEGF在維持正常腎功能方面也起著至關(guān)重要的作用,從足細胞釋放的VEGF與腎小球毛細血管上的VEGF受體2相互作用,促進內(nèi)皮孔的完整性和維持由此產(chǎn)生的腎小球屏障功能[21],而缺氧會誘導(dǎo)VEGF分泌,充足和適量VEGF的產(chǎn)生和血管生成對腎臟和眼組織正常功能的維持是必要的,但高水平的VEGF會導(dǎo)致血管過度生成,從而導(dǎo)致ROP、糖尿病視網(wǎng)膜病變和腎病等的發(fā)生[22-24]。而以O(shè)IR小鼠為研究對象,用代謝組學的方法探尋高氧導(dǎo)致腎損傷的機制,可以從人體的整合醫(yī)學角度為ROP的發(fā)病機制研究提供新的思路。

本研究中,OIR小鼠腎組織勻漿中氨酰-tRNA生物合成相關(guān)的代謝物表達增多。已有研究顯示,ROP患者和OIR模型大鼠的血漿中、OIR模型小鼠的視網(wǎng)膜勻漿中氨酰-tRNA生物合成通路代謝物發(fā)生變化[17,20,25]。同時有研究報道白內(nèi)障合并糖尿病患者房水中氨酰-tRNA生物合成通路代謝物發(fā)生變化[26]。在秀麗隱桿線蟲的正向遺傳篩選得到的編碼氨酰-tRNA合成酶的基因合成酶的rrt-1,敲除rrt-1和大多數(shù)其他編碼氨酰-tRNA合成酶的基因,可以使動物免于缺氧誘導(dǎo)的死亡[27]。因此,高氧誘導(dǎo)腎損傷的發(fā)病可能與氨酰-tRNA的生物合成有關(guān)。

表2 OIR組與正常對照組小鼠血漿主要氨基酸類差異代謝物比較Table 2 Comparison of differential amino acid metabolites in mouse plasma between OIR group and control group代謝物分子式VIPLog2FCP值asparagineH2NCOCH2CH(NH2)CO2H3.21-0.28a0.003 7 valine(CH3)2CHCH(NH2)CO2H2.620.62b0.000 7tyrosine4-(HO)C6H4CH2CH(NH2)CO2H2.541.04b0.000 7linoleylcarnitineC25H45NO42.430.66b0.000 5cysteineHSCH2CH(NH2)CO2H2.320.61b0.002 6butyrylcarnitineC11H21NO42.26-0.58a0.002 8tetradecadienoylcarni-tineC21H41NO42.160.84b<0.000 1alanineC3H7NO21.840.99b0.001 3citrullineC6H13N3O31.700.24b0.004 2 tryptophanC11H12N2O21.320.39b0.004 3decadienoylcarnitineC17H29NO41.070.20b0.046 9 注:a:下調(diào)產(chǎn)物;b:上調(diào)產(chǎn)物 OIR:氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變;VIP:變量權(quán)重值;FC:倍數(shù)變化 Note:a:down-regulation of expression;b:up-regulation of expression OIR:oxygen-induced reti-nopathy;VIP:variable importance of projection;FC:fold change

本研究中,OIR組小鼠腎組織勻漿中精氨酸、鳥氨酸、谷氨酸和脯氨酸表達增多,這4種氨基酸是“精氨酸和脯氨酸代謝途徑”的重要組成部分。Lu等[18]認為精氨酸和脯氨酸代謝是造成大鼠血管增生的主要途徑。Wang等[28]研究結(jié)果表明,GCN2/ATF4通路通過氨基酸介導(dǎo)的VEGF表達促進腫瘤生長和血管生成,而限制氨基酸通過GCN2/ATF4途徑誘導(dǎo)血管生成能夠調(diào)節(jié)VEGF和H2S的產(chǎn)生[29]。此外,氨基酸剝奪能夠誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株VEGF的表達[30]。因此,氨基酸及其相關(guān)途徑可能在高氧誘導(dǎo)腎損傷的發(fā)病中發(fā)揮重要作用,而在OIR小鼠血漿樣本靶向氨基酸代謝組學中,精氨酸生物合成通路同樣富集大量差異代謝物,表明在高氧誘導(dǎo)下腎損傷與視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制可能具有相似性。進一步的研究需要揭示氨基酸代謝的功能和機制以及這些交叉參與的途徑在視網(wǎng)膜新生血管中的作用。

本研究結(jié)果還顯示,OIR組小鼠血漿中蛋白質(zhì)的消化與吸收通路發(fā)生改變,與既往對ROP患者血漿和OIR小鼠視網(wǎng)膜的代謝組學分析結(jié)果一致[17-18,31]。蛋白質(zhì)的消化和吸收在促進早產(chǎn)兒發(fā)育和降低早產(chǎn)兒患病風險方面起著重要作用[32]。本研究還發(fā)現(xiàn)OIR小鼠腎勻漿中的ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)代謝產(chǎn)物大量富集,ABC轉(zhuǎn)運蛋白是在長期進化中形成的高度保守的一大基因家族編碼的一類跨膜蛋白,含有負責多種底物跨細胞膜運輸?shù)哪さ鞍住＿@些底物包括代謝產(chǎn)物、藥物、毒素、內(nèi)源性脂類、多肽、核苷酸和甾醇[33]。在低氧狀態(tài)下,已證實其對P-糖蛋白編碼基因(ABCB1)的調(diào)節(jié)作用[34]。而ABCA1基因也在低氧誘導(dǎo)下在內(nèi)皮細胞中表達[35],其已經(jīng)被證實能夠通過介導(dǎo)ABCA1基因表達來抑制黑色素瘤血管生成和發(fā)展[36]。

同時本研究還發(fā)現(xiàn),OIR小鼠腎組織嘌呤代謝途徑中代謝物發(fā)生變化,而在ROP相關(guān)的代謝物研究中未見報道,而嘌呤代謝途徑可能與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[37]。本研究中代謝物腺苷含量降低,次黃嘌呤和黃嘌呤含量升高,嘌呤代謝循環(huán)中,腺苷被轉(zhuǎn)化成腺嘌呤,然后脫氨形成肌苷,肌苷被轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤,次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下被轉(zhuǎn)化為黃嘌呤,黃嘌呤也是黃嘌呤氧化酶的底物,可增加超氧化物的生成。而超氧化物能夠刺激機體新生血管生成[38]。

總之,本研究確定了OIR小鼠腎組織勻漿中代謝譜的變化。通過生物信息學分析,ABC轉(zhuǎn)運蛋白、嘌呤代謝途徑、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成和蛋白質(zhì)的消化與吸收是與發(fā)生改變的代謝物相關(guān)的主要KEGG途徑。這些代謝物以及涉及的代謝途徑,可能參與了腎損傷和視網(wǎng)膜新生血管疾病的病理過程。然而本研究中未能同時綜合分析OIR小鼠血漿、視網(wǎng)膜以及腎勻漿樣本代謝產(chǎn)物,不利于發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的腎損傷和ROP發(fā)病機制之間的關(guān)聯(lián),還要通過化合物誘導(dǎo)以及基因敲除的方式在后續(xù)研究中對本研究篩選到的代謝物以及代謝通路進行驗證,進一步探討其具體的作用機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明董利軍:參與醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、文章撰寫;祁慧、楊宇航、毛星星:參與實施研究、采集數(shù)據(jù);張國明、張少沖:參與實驗設(shè)計及論文指導(dǎo);雷和田:參與實驗設(shè)計、論文審閱及定稿