磁性細胞分選技術的應用與生物學評價*

洪甜 李靜雯 李仁愛 陳爾凝 趙璐璐 杜美紅**

（1）北京市科學技術研究院分析測試研究所（北京市理化分析測試中心），北京 100094；2）北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京 100094）

磁性細胞分選技術首次應用于1977年，Molday等［1］使用偶聯(lián)異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ⅠTC）的磁珠成功分選出了人紅細胞和小鼠脾臟B淋巴細胞。隨后，1994年，Büsch等［2］通過兩級磁分選的方法從11例孕婦外周血樣本中檢測到7例（妊娠12~25周）胎兒細胞包含父系等位基因，1998年，Gomez等［3］使用凝集素涂層的磁珠分離出了肝內(nèi)皮細胞。隨著磁性細胞分選技術的逐漸成熟，德國美天旎磁性細胞分選技術已經(jīng)成為磁性細胞分選領域的金標準［4］。流式細胞分選對設備要求較高、對細胞刺激較大，且只有107/h的分選速度，而磁性細胞分選簡單快速，分選速度可達到109/h［5］。磁性細胞分選的優(yōu)勢表現(xiàn)在它能夠獲得高得率、高純度、高活率的目標細胞，且目標細胞可用于培養(yǎng)分析、血液回輸、流式分析等，是目前試驗研究和臨床研究應用中獲得單一的純化細胞的最為重要的一項技術手段。

本文對磁性細胞分選方法現(xiàn)狀進行綜述，并對磁性分選的細胞提出了生物學評價。

1 磁性細胞分選

細胞分選是指從全血、組織或者多細胞懸液中分離純化目標細胞。分選方法主要有兩種，一種是通過流式細胞儀對標記有特異性熒光的細胞進行分選，一種是通過免疫磁珠進行磁性分選。磁性細胞分選的主要原理是細胞通過生物活性分子連接到具有超順磁性的磁珠上，在磁場的作用下，被磁珠標記的細胞滯留在磁場中，未被標記的細胞會流出或被吸出從而被收集，當去除磁場后，被標記的細胞可被洗脫收集，由此目標細胞和非目標細胞得以分離。

磁性細胞分選的方法主要有3種：外源性磁珠標記如磁珠表面偶聯(lián)抗體、內(nèi)源性磁矩如含鐵元素的紅細胞、磁珠通過細胞封裝內(nèi)化如巨噬細胞吞噬磁珠。一般所說的磁性細胞分選是指采用外源性磁珠標記的方法進行細胞分選。目前市場上應用于細胞分選的磁珠主要有兩種，一種是1~50 nm的小粒徑磁珠，如美天旎的50 nm磁珠；一種是100 nm~50 μm的大粒徑磁珠，如Dynabeads的1 μm、2.8 μm、4.5 μm磁珠。

2 磁性細胞分選技術的分類及其應用

2.1 磁性細胞分選技術的分類

磁性細胞分選所用的磁珠一般是以氧化鐵為核心，外層經(jīng)過生物活性分子修飾的具有超順磁性的納米或微米顆粒［6-7］。從標記方法進行分類可以分為兩類：直接標記和間接標記，直接標記的生物活性分子修飾主要是單克隆抗體修飾，間接標記的生物活性分子修飾主要包括抗免疫球蛋白、抗生物素、鏈霉親和素（或改性鏈霉親和素）、抗熒光素修飾等。從磁珠是否可以被解離方面分為3類：只解離磁珠、同時解離磁珠和抗體，以及不可被解離。從分選方法方面分為4類：陽性細胞分選、陰性細胞分選、去除細胞分選和多級細胞分選。以下重點從分選方法分類進行闡述。

2.1.1 陽性細胞分選

陽性細胞分選是指磁珠結(jié)合目標細胞從而使其從混合物中分離出來的方法，在進行陽性細胞分選時，有直接標記和間接標記兩種方法。直接標記時，磁珠標記有能夠特異性識別目標細胞的抗體，磁珠上的抗體與目標細胞結(jié)合后，在磁場的作用下，目標細胞被滯留在磁場中，非目標細胞在懸液中可被丟棄或用于其他試驗，當撤去磁場時，目標細胞被洗脫收集。間接標記時，當目標細胞標記有熒光素，磁珠標記有抗熒光素，通過熒光素和抗熒光素的結(jié)合使磁珠和目標細胞結(jié)合在一起，在磁場的作用下，磁珠與目標細胞復合物被滯留，撤去磁場時目標細胞被洗脫收集。圖1左為用磁性介質(zhì)表面偶聯(lián)抗EpCAM抗體，靶向循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）表面的EpCAM抗原對CTC進行陽性富集［8］。

Fig. 1 Positive and negative sorting of circulating tumor cells［8］圖1 循環(huán)腫瘤細胞的陽性分選和陰性分選策略［8］

陽性細胞分選技術應用非常廣泛：不僅可以有效檢測外周血中的CTC［9］，還可以有效檢測外周血中的播散腫瘤細胞［10］；用于分選人單核細胞［11］、人心肌細胞［12］、人血液中黑色素瘤細胞［13］、產(chǎn)婦臍帶血CD34+細胞［14］等；用于從母體血液細胞中分離胎兒細胞［15］；用于馬CD14+單核細胞的富集，分選前馬外周血中CD14+細胞比率為5.5%，分選后CD14+單核細胞純度能達到98.33%，分選前外周血細胞活率為91%，分選后CD14+單核細胞活率為96.97%［16］；用于寬吻海豚嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的分選［17］；在輔助生殖技術方面，陽性細胞分選有助于分選DNA斷裂率較低且染色體含量不平衡的精子［18-19］；根據(jù)膜聯(lián)蛋白V與磷酯酰絲氨酸結(jié)合的特性，磁珠表面包被膜聯(lián)蛋白V來識別凋亡的精子，此技術可以用來分選非凋亡的精子以提高精子質(zhì)量［20-21］。

2.1.2 陰性細胞分選

陰性細胞分選是指磁珠結(jié)合非目標細胞從而使目標細胞從混合物中分離出來的方法，陰性細胞分選需要磁珠和非目標抗體混合物，該抗體混合物能夠特異性識別非目標細胞。抗體混合物與磁珠的組合有2種。a. 抗體混合物標記有生物素［22］，磁珠標記有鏈霉親和素（或者改性的鏈霉親和素），生物素化的抗體混合物結(jié)合非目標細胞，磁珠上的鏈霉親和素與抗體上的生物素結(jié)合，在磁場作用下，非目標細胞被滯留在磁場中，目標細胞懸浮在液體中可被收集。b. 抗體混合物標記有小鼠抗人的ⅠgG抗體，磁珠標記有人抗小鼠ⅠgG的抗體，可以識別所有小鼠ⅠgG亞種，小鼠抗人的ⅠgG抗體混合物結(jié)合非目標細胞，磁珠上的人抗小鼠ⅠgG的抗體與小鼠抗人的ⅠgG抗體結(jié)合，在磁場作用下，非目標細胞被滯留在磁場中，目標細胞懸浮在液體中可被收集。表1為幾種常見的淋巴細胞亞群陰性分選的抗體混合物方案。

Table 1 Several antibody mixtures for negative sorting of lymphocyte subsets表1 幾種常見的淋巴細胞亞群陰性分選的抗體混合物方案

陽性分選與陰性分選是細胞分選中的基本技術，兩種技術各具特點：相較于陽性細胞分選，陰性細胞分選的優(yōu)點是能夠獲得更大量的目標細胞，且目標細胞沒有接觸磁珠，因而對目標細胞的損傷很小，對于后續(xù)的功能分析和應用幾乎沒有任何影響，而陰性細胞分選的缺點是得到的目標細胞會混有其他未知細胞或碎片［23］。Bhattacharjee等［24］通過對比陽性分選和陰性分選得到的CD14+單核細胞的活化和增殖能力時，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)6 d后，磁珠依然附著在陽性分選得到的細胞上，導致細胞對脂多糖的敏感性受損，活化和增殖較差，而陰性分選得到的細胞則沒有出現(xiàn)該種情況。圖1右為磁性介質(zhì)表面偶聯(lián)抗CD45抗體，靶向非癌細胞表面的CD45抗原對CTC進行陰性富集，對于陰性富集，獲得的癌細胞是無標簽的異質(zhì)性的CTC［8］。

2.1.3 去除細胞分選

去除細胞分選是指磁珠結(jié)合某一種特定的細胞類型從而從混合物中去除該特定的細胞類型。如圖2a所示，黑色實心圓代表被磁珠結(jié)合的非目標細胞，空心圓代表目標細胞，在磁場的作用下，未被標記的目標細胞被收集。有研究表明，當磁珠附著在陽性分選的T細胞表面時，即使在培養(yǎng)2周后，大多數(shù)處于無增殖或有限增殖狀態(tài)的陽性T細胞仍保持磁性，只有在經(jīng)過多次細胞分裂才能稀釋進而失去磁珠的磁性［25］，因此當目標細胞不能帶有磁性時，更好的分選方法是選擇陰性細胞分選，或者從目標細胞組分中去除特定的非目標組分。非解離型的陽性細胞分選也可用于去除細胞群中的特定細胞。從外周血中去除CD45陽性細胞以研究腎細胞癌的循環(huán)腫瘤細胞［26］，從外周血中去除CD24+未成熟的胸腺細胞來富集iNKT細胞［27］，從外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中去除CD3+ T細胞以純化NK細胞［28］，去除紅細胞中的網(wǎng)織紅細胞［29］。在防止移植物抗宿主病的研究過程中可以通過去除CD3+ T細胞［30］或者活化誘導抗原的表達來去除活化的細胞［31］。因為去除特定的細胞類型方法的去除效率不能達到百分之百，所以仍然會混有極少量的特定細胞。在細胞治療凈化的過程中，雖然通過去除分選不能完全去除未分化的人胚胎干細胞，但是聯(lián)用細胞毒性抗體mAb后可以達到99.1%~100%去除［32］。

Fig. 2 Depletion and sequential cell isolation圖2 去除細胞分選和多級細胞分選策略

2.1.4 多級細胞分選

多級分選是指經(jīng)過多次分選得到目標細胞，當目標細胞數(shù)量較少，或目標細胞的特異性標志物表達量低，或需要經(jīng)過多個標志物的共同表征才能標記目標細胞時就會使用到多級分選。多級分選一般會陽性分選、陰性分選、去除分選聯(lián)用。先進行去除細胞分選再進行陽性細胞分選（圖2b）。為了獲得PBMC中的嗜堿性粒細胞，第一步先陰性分選去除非嗜堿性粒細胞，第二步陽性分選得到CD123+的嗜堿性粒細胞［33］。Werner等［34］從外周血單個核細胞中用磁性細胞分選的方法首先分選出CD34-細胞，再從CD34-細胞中分選出CD4+輔助性T細胞、CD8+細胞毒性T細胞、CD14+單核細胞、CD19+ B細胞、CD56+ NK細胞，通過檢測這些淋巴細胞亞群的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)單次耐力訓練可顯著增加CD14+和CD34+白細胞中的端粒酶活性。為了分離胎兒有核紅細胞，第一步去除CD45+細胞，第二步從CD45-細胞中分離出CD71+有核紅細胞［35］。從成人骨骼肌中分離靜止肌肉衛(wèi)星細胞［36］，分選小鼠肝臟樣本中的肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和枯否細胞［37］。

2.2 自動化細胞分選

自動化細胞分選是指將細胞分選的過程機械化，通過計算機控制實現(xiàn)自動細胞標記和細胞分選。全自動磁性細胞分選儀可以從全血、PBMC、骨髓和游離組織中分選出目標細胞，通過陽性分選、陰性分選和去除分選的方式獲得高得率、高純度、高活率的目標細胞，如T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞、單核細胞等免疫細胞，以及干細胞、腫瘤細胞等。全自動磁性細胞分選儀有分選柱模式如德國美天旎公司的autoMACS Pro Separator和無柱模式如加拿大STEMCELL公司的RoboSep-S和RoboSep-16。全自動磁性細胞分選儀預設有多種常用的分選程序，經(jīng)過全自動的細胞標記和細胞分選技術，只需手動將待分選的樣本放入分選儀，根據(jù)樣本類型、目標細胞占總細胞的比率和目標細胞表面抗原表達的強弱選擇合適的分選程序，加入合適的分選試劑，即可在數(shù)分鐘后得到目標細胞組分和不含目標細胞的組分。全自動磁性細胞分選儀可以同時處理多個樣本，如autoMACS Pro Separator可以同時分選6個樣本，RoboSep-S可以同時分選4個樣本，RoboSep-16可以同時分選16個樣本，分選速度可達到每秒107個細胞。

Strauss等［38］在研究免疫抑制劑雷帕霉素促進CD4+ CD25+ FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞的擴增的過程中，使用全自動磁性細胞分選儀從正常對照組（n=21）的PBMC中分離出了CD4+ CD25+和CD4+CD25- T細胞。Letzkus等［39］使用全自動磁性細胞分選儀富集8種靶細胞，包括CD14+單核細胞、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD15+粒細胞、CD19+ B細胞、CD56+ NK細胞，然后對這8種細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析，這些直接從全血分離的免疫細胞亞群的轉(zhuǎn)錄組學信息可以整合到臨床試驗中。

2.3 磁性細胞分選技術的應用

磁性細胞分選在生物學和生物醫(yī)學方面有著廣泛的應用。磁性細胞分離人外周血中的稀有細胞可以為臨床診斷提供依據(jù)，分離并擴增特定細胞能輔助臨床細胞治療，但這一過程的標準化應用還任重道遠。盡管目前磁性細胞分選技術已經(jīng)相當成熟，但是在分選一些不太常見的細胞方面，仍需要進行大量的方法驗證才能應用于臨床，并且磁性細胞分選是一種有標記的分選，在需要進行無標記分選時，磁性細胞分選就出現(xiàn)了短板。當目標細胞的標志物為弱表達標志物或者表達于胞內(nèi)時，則需要足夠量的磁性顆粒標記兼具穿透細胞膜或核膜的功能，而目前尚沒有很好的方法來達到這一目的。因此磁性細胞分選還有有待改善的地方，以及開發(fā)出其他分選方法以進行補充。

雖然磁性細胞分選能夠提高目標細胞的得率和純度，但當需要涉及到多個標志物才能達到分選目的的時候，就必須按標志物在細胞中的表達強弱和表達量來來進行順序分選，這樣會延長分選時間［40］。磁性細胞分選也可能影響目標細胞的特性，如經(jīng)過磁性細胞分選后的嗜酸性粒細胞向白三烯和血小板活化因子遷移較少或者沒有遷移［41］，細胞暴露于鐵磁性基質(zhì)和磁場中也會改變細胞膜完整性［42］。

磁性細胞分選發(fā)展到今天，已經(jīng)出現(xiàn)了多種基于磁性細胞分選的新技術，例如：親和珠介導的細胞聲分離（圖3a）［43］；利用梯度間距的磁性軟微柱陣列上的強力磁棘輪效應的定量磁分離儀器（圖3b），突破了傳統(tǒng)的定性分離概念，突出了其在定量分離領域的潛力［44］；芯片中嵌入兩級磁分離的飛越式微流控芯片技術［45］。磁珠表面的修飾材料也有了重大創(chuàng)新：N-（磷甲基）亞氨基二乙酸作為磁性納米粒子表面接枝用來分選高純度人CD4+ T細胞［46］；通過順序連接的抗體和納米顆粒進行磁擴增，實現(xiàn)了細胞表面和細胞內(nèi)標志物的標記的100倍放大，能夠有效分離稀有細胞亞群（圖3c）［47］；用表面修飾了卷曲螺旋肽的磁珠分選轉(zhuǎn)基因細胞（圖3d）［48］。無論是通過改變磁場來改變磁泳方式或者通過改變磁性納米顆粒表面的修飾方法都是為了適應磁性細胞分選技術更廣泛的應用場景，使得分選的目標細胞純度更高，解決弱表達標志物不易被標記的難題等。表2總結(jié)了近5年比較有創(chuàng)新性的磁性細胞分選方法。

Table 2 Summary of innovative magnetic cell sorting methods表2 創(chuàng)新的磁性細胞分選方法匯總

Fig. 3 Four new techniques of magnetic cell sorting圖3 4種磁性細胞分選新技術

3 生物學評價

磁性細胞分選的目的是獲得純化單一的目標細胞，需要在盡可能短的時間內(nèi)完成分選過程，并且分選出的細胞不影響后續(xù)使用。無論經(jīng)過哪種磁性細胞分選方法分選得到的目標細胞，必定需要符合一定的要求才能用于后續(xù)的分析或功能試驗。

3.1 生物學評價參數(shù)

目前，對于經(jīng)磁性細胞分選得到的目標細胞的數(shù)量、活性和功能等方面沒有明確統(tǒng)一的要求，每個研究者都是基于各自試驗的需求進行獨立的研究，這就存在著多種多樣的評價指標被用于對目標細胞的評價。為了確立有效且普遍適用的評價指標，本文查閱了多篇論著和綜述后發(fā)現(xiàn)有許多與細胞相關的生物性能參數(shù)被提及，通過對比分析列舉如下幾種重要的參數(shù)。a. 在DNA合成方面，有研究表明，磁分選后的24 h內(nèi)細胞的DNA合成沒有改變［56］。b. 目標細胞增殖方面，從梗阻性無精癥和非梗阻性無精癥人群中磁分離得到的精原干細胞（spermatogonia stem cells，SSC）保持增殖活力（表3），SSC在體外增殖并保持其特征超過12代（＞6個月），且SSC特異性標志物GFRα-1和整合素α6陽性的細胞數(shù)量在第8代時增加到80%以上［57］。c. 目標細胞的功能方面，結(jié)合磁珠不影響細胞的活性和增殖［58］：用磁性細胞分選法從脂肪源性間質(zhì)血管部分培養(yǎng)細胞中分離出的CD105陽性細胞成功向軟骨細胞分化［59］；在針對K562、Daudi、U937和HL60靶細胞系的鉻釋放試驗中，經(jīng)磁性細胞分選得到的CD3+和CD3-免疫細胞均表現(xiàn)出了高度顯著的免疫細胞溶解活性［56］；從人胚胎體中磁分離血管細胞，經(jīng)過分化培養(yǎng)，有超過80%的血管細胞分化成內(nèi)皮樣或平滑肌樣細胞［60］；經(jīng)磁性細胞分選的細胞保持了小膠質(zhì)細胞特異性（TMEM119/Small1）和巨噬細胞特異性（Ccr2/CD69）標記的表達，保持吞噬能力，對脂多糖刺激做出反應，并吞噬熒光乳膠珠［61］；分離的人CD34+造血干細胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)具有重新繁殖的活性［62］。d. 目標細胞得率、純度、活率方面，流式細胞術和臺盼藍染色法檢測表明，磁性細胞分選法分離各類細胞的得率、純度、活性如下：CD4+淋巴細胞平均得率為（56±15）%，純度為（96±3）%，活率為（97±3）%［43］；人造血干細胞和祖細胞得率為（77.5±22.6）%，純度為（87.8±2.4）%［62］；CD4+ CD25+ Treg細胞純度為（91.2±6.2）%［63］。e. 細胞的光散射特性、熒光抗體標記能力方面，Miltenyi等［58］的研究表明，結(jié)合了磁珠的細胞不會改變細胞的光散射和熒光參數(shù)。f. 細胞毒性方面，Di Corato等［64］基于MTT細胞毒性試驗表明，磁珠濃度與細胞毒性正相關，當磁珠濃度相當于16 mg/L鐵濃度時，磁珠對人口腔表皮樣癌細胞毒性小于20%，當65 mg/L時則達到40%。

Table 3 Isolation and viability of cultured spermatogonial stem cells［57］表3 精原干細胞的分選和活力檢測［57］

綜上所述，磁性細胞分選技術分選獲得的目標細胞被廣泛應用于生命活動的研究，所以好的磁性細胞分選產(chǎn)品必須保證目標細胞的無菌、高得率、高純度、高活率。同時，分選產(chǎn)品不能對細胞產(chǎn)生毒性，不能改變細胞形態(tài)，不能使細胞活化，不影響細胞自身的增殖功能。為了能夠?qū)δ繕思毎M行流式分析或者分選，分選產(chǎn)品和分選步驟必須不改變目標細胞的光散射特性，且分選后的目標細胞必須具有一定的熒光抗體標記能力以便對細胞進行標志物的標記。因此，對磁性細胞分選產(chǎn)品進行生物學評價的指標應包含：得率、純度、無菌、細胞毒性、細胞形態(tài)、活率、細胞的光散射特性、細胞的熒光抗體標記能力、細胞活化、細胞增殖。

3.2 生物學評價參數(shù)的檢測方法

對上述提出的十項參數(shù)進行檢測，通過不同產(chǎn)品的檢測結(jié)果之間的比對，磁性細胞分選廠家可以查漏補缺對自有產(chǎn)品進行改良，磁性細胞分選的使用者可以通過對比選擇更加適合自己試驗的產(chǎn)品。研發(fā)機構和高校科研團隊可以通過這十項參數(shù)的比對發(fā)現(xiàn)磁性細胞分選的短板及亟待解決的問題，對新產(chǎn)品進行生物學評價來評估新產(chǎn)品的優(yōu)劣。

以下列舉適用于上述提出的十項生物學評價參數(shù)的檢測方法。

3.2.1 得率

磁性細胞分選的得率受兩方面的影響：a. 分選過程中細胞的損失；b. 由于細胞損傷或磁性細胞分選產(chǎn)品自身的因素導致的磁珠標記效率下降。只有選擇最優(yōu)的磁珠材料和大小，合適的抗體，最優(yōu)的分選步驟才能獲得較高的得率。計算目標細胞得率則可判斷磁性細胞分選試劑盒的優(yōu)劣。計數(shù)分選前細胞總數(shù)和分選后細胞總數(shù)，用能夠特異性識別目標細胞的抗體對分選前的總細胞進行標記，采用流式細胞術檢測分選前目標細胞占分選前細胞總數(shù)的比例，分選后的總細胞數(shù)占分選前目標細胞總數(shù)的比例記為目標細胞的得率。

3.2.2 純度

磁性細胞分選的純度受到目標細胞表面抗原與抗體結(jié)合的特異性的影響。陽性細胞分選的純度一般高于陰性細胞分選。陽性細胞分選是直接針對目標細胞進行特異性標記，而陰性細胞分選是去除掉不需要的細胞。陰性細胞分選在抗體設計方面會受到當前對細胞群的認知的限制，有可能會出現(xiàn)去除的細胞種類不夠多不夠全，且特異性結(jié)合非目標細胞的結(jié)合率不可能達到100%，也就不可能100%去除非目標細胞，所以陰性細胞分選的純度較低。若細胞純度太低，則無法用于后續(xù)試驗，一般磁性細胞分選的純度可達90%以上。用能夠特異性識別目標細胞的抗體對分選后的總細胞進行標記，采用流式細胞術檢測目標細胞占分選后總細胞數(shù)的比例記為目標細胞的純度。流式細胞術檢測表明（圖4a），分選前CD19+ B細胞數(shù)量占總淋巴細胞數(shù)量的0.068%（中），分選后CD19+ B細胞純度達到99.3%（右）［65］。

Fig. 4 Biological evaluation of magnetic cell sorting technology圖4 磁性細胞分選技術的生物學評價

3.2.3 無菌

若經(jīng)磁性細胞分選出來的細胞后續(xù)需要用于繼續(xù)培養(yǎng)，分選出來的細胞則必須無菌，磁性細胞分選試劑盒以及分選步驟均不能有細菌或真菌污染。分選步驟中發(fā)生污染與試劑盒本身無關。判斷試劑盒是否合格，則只需檢測試劑盒本身成分是否無菌。取適量待檢試劑加入無菌微生物培養(yǎng)皿中，分別在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d以判斷待檢試劑是否含有細菌，在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~7 d以判斷待檢試劑是否含有真菌。

3.2.4 細胞毒性

細胞毒性是指用于磁性細胞分選的材料在接觸含有目標細胞的細胞群后會對細胞的生長造成影響，而不管分選出來的細胞是用于分析還是后續(xù)進一步功能試驗，磁性細胞分選的材料都必須對目標細胞沒有細胞毒性。將磁性分選材料按照一定的浸提比例浸沒在依格爾最低限量基本培養(yǎng)基MEM中浸提24 h，用浸提液培養(yǎng)小鼠成纖維細胞L929，培養(yǎng)24 h后用MTT法或CCK-8（cell counting kit-8）法檢測細胞存活率，以判斷磁性分選材料對目標細胞有無細胞毒性。

3.2.5 細胞形態(tài)

磁性細胞分選是否對目標細胞造成了損傷，最直觀的表現(xiàn)就是細胞形態(tài)發(fā)生了改變。在顯微鏡下觀察細胞的基本形態(tài)并做記錄，觀察比較分選前后細胞形態(tài)的變化則可以用于判斷分選試劑和分選過程是否造成了細胞損傷。如若分選出的細胞有損傷則不宜進行后續(xù)的分析和功能試驗。圖4b為倒置顯微鏡下觀察到的結(jié)合了磁珠的CD45+白細胞的形態(tài)［52］。

3.2.6 活率

只有活細胞才能進行較好的抗體標記才能發(fā)揮細胞本身的功能，因此磁性細分選后得到的細胞必須有較高的活率。使用臺盼藍法檢測分選后活細胞數(shù)目占總細胞數(shù)目的百分比則可得出細胞活率。

3.2.7 細胞的光散射特性

目前細胞分選主要集中在血細胞、干細胞和腫瘤細胞，流式細胞檢測是這些細胞分析過程中常用的檢測方法。而流式細胞儀檢測的最基本指標包括前向角散射光（forward scatter）和側(cè)向角散射光（side scatter），因此當分選后的目標細胞需要進行流式試驗時，則其細胞的光散射特性就不能發(fā)生改變。在流式細胞儀上用同樣的電壓和設門能圈出分選前和分選后的目標細胞群，則可以證明磁性細胞分選沒有改變細胞的光散射特性。

3.2.8 細胞的熒光抗體標記能力

磁性分選過程中的抗體標記會占據(jù)細胞表面一定數(shù)量的抗原表位，該過程中的抗體標記過少會降低分選細胞的純度，過多則會影響分選后的細胞進行后續(xù)分析試驗時熒光抗體的標記。將經(jīng)分選得到的目標細胞與不同濃度的熒光抗體共孵育，再通過流式細胞術檢測細胞表面標記的熒光抗體量即可體現(xiàn)細胞的熒光抗體標記能力。

3.2.9 細胞活化

分選出來的細胞一般需要保持細胞原有的活性，需要確保細胞的表型沒有被改變或激活，因此需要檢測分選后的細胞是否被活化。不同細胞有不同的活化指標，通過流式細胞術檢測分選后的細胞的活化指標即可判斷經(jīng)過分選的細胞是否被活化。

3.2.10 細胞增殖

分選得到的目標細胞如果要用于增殖相關試驗，則分選試劑和分選步驟不能改變細胞的增殖活性。對于具有增殖活性的目標細胞只需用CCK-8法或CFSE（carboxyfluorescein succinimidyl ester）法檢測其第0、1、2、3、4天的生長曲線即可判斷其增殖情況。對于不能增殖的細胞如淋巴細胞則需在培養(yǎng)過程中添加促分裂劑和抗原物質(zhì)，使細胞重新進入分裂狀態(tài)，檢測其0、12、24、36、48、72、96 h的生長曲線即可判斷其增殖情況。使用CCK-8法檢測從磁珠上解離的SW480和對照組SW480的細胞增殖表明（圖4c），在7 d培養(yǎng)期間，解離后的SW480與對照組SW480的增殖率沒有顯著差異［50］。使用CFSE法檢測經(jīng)磁性分選和聲學分選后的CD4+ T細胞的細胞增殖表明（圖4d），聲學分選方法未對分選后的細胞的增殖產(chǎn)生明顯差異［43］。

4 總結(jié)與展望

磁性細胞分選技術在生命科學研究和臨床研究中有著極其重要的地位。磁性細胞分選產(chǎn)品主要由磁珠、磁力架、分離柱或分離試管組成，不同試劑盒的組件不同，分選出的細胞也就不同?，F(xiàn)各大生產(chǎn)商對各自的產(chǎn)品有著不同的評價標準，各有傾向，一般均為盡可能展現(xiàn)各自產(chǎn)品優(yōu)點。目前由于國內(nèi)外缺乏全面且一致的評價標準，磁性細胞分選產(chǎn)品的使用者對國外產(chǎn)品盲目信賴，導致國內(nèi)雖然有很多廠家在生產(chǎn)磁性細胞分選產(chǎn)品，但卻鮮有知名品牌，這一態(tài)勢不利于中國相關試劑行業(yè)的發(fā)展。制定磁性細胞分選產(chǎn)品的性能檢測方法有助于對各種產(chǎn)品進行統(tǒng)一檢測統(tǒng)一評價，只有在能夠有效地區(qū)分各大產(chǎn)品的優(yōu)缺點的基礎上，才能有的放矢地進行產(chǎn)品改造和新產(chǎn)品的研發(fā)，打破壟斷，促進我國自主知識產(chǎn)權磁性細胞分選產(chǎn)品的產(chǎn)出和應用，因此亟需找出磁性細胞分選評價的關鍵性能指標并建立相關檢測方法。

綜上所述，磁性細胞分選技術因其應用的廣泛性、分選方式的多樣性和幾乎對分選細胞沒有影響的特性而不可替代，而一個性能良好的磁性細胞分選產(chǎn)品必須對其關鍵生物性能參數(shù)進行分析與評價。隨著科技的進步與飛速發(fā)展，磁性細胞分選技術將會出現(xiàn)更多的新技術和新應用服務于社會服務于人類。